专利名称：优化使用Abl酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓细胞样白血病的方法
优化使用Abl酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓细胞样白血病
的方法本发明涉及治疗人类患者人群中慢性髓细胞样白血病(CML)的方法。甲磺酸伊马替尼已被报道成功用于治疗大多数慢性期CML患者。然而，对于效果较差患者的改善治疗需要对治疗应答的关键决定因素的详细了解。SHP-I和SHP-2是两种含Src同源区2 (SH2)结构域的酪氨酸磷酸酶，对于细胞生长调节信号转导具有某些病理学关联。它们具有显著的整体序列同一性。其生物学功能还未能详尽的阐述。通常认为SHP-I是阴性信号转导蛋白，而SHP-2是阳性的。已发现SHP-2 广泛地表达，而SHP-I在造血细胞中高表达，而在某些非造血细胞中低水平表达。SHP-I和SHP-2均被认为具有重要的病理学关联。即，SHP-I去磷酸化生长因子、细胞因子和抗原的受体，以及与这些受体相关的酪氨酸磷酸化蛋白。因此，其通常定义为阴性信号转导蛋白。在人类中，在天然杀伤细胞淋巴瘤和其他类型的淋巴瘤/白血病中观察到 SHP-I基因表达下降。SHP-I启动子的甲基化使恶性T淋巴瘤细胞中SHP-I表达下降。已发现SHP-I下降的表达水平与慢性髓细胞样白血病(CML)的进展有关。此外，已显示Sipl与 Bcr-Abl物理上相关，表明了它们的功能性相互作用。而且，Shpl的过表达阻断了 Bcr-Abl 的转化。SHP-2的激活突变引起努南综合征，一种常染色体显性疾病，其特征在于异常面部特征、成比例身材矮小症以及心脏疾病(常见肺动脉狭窄和肥厚性心肌病)。SHP-2的该功能获得性突变还与散发的青少年骨髓单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病有关。已知SHP-2是幽门螺旋杆菌CagA蛋白的细胞内靶点，该蛋白与胃炎和胃癌有关。功能性敲除小鼠的》ιρ-2基因导致妊娠中期胚胎的死亡。表达催化量的SHP-2无活性半胱氨酸-丝氨酸突变体的细胞以及衍生自敲除SHP-2的小鼠的细胞显示，由生长因子和细胞因子诱导的信号转导途径活化下降。SHP-2在血管紧张素II 信号转导中也具有作用，其突变可能导致心脏发育缺陷。已发现两种SHP-组成型非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2在Bcr-Abl的负调节中起作用，缺乏Sipl对CML转化可能是重要的。因此，本发明的一个目的是鉴定新的预后指标，以改善CML患者的起始评估和后续监测。本发明的另一个目的是确定CML治疗的患者群，尤其是通过评估治疗响应来确定。 本发明的又一个目的是改善CML的治疗成功率。本发明的另一个目的是预测CML患者主要分子响应(MMR)的达到情况。令人惊讶的，已发现不仅磷酸激酶，而且磷酸酶SHPl和SHP2可用作生物标记物。因此，一方面，本发明涉及SHPl和/或SHP2作为CML患者生物标记物的用途。优选地，本发明涉及SHPl作为CML患者生物标记物的用途。因此，SHPl和/或SHP2的水平可作为伊马替尼或其可药用盐的治疗效果的指标。定义本文所用“SHP1水平”定义为相对于Abl的水平，本文所用“SHP2水平”定义为相对于Abl的水平。意思是分别通过Q-PCR测定SHPl和SHP2的mRNA水平，并表示为与ABL的比例。可以指出，例如SHPl水平和SHP2水平的测定可根据取自骨髓或血液、优选外周血的样品分别进行测定。然而，为了清楚的定义，SHPl水平和SHP2水平优选分别从外周血样品中测定。下面描述了测定所述水平的方法。“样品”表示血液或骨髓样品，优选外周血样品。当用于本文和整个申请中，术语“约”是指在所述值-10%至+10%范围内变化的值。优选所述值-5%至+5%。术语“温血动物”优选表示人或人类患者。“患者”优选指人类患者。本文所用术语“Ima”是伊马替尼或其可药用盐的同义词，优选甲磺酸盐。CML患者的SHPl和/或SHP2水平可用于评价伊马替尼或其可药用盐的治疗量，以及使用尼罗替尼(Nilotinib)和/或达沙替尼(dasatinib)或其可药用盐对所述患者进行附加或替代性治疗。