专利名称：评价致病两期细菌的毒力的方法
技术领域：
本发明涉及用于测定环境系统中的致病两期细菌(biphasicbacteria)的方法， 更准确地说，涉及用于评价环境系统中的致病两期细菌的毒力的方法。
背景技术：
在水、食物、健康保健或制药行业的环境或临床样品中致病细菌的存在可能引起 严重的健康顾虑。评价致病细菌以确定其毒力对评价这些样品的相对风险十分关键。可 以采用常规测定法，例如基于培养的方法或基于杂交的方法，来测定微生物病原体的浓度。 然而，基于培养的方法需要漫长的孵育时间，而且该方法容易产生错误结果，因为野外样品 (field sample)可能干扰该方法。同样，用基于杂交的方法很难精确地检测低水平的致病 细菌。更重要的是，两种方法的输出结果仅仅是细菌浓度，而非是公众和业界更加关注的致 病毒力。因此，存在对用于快速准确地测定两期致病细菌的相对毒力并提供低水平检测的 改进方法和系统的需要。发明概述在一个实施方案中，用于评价环境系统中的两期细菌的相对致病毒力的方法包括 测定细菌的DNA浓度、测定细菌的RNA浓度、求出RNA浓度与DNA浓度的比率并将浓度比与 相对致病性水平相关联。各个实施方案提供在早期发作当病原体处于低浓度时用于检测和测定两期致病 细菌相对毒力的快速、准确和低成本方法。附图简述
图1图示嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的平板计数。该曲线图是CFU/ ml的对数与时间(小时)的函数。图2图示通过实时PCR测定的嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)的DNA拷贝 数。该曲线图是DNA(GU)的对数与时间(小时)的函数。图3图示通过实时TMA测定的嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)的rRNA拷 贝数。该曲线图是rRNA拷贝数的对数与时间(小时)的函数。图4图示嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的rRNA/DNA的比率。该曲线图 是rRNA/DNA比率的对数与嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)生长期(Lpn期)的函数。发明详述单数形式包括复数对象，除非文中有明确规定。陈述同一特征的所有范围的端点 可独立组合并包括所述端点。所有参考文献都通过引用结合到本文中。与数量联用的修饰语“约/大约”包括所述值并具有文中规定的含意(例如包括 与特定数量测量值有关的公差范围)。“任选的”或“任选”是指随后描述的事件或情况可能发生或者可能不发生，或者随 后指定的材料可能存在或可能不存在，且该描述包括其中事件或情况发生或者其中材料存 在的情形，以及其中事件或情况不发生或者材料不存在的情形。
在一个实施方案中，用于评价环境系统中的两期细菌的相对致病毒力的方法包括 测定细菌的DNA浓度、测定细菌的RNA浓度、求出RNA浓度与DNA浓度的比率并将浓度比与 相对致病性水平相关联。
环境系统中的致病两期细菌可能引起健康问题。这些病原体已产生对付不同环境 应激条件的特殊策略。细菌经历4个不同的时期。起始期为延迟期，其中细菌成熟，但不能 分裂。指数期是其中细胞繁殖的时期。在进入宿主细胞时，基因表达将改变以允许增殖。当 环境中有大量营养物时，细菌停留在指数期。当营养物变得有限或开始缺乏时，细菌开始转 入静止期(亦称后指数期)，其中生长速率接近或等于死亡速率。在静止期间，病原体从代 谢转变到提高感染性。当进入宿主细胞时，基因表达将改变以允许增殖。静止期是最强毒 力期，因为它允许细菌加强感染。在静止期后是死亡期，其中营养物耗尽，细菌死亡。细菌群可以是单一生长期的单一物类，或不同生长期的混合群，或4个时期的任 何组合。在实验室生长培养物中也观察到这4个时期。两期致病细菌是可以转变其代谢过程并改变其细胞表达和胞外活性使得病原体 寻找可以提供复制的基本生长条件的宿主的任何病原体类型。