具体而言，低于3的SHPl水平指示伊马替尼或其可药用盐的治疗量升高，优选升高至CML患者所用标准剂量的至少150%。可使用尼罗替尼或达沙替尼或其可药用盐附加或替代伊马替尼进行治疗。在本发明的一个实施方案中，低SHPl水平低于3。在其他实施方案中，SHPl水平为0. 01-3。在其他实施方案中，SHPl水平的上限是3,2. 8,2. 6,2. 4,2. 2和2 ；SHPl水平的下限是0.01或0. 1。应当理解，本发明包括所有的上限和下限的组合。因此，本发明一方面涉及SHPl和/或SHP2作为CML患者的生物标记物测定伊马替尼或其可药用盐的治疗效果的用途。另一方面，本发明涉及测定SHPl和/或SHP2水平的体外方法，包括以下步骤
a)测定样品中的SHPl和/或SHP2的mRNA水平；b)测定 ABL 的 mRNA 水平；c)将SHPl和/或SHP2的mRNA水平相对于ABL标准化。优选地，SHPl水平例如通过体外方法测定。测定和标准化优选通过下述实验部分所述的方法进行。优选地，血液样品是外周血样品。本发明另一方面涉及上述体外方法在筛选CML患者以确定使用伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐进行适当治疗中的用途。本文中术语“适当治疗”表示获得更有效的CML治疗，尤其是在对伊马替尼响应较低的患者中。对伊马替尼或其可药用盐的较低响应表示SHPl水平低于3。“适当治疗”包括增加伊马替尼或其可药用盐的治疗量， 使用尼罗替尼或达沙替尼或其可药用盐进行附加治疗，或使用尼罗替尼或达沙替尼或其可药用盐替代伊马替尼治疗。本发明的另一方面涉及诊断试剂盒，包括a)用于测定样品中SHPl和/或SHP2的mRNA水平的工具；b)用于测定ABL的mRNA水平的工具；c)将SHPl和/或SHP2的mRNA水平相对于ABL标准化的工具。优选地，SHPl水平通过体外方法测定。测定和标准化优选通过下述实验部分所述的方法进行。优选地，血液样品是外周血样品。本发明的另一方面涉及伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐在治疗 SHPl水平低于约3的CML患者中的用途。
本发明的另一方面涉及伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐在制备治疗CML的药物中的用途，其中所述患者的SHPl水平低于约3。本发明的另一方面涉及治疗温血动物CML的方法，包括以下步骤(a)在治疗前测定CML患者血液中SHPl的水平，以及(b)对SHPl水平低于约3的CML患者施用日剂量的甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼，其中所述甲磺酸伊马替尼的日剂量至少是CML患者所用标准剂量的150%。因此，步骤b)包括增加伊马替尼或其可药用盐的治疗量，使用尼罗替尼或达沙替尼或其可药用盐的附加治疗，或使用尼罗替尼或达沙替尼或其可药用盐的治疗替代伊马替尼的治疗。达沙替尼的治疗量通常为IOOmg/天，尼罗替尼为SOOmg/天。本发明的另一方面涉及治疗人类患者的慢性髓细胞样白血病(CML)的方法，包括以下步骤(a)在治疗前测定CML患者血液中SHPl的表达水平，以及(b)对SHPl表达水平低于约3的CML患者施用日剂量的甲磺酸伊马替尼，其中所述甲磺酸伊马替尼的日剂量至少是CML患者所用标准剂量的150%。本发明的另一方面涉及用于包含伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐的药物的包装说明书，其特征在于含有针对SHPl水平低于约3的患者的使用说明。本发明在另一方面涉及治疗温血动物CML的方法，包括对具有较低SHP2的CML患者增加甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的日剂量的步骤。关于CML患者所用标准剂量的信息通常可从药物包装中所含的标签获得。