在一个实施方案中，两期致 病细菌包括但不限于嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或李其j 特菌属(Lysteria)。环境系统可以是其中两期致病细菌可侵入的任何类型的环境。在一个实施方案 中，环境系统可以是液体、固体或空气。在一个实施方案中，环境系统可以是土壤、含有可携 带致病细菌的宿主细胞的雾化流体或水性介质。在一个实施方案中，水性介质可以是水、血 液、尿液、痰、体液或前述的任何组合。在另一个实施方案中，液体介质可以是冷却塔水、废 水或者从水、食品、医疗保健或制药行业得到的其它工业液体。可用任何合适的方法测定两期细菌的DNA浓度。在一个实施方案中，可以通过对 从两期细菌提取的DNA进行实时聚合酶链式反应(PCR)来测定DNA浓度。在另一个实施方 案中，可以使用巨噬细胞感染性增强蛋白(mip)基因靶向引物、探针和热稳定酶对从两期 细菌提取的DNA进行实时PCR来测定DNA浓度。使用引物和热稳定酶按指数扩增DNA以用于测定。引物为短的DNA片段，其与待 测定的DNA相匹配，热稳定酶将引物装配到新的DNA链上。热稳定酶可以是Taq聚合酶，例 如Taqman 探针。探针含有DNA模板和荧光标记。DNA模板是底物上的特异性DNA序列，允许探针 只靶向或测定与DNA模板匹配的DNA。将荧光标记与DNA连接以检测扩增的DNA。荧光标 记可以是在DNA存在时改变其荧光信号的任何类型的荧光染料或指示剂。在一个实施方案 中，荧光染料是荧光染料或荧光团，其是与核酸结合的微生物染料。在一个实施方案中，荧 光团可以是5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。可通过任何类型的荧光检测器检测荧光。在一个实施方案中，荧光信号通过荧光 光谱法、荧光显微镜检术、荧光二极管阵列检测、微量培养板荧光读数或流式细胞术测定。可用任何合适的方法测定两期细菌的RNA浓度。选定的RNA可以是信使RNA (mRNA) 或核糖体RNA(rRNA)。在一个实施方案中，RNA可从两期细菌中提取，并通过包括但不限于 以下的方法测定RNA印迹法、核糖核酸酶保护测定、原位杂交、实时转录介导的扩增(TMA) 或反转录酶聚合酶(reverse transcriptase polymerase)链式反应。RNA印迹法应用根据大小分离RNA样品的电泳和与靶RNA序列的至少一部分互补的杂交探针以检测RNA。杂 交信号用X光片检测，并通过光密度测定法定量。原位杂交采用含有互补RNA链以检测靶 RNA的标记探针。可通过测定荧光、射线照相法或免疫组织化学来定量测定RNA。在反转录 聚合酶链式反应中，使用反转录酶将RNA链反转录至其DNA互补链中，使所得到的互补DNA 扩增，并采用如上所述的实时PCR进行测定。TMA是核酸扩增试验，可通过商业途径购自 Gen—Probe， Inc0可通过任何合适的方法提取两期细菌细胞的核酸(DNA和RNA)，在一个实施方案 中，可通过裂解细胞来提取致病细胞的核酸。可采用机械、化学、物理、电学、超声或微波方 法或这些方法的任何组合进行裂解。机械裂解物理性地破坏细胞屏障，例如通过剪切、振动或外力。机械方法的实例包 括但不限于压力驱动细胞流过过滤器样结构或流体通道中的小规模挡板(bar)、用快速扩 散混合的低离子强度水渗透性地给细胞施压、在进入具有尖窄的小规模结构的特定区域的 同时使细胞遭受剪切力、用微珠打珠机或珠磨机破坏细胞屏障或者向水性介质中的细胞施 加超声能。当使用化学试剂破坏细胞屏障并使胞内内含物释放出来时便会发生化学裂解。可 以使用可破坏细胞屏障的任何化学试剂。在一个实施方案中，可以使用洗涤剂、酶、抽提 溶剂或裂解缓冲液。洗涤剂包括但不限于十二烷基硫酸盐、3_[ (3-胆酰氨基丙基)二甲 基氨基(amm0ni0)]-l-丙磺酸、TWEEN 20洗涤剂、TRITON X系列洗涤剂、胆酸钠、脱氧 胆酸钠、氯化孤。