在一个优选的实施方案中，所述甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的日剂量为CML患者所用标准剂量的150%、200%、250%或300%。例如，当CML患者的标准剂量为400mg时，具有较低SHPl的患者要施用的日剂量为约600至1200mg甲磺酸伊马替尼，例如600mg/天、800mg/天、IOOOmg/天或1200mg/天。在SHPl水平低于3的情况下，优选的甲磺酸伊马替尼量是600mg/天至1200mg/ 天。其他优选的下限是650mg/天、700mg/天、750mg/天、800mg/天和850mg/天。其他优选的上限是 1150mg/ 天、IlOOmg/ 天、1050mg/ 天、IOOOmg/ 天、950mg/ 天和 900mg/ 天。应当理解，本发明包括所述上限和下限的各个组合。在一个实施方案中，步骤(b)中甲磺酸伊马替尼的日剂量通过口服施用。伊马替尼已被一般性地和特别地公开于专利申请US 5521184，尤其是公开于实施例21中。其主题引入本申请作为参考。伊马替尼也可按照W003/066613中公开的方法制备。对于本发明的目的，伊马替尼优选以其单甲磺酸盐的形式应用。单甲磺酸伊马替尼可按照US 6，894，051中公开的方法制备，其主题引入本申请作为参考。还包含相应的多晶型物，例如晶体变型，其也被该专利公开。单甲磺酸伊马替尼可以以US 5，521，184、US 6，894，051 或 US2005_(^67125 描述的剂型施用。尼罗替尼例如公开于W02004005281，实施例92，其主题引入本申请作为参考。达沙替尼例如公开于WO 00/62778。SHPl和/或SHP2水平的检测
5
可通过本领域的标准方法完成从CML患者收集血液样品。Q-PCR操作如下从患者样品或细胞系中提取的1微克总RNA在70°C预热10分钟；所述RNA溶液随后在20 μ L反应混合物中在25°C温育10分钟，42°C温育45分钟，99°C温育3分钟，所述混合物含有 IOmM Tris-HCl (pH 8. 3)，50mM KCl, 5. 5mM MgCl2, ImM 各种脱氧核糖核酸,20U RNAsin (Pharmacia，Upsal￡i，ig||)，25mM ^liil弓 L (Pharmacia), IOmM of DTT (Pharmacia), 以及IOOU MoMLV逆转录酶anvitrogen公司)。编码SHP-I和SHP-2的cDNA的PCR扩增在由 IXMaster Mix (Applied BioSystem, Foster City, CA USA)、300nM 适当引物对和 200nM 适当探针组成的最终体积为25 μ L的反应混合物中分别进行，使用下列时间/温度参数 95°C，lk，和60°C，1分钟，50个循环。所有扩增反应一式三份地进行。引物和探针序列如下SHPl :139bp ；正向CGAGGTGTCCACGGTAGCTT，反向CCCCTCCATACAGGTCATAGAAAT，探针 Fam-TGACCCATATTCGGATCCAGAACTCAGG-Tamra ；SHP2 :89bp ；正向GCGACAACTGCACGGATCT，反向CAGCGTCACAGCCCCTAAG，探针Fam-CTCGCACTGGGAATCCCCTCCAT_Tamra。ABL :123bp ；正向TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT，反向GATGTAGTTGCTTGGGACCCA，探针Fam-CCATT TTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-Tamra。ABL 用作内部对照。SHPl 和 SHP^nRNA 相对于 ABL 标准化。所有反应使用ABI-7900测序仪进行(Applied BioSystem)。临床研究在一项研究中，我们评价了两种SHP组成型非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I和 SHP-2在招入TOPS(酪氨酸激酶抑制剂优化和选择)试验的新近诊断的CML患者获得的白血病细胞中的表达水平。