酶包括但不限于溶菌酶、变溶菌素、labiase、溶葡萄球菌素、溶细胞酶、 蛋白酶K、内溶素或消色肽酶。抽提溶剂包括但不限于聚乙烯聚吡咯烷酮、苯酚、三氯三氟 乙烷或苯酚和硫氰酸孤或氯化孤的混合物。裂解缓冲液包括但不限于氯化铵、季铵化合 物、十六烷基三甲基溴化铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、六偏磷酸盐、焦磷酸 钠、Swab Transfer Medium(STM)(—种可通过商业途径购自Gen-Probe、Inc.的裂解溶 液)、Zap-o-globin ( —种可通过商业途径购自Coulter Diagnostics的裂解缓冲液)或 CyQUANT 细胞裂解缓冲液(可通过商业途径购自MolecularProbes)。试剂可以任何适于裂解微生物物质的量加入，并且可以过量加入。在一个实施方 案中，以约Iml-约10，OOOml/毫升水性介质的量加入试剂。在另一个实施方案中，以约 Iml-约1000ml/毫升水性介质的量加入试剂。在另一个实施方案中，以约Iml-约50ml/毫 升水性介质的量加入试剂。物理裂解可以热的方式或通过冻融而发生。通过例如用加热块或加热板加热水性 介质而以热的方式完成细胞裂解。在一个实施方案中，将水性介质加热至约40°C-约100°C 的温度。在另一个实施方案中，温度为约40°C -约60°C。在一个实施方案中，将水性介质 加热约1分钟_约1小时。在另一个实施方案中，将水性介质加热约1分钟_约30分钟， 包括约1分钟_约15分钟，在另一个实施方案中，将水性介质加热约1分钟_约3分钟。在冻融的一个实例中，将水性介质例如在乙醇_干冰浴冻结，然后融化。 可以通过扩散混合和介电泳捕集(dielectrophoretic trapping)或通过微波辐 射，用一系列的电脉冲以电的方式裂解细胞。自由基也可用于细胞裂解。该方法包括将电 场应用于水性介质中的金属离子、过氧化物和微生物物质的混合物中以产生可攻击细胞屏 障的自由基。
在一个实施方案中，可以纯化由细胞裂解物中提取的核酸以得到特定的靶DNA和 特定的靶RNA。在一个实施方案中，可经化学沉淀与溶解、磁珠或与树脂的亲和力通过非特 异性吸附或者通过与互补引物连接，来纯化核酸。在一个实施方案中，在化学沉淀期间，可 将溶剂加入细胞裂解物中以制备溶液，并可将沉淀溶剂与提取的核酸混合以沉淀出特定的 靶核酸后，随溶剂一起除去杂质。在一个实施方案中，沉淀溶剂包括但不限于乙醇和异丙 醇。在溶解期间，加入溶解溶剂以重新溶解沉淀后的核酸。水溶性杂质在溶解溶剂中溶解 有限，并且不会重新溶解。溶解溶剂可包括氯化锂、氯化孤或醇与一价阳离子的组合。
在另一个实施方案中，可以用磁珠通过结合-洗涤-洗脱步骤对核酸进行纯 化。在一个实施方案中，磁珠可以是可通过商业途径购自Promega Corporation的
Promega MagneSil Red 或可通过商业途径购自 Seradyn Inc 的;Seradyn 珠。在互补引物方法中与树脂的亲和力中，使用DNA模板来选择靶DNA。DNA模板是底 物上的互补寡核苷酸序列。在一个实施方案中，提取的核酸的纯化可以是自动化的。在另一个实施方案中，可 以使用可通过商业途径购自Thermo ElectronCorporation的KingFisher 仪器进行自动纯化。求出RNA浓度与DNA浓度的比率。该比率表明两期细菌存在于特定生长期的可能 性，并提供用于评价致病细菌的相对毒力的参数。两期细菌含有处于延迟期、指数生长期 (其中细胞类似于发生改变以允许增殖的细胞内细胞)和后指数期(其中细胞类似于细胞 外细胞并具有增强的毒力)的细胞。可将RNA与DNA的浓度比等同于相对致病性水平。在一个实施方案中，通过将该 浓度比与参比曲线相比较，将该浓度比等同于相对致病性水平。在一个实施方案中，可绘制 各个目标病原体的参比曲线。在另一个实施方案中，通过监测整个不同生长期的DNA和RNA 浓度来绘制参比曲线。在一个实施方案中，采用基于培养的平板计数方法来测定病原体的 生长期。为了本领域技术人员可更好地实施本申请的公开内容，以举例方式而非限制方式 给出下列实施例。