TOPS是一项前瞻性的开放标记的随机O 1)111期试验，在 CP-CML中比较了 Ima 800mg/d和400mg/d。该试验的终点是主要分子响应(MMR)率，其被一些报道用作预测对无进展存活(PH)有益的指标。我们的假设是当与12个月未达到MMR 的患者比较时，SHPl和SHP2的水平差异与达到MMR的患者有关。进入TOPS试验的48例新诊断的CML患者获得的最初结果显示，通过QPCR测定的以相对于ABL比例表示的所述患者外周血的SHPl和SHP2的表达水平在12个月内达到MMR或未达到MMR的患者之间具有显著差异。具体而言，SHP1/Abl%为 7. 4士3. 8 禾口 5. 0士3. 2(p = 0. 017)，SHP2/ABL%^ 0. 19 士 0. 15 和 0. 10 士 0. 12 (p = 0. 017)。在该研究中，我们首先使用两种KCL22细胞系Ima-敏感(KCL22s)和Ima-抗性 (KCL22r)作为模型系统。这些细胞中，Ima抗性不依赖于致癌的Bcr/Abl活性。我们发现与KCL2&敏感细胞相比，KCL22r抗性细胞中具有肿瘤抑制物活性的蛋白Sipl (mRNA和蛋白)水平很低。我们同时发现该基因的下调与SHPl启动子的甲基化水平有关。实际上，通过启动子区域去甲基作用，5-氮杂胞苷(5-AC)治疗再次诱导了 KCL22r中Srpl的表达。该治疗重建了这些细胞中的Ima敏感性，即Ima的生长抑制作用。在分子水平，恢复的Ima敏感性伴随STAT3和ERK1/2磷酸化的显著下降。为了更好的理解Sipl的功能，我们采用质谱法搜索Shp-I结合蛋白，发现Sipl在这些细胞中与Sip2 ( 一种公知的作为致癌途径阳性调节物的蛋白磷酸酶)相互作用，所述途径包括Ras/MAHi途径。功能获得性突变已描述于多种造血瘤形成过程中，包括青少年慢性骨髓单核细胞白血病。在Wi+细胞中，致癌的Bcr/ Abl蛋白通过接头蛋白Gab2激活Sip2，所述接头蛋白一旦磷酸化即能结合》!Ρ2的SH2结构域。通过复杂的相互作用，可能涉及两个羧基端酪氨酸残基(542和580)，Shp2也是生长因子受体的信号转导蛋白。我们假设Sipl通过脱磷酸作用可能调节》ιρ2的活性，构成了 Ima
6抗性的重要机制。在KCL2&细胞系中敲除Sipl导致Sip2的542和580酪氨酸残基的完全磷酸化，使其对于药物的敏感性下降，由此支持了该蛋白在Ima敏感性中的作用。另一方面，低水平Sipl的KCL22r中Sip2的敲除导致生长抑制，Ima敏感性恢复，与STAT3 (60% ) 和ERKl/2(70%)磷酸化的显著下降有关。原代细胞的数据支持了 Sipl在患者Ima抗性中的作用。实际上，我们分析了 60名CML患者的骨髓样品，所述患者根据ELN定义分成最佳的(n = 35)、次最佳的(n = 17) Ima响应者，以及一级(n = 5)或二级Ima抗性(n = 3)。 与次最佳(3. 8士 1. 54)和最佳(5. 8士 1. 77)响应者相比时，在抗性患者中Shpl的mRNA水平显著下降[SHP1/ABL比例3. 2 士 1. 04，(平均值±SD),*p <0. 05]。此外，与6名最佳响应者相比，分离自6名抗性患者的⑶34+细胞中观察到Sipl下降。总而言之，我们的研究显示，Shpl和2水平的异常平衡通过激活Ras/MAPK途径在不依赖Bcr-Abl的Ima抗性中具有作用，低水平的Sipl与无响应的患者有关。本研究中我们研究了两种SHP组成型非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2在进入TOPS(酪氨酸激酶抑制剂优化和选择)试验的48例新近诊断的CML患者的白血病细胞中的表达水平的预测作用。TOPS是一项前瞻性的开放标记的随机O 1)111期试验，在 CP-CML中比较了 Ima 800mg/d和400mg/d。该试验的终点是主要分子响应(MMR)率，其被一些报道用作预测对无进展存活(pre)有益的指标。结果显示，通过QPCR测定的以相对于ABL比例表示的所述新诊断的患者外周血的SHPl和SHP2的mRNA水平在12个月内达到MMR或未达到MMR的患者之间具有显著差异 (对于 SHP1/Abl%为 7. 4士3. 8 和 5. 0士3. 2,ρ = 0. 017，对于 SHP2/ABL%^ 0. 19士0. 15 禾口 0. 10 士 0. 12，P = O. 017)。为进一步探究SHPl作为伊马替尼敏感性决定因素的作用，我们评价了进入 TOPS-酪氨酸激酶抑制剂优化和选择性试验-(Cortes等，EHA 2008)的93名新诊断为 CML的患者中SHPl的表达。该研究的结果显示，在12个月内达到和未达到MMR的患者之间，通过QPCR在患者进入研究时测定的外周血SHPl的mRNA水平显著不同(7. 9士4.0和 5. 9士3. 4 ;p = 0. 01)。在我们的模型中，使用逻辑回归来评价回归系数和相应的比值比， 使用12个月时的MMR作为输出变量。由于SHPl的第25和第75百分位数分别为4. 3和 8. 4(导致四分位范围为4. 1)，统计学分析显示SHPl中4. 1或以上的值与12个月时达到 MMR的关联接近于2倍的几率(OR= 1.92 ；95% CI = 1. 12，3. 29 ；ρ = 0.018)。此外，在列联表中，卡方分析显示，与高-中等SHPl表达和低-中等Sokal评分的患者相比，低SHPl 表达和高Sokal评分的患者在12个月时未达到MMR的风险较高(p = 0. 0068)。总之，这些结果显示，测定SHPl的表达水平可用于评价新诊断的CP-CML患者和评价治疗响应，其可以帮助优化格列卫治疗或推荐患者更有效的TKI。总之，我们的结果显示，SHPl和SHP2的表达水平是用于新诊断的CP-CML患者的 MMR的有效预测物。
权利要求
1.SHPl和/或SHP2作为CML患者的生物标记物的用途。
2.权利要求1的用途，用于确定伊马替尼或其可药用盐的治疗效果。
3.测定SHPl和/或SHP2水平的体外方法，包括以下步骤a)测定样品中的SHPl和/或SHP2的mRNA水平；b)测定ABL的mRNA水平；c)将SHPl和/或SHP2的mRNA水平相对于ABL标准化。
4.如权利要求3所述的方法在筛选CML患者以确定使用伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐进行适当治疗中的用途。
5.诊断试剂盒，包括a)用于测定样品中SHPl和/或SHP2的mRNA水平的工具；b)用于测定ABL的mRNA水平的工具；c)将SHPl和/或SHP2的mRNA水平相对于ABL标准化的工具。
6.伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐在治疗SHPl水平低于约3的CML 患者中的用途。
7.伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐在制备治疗CML的药物中的用途， 其中患者的SHPl水平低于约3。
8.治疗温血动物CML的方法，包括以下步骤(a)在治疗前测定CML患者血液中SHPl的水平，以及(b)对SHPl水平低于约3的CML患者施用日剂量的甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼，其中所述甲磺酸伊马替尼的日剂量至少是CML患者所用标准剂量的150%。
9.治疗人类患者慢性髓细胞样白血病(CML)的方法，包括以下步骤(a)在治疗前测定CML患者血液中SHPl的表达水平，以及(b)对SHPl表达水平低于约3的CML患者施用日剂量的甲磺酸伊马替尼，其中所述甲磺酸伊马替尼的日剂量至少是CML患者所用标准剂量的150%。
10.用于药物的包装说明书，所述药物包含伊马替尼、尼罗替尼和/或达沙替尼或其可药用盐，其特征在于含有针对SHPl水平低于约3的患者的使用说明。
全文摘要
本发明涉及用于评价患者以帮助优化人类患者群体中慢性髓细胞样白血病(CML)治疗的方法。具体而言，本发明涉及SHP1和/或SHP2，其作为CML患者的生物标记物。
文档编号C12Q1/68GK102203294SQ200980143685
公开日2011年9月28日 申请日期2009年11月5日 优先权日2008年11月7日
发明者B·伊佐, F·夸兰泰利, F·帕内, N·埃斯波西托, T·卡莱比克 申请人:诺瓦提斯公司