实施例实施例1绘制用于测定嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的毒力的参比曲线。从之前繁殖的培养基板中取出3-5个嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)菌 落，在液体培养基生长48-72小时，加至40ml新鲜灭菌的液体培养基以制成样品。将样品 于36°C振荡(175rpm)24小时。以1 40体积比将嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)样品加入另一新鲜灭 菌的液体培养基中以制备参比样品。将样品于36°C振荡(175rpm)24小时。在以下不同的时间点测定参比样品以确定嗜肺军团菌(Legionel lapneumophi la) 的各生长期及DNA和RNA的浓度1. 5小时(为延迟期)、6小时、9小时(为指数期)、26小 时、28小时、30小时、32小时、34小时、48小时、51. 5小时、73. 5小时和77小时(为后指数期)。在各个时间点进行平板计数试验以测定嗜肺军团菌(Legionellapneumophila) 的生长期。采用遵循测试标准AFNOR 90-431或IS011731的标准平板计数方法。在各个时 间点进行3次重复，结果为3次重复的平均值。平板计数试验用大约10天完成，数据见图1。在各时间点进行实时PCR和实时转录介导的扩增(TMA)试验以分别测定嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)的DNA和RNA浓度。最初，从嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)提取细胞核材料。每次取出Iml的起始样品，在离心机中以3000g离心2分 钟。取出上清液后弃去。加入Iml无菌page盐(0.012% (w/v)氯化钠、0. 0004% (w/v)硫 酸镁五水合物、0.0004% (w/v)氯化钙脱水物、0.0. 142% (w/v)磷酸氢二钠、0. 0136% (w/ ν)磷酸二氢钾(136mg/L))使样品重新悬浮。取出100μ 1重新悬浮的样品，用3ml化学裂 解缓冲液STM裂解至少3小时。实时PCR试验采用珠粒型DNA纯化方法。500 μ 1裂解物用Promega MagneSil Red(可通过商业途径购自Promega Corporation)纯化。引物(mip6和mip8)扩增mip基 因的ι ο-bp片段，扩增用TaqMan 探针TQ-mip (用5 ‘ -fam/3 ‘ -tamra标记)检测。数 据见图2。实时TMA试验是基于转录的检测RNA的方法。将500 μ 1裂解物用Seradyn 珠粒 纯化，使嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) 23SrRNA的区域扩增。扩增产物用5-羧基 四甲基罗丹明(TAMRA)荧光团标记的火炬型(torch)探针检测。数据见图3。在得到所有结果后进行数据分析。rRNA/DNA比率=用TMA测定的rRNA拷贝数/用实时PCR测定的DNA基因组单位 (genomic unit, GU)。rRNA拷贝/CFU =用TMA测定的rRNA拷贝数/用平板计数方法测定的菌落形成单 位(CFU)。指数期的平均RNA/DNA比率为22，542，静止期的平均值为6685。参比曲线用该数 据绘制并见图4。基于靶RNA/DNA比率的方法鉴定出特定的两期病原体生长期，并在3小时以内评 价其相对毒力。实施例2通过过滤型浓缩(filtration-based concentration)从不同的50ml冷却塔 水样品中获得浮游的嗜肺军团菌细胞(Legionella pneumophila)。将样品通过聚醚砜 (PES) 0. 45 μ m膜过滤。将细胞在该膜上用3ml化学裂解缓冲液STM裂解过夜，将裂解物通 过PES 0. 22 μ m膜过滤除去细胞碎片。按照实施例1所述方法定量测定裂解物中的DNA和rRNA。如表1所示，这些野外样品的大部分的rRNA/DNA比率所在范围为300-9000，这表 明嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的生长期为后指数期。表 权利要求
1.一种用于评价环境系统中的两期细菌的相对细菌毒力的方法，所述方法包括测定细 菌的DNA浓度、测定细菌的RNA浓度、求出RNA的浓度与DNA的浓度比率并将RNA与DNA之 比与相对致病性水平相关联。
2.权利要求1的方法，其中所述两期致病细菌选自嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口李斯特菌属(Lysteria)。
3.权利要求1的方法，其中所述环境系统是液体、固体或空气。
4.权利要求3的方法，其中所述环境系统选自土壤、雾化流体和水性介质。
5.权利要求4的方法，其中所述水性介质选自水、废水、血液、尿液、痰、体液和前述的 任何组合。
6.权利要求1的方法，其中对从两期细菌中提取的DNA进行实时聚合酶链式反应以测 定DNA浓度。
7.权利要求6的方法，其中所述实时聚合酶链式反应使用巨噬细胞感染性增强蛋白 (mip)基因靶向引物、探针和热稳定酶。
8.权利要求7的方法，其中所述探针含有DNA模板和荧光标记。
9.权利要求8的方法，其中所述荧光标记是荧光染料或荧光团。
10.权利要求8的方法，其中通过选自以下的荧光检测法来测定所述荧光标记的荧光 信号荧光光谱法、荧光显微镜检术、荧光二极管阵列检测、微量培养板荧光读数和流式细 胞术。
11.权利要求1的方法，其中通过选自以下的方法来测定从两期细菌中提取的RNA的 RNA浓度RNA印迹法、核糖核酸酶保护测定、原位杂交、实时转录介导的扩增和反转录酶聚 合酶链式反应。
12.权利要求6的方法，其中所述DNA通过裂解细胞而从两期细菌中提取。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞通过选自以下的裂解方法裂解机械、化学、物 理、电学、超声、微波方法和前述方法的任何组合。
14.权利要求13的方法，其中对所述提取的DNA进行纯化以得到特定的靶DNA。
15.权利要求14的方法，其中所述提取的DNA通过选自以下的方法纯化化学沉淀与 溶解、磁珠和与树脂的亲和力。
16.权利要求11的方法，其中所述RNA通过裂解细胞而从两期细菌中提取。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞通过选自以下的裂解方法裂解机械、化学、物 理、电学、超声、微波方法和前述方法的任何组合。
18.权利要求11的方法，其中对所述提取的RNA进行纯化以得到特定的靶RNA。
19.权利要求18的方法，其中所述提取的RNA通过选自以下的方法纯化化学沉淀与 溶解、磁珠和与树脂的亲和力。
20.权利要求1的方法，其中通过将所述比率与参比曲线相比较而使所述比率等同于 相对致病性水平。
21.权利要求20的方法，其中通过用基于培养的平板计数方法在整个不同的生长期监 测DNA和RNA的浓度而绘制所述参比曲线。
全文摘要
一种用于评价环境系统中两期细菌的相对细菌毒力的方法，所述方法包括测定细菌的DNA浓度、测定细菌的RNA浓度、求出RNA浓度与DNA浓度的比率并将浓度比与相对致病性水平相关联，其中所述细菌优选为嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和李斯特菌属(Lysteria)。
文档编号C12Q1/68GK102105602SQ200980130497
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月29日 优先权日2008年7月30日
发明者K·杨, S·M·博伊特, 徐韡卿, 李洁, 陈静 申请人:通用电气公司