专利名称：转基因动物内的核受体传感器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于评价物理或化学试剂对转基因动物，例如转基因猪内组织影响的方法。
背景技术：
属于核受体超家族的转录因子在细胞生长、分化和凋亡中起着至关重要的作用。 核受体通过活化特异靶基因的表达参与基因表达的调节。因此，核受体的活化导致基因表达的改变，并且被怀疑参与发展成许多病症的途径。核受体是许多药物的主要靶标。已经得到确认，典型的核激素受体如视黄酸和维生素D受体调节细胞命运，并且在角质形成细胞中，类视黄醇和维生素D类似物已经在治疗表皮病中得到普遍应用。最近，在控制角质形成细胞生长和分化中已经牵涉到所谓过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)家族的成员， 并且已经建议靶向PPAR的药物应当考虑作为潜在的皮肤治疗剂。鉴于核受体对细胞生长、分化和凋亡的影响，用于检测特异核受体活化的方法是极其有价值的。此种方法可用于评价特定组织接触潜在诱导核受体所介导基因活化的试剂的影响。这将是解析大量与核受体活化相关的病症的机制的宝贵工具。用于检测核受体活化的方法已经在分子生物学研究中采用。该方法利用两个核酸盒包含传感器组件的一个盒和包含报告器组件的一个盒。然而，以前该核受体传感器系统仅在单细胞培养中采用。在本发明中，核受体传感器系统功能性整合入转基因动物，例如转基因小鼠或猪的基因组中。将核受体传感器系统整合入转基因动物的基因组中使得可以体内时-空分析潜在影响核受体的试剂。例如将核受体传感器系统整合入转基因动物的皮肤中使得可以用于研究所应用药物或异生素进入皮肤层的渗透性。每天，动物和人均暴露于大量的不同物理和化学试剂中，例如UV辐射、异生素和食物添加剂，这些当中多数与皮肤或消化道接触。然而，对于这些试剂中的绝大多数，还没有表征这种接触所带来的潜在健康问题，并且因此，需要评价它们以什么程度透过皮肤、肠壁或其他相关组织。已知相当数量的试剂能够影响核受体家族成员的活性，并且因此需要开发实验系统，使得高效的且划算的方法用于检测给定物理或化学试剂穿透入特定组织和活化核受体的能力。由于人皮肤结构复杂，所以难以得到人皮肤模型。已经广泛使用人皮肤外植体评价表皮渗透性。然而，难以得到足够的人皮肤用于外植体研究，并且此外，有活性的人皮肤外植体具有诸多缺点，例如样品大小、形状和质量差异相当大。人皮肤外植体的替代物是从分离的人角质形成细胞产生的再生人皮肤。再生的表皮模型是精致的、有用的和实用的工具，并且已经证明能模拟人表皮的许多分子特性和生物物理学特性。然而，与正常表皮和人皮肤外植体相比，再生表皮的屏障功能降低。有用的替代物是猪皮肤，已经证明其是人皮肤的良好模型，并且已经被推荐用于表皮吸收研究(用于开展皮肤吸收研究的OCDE指导文件；测试和评价系列，第观)。猪皮肤的组织与人皮肤类似，并且预测，猪系统的皮肤传感器的产生与先进的基于荧光的方案的结合将证明其在用于基础以及原位目的的更多应用(测试物质和异生素的渗透性)中的重要性。通过使用猪克隆和基因转移技术的最新进展，可以将核受体传感器系统整合入猪中以产生在皮肤中具有传感器系统的克隆的转基因猪，并且因此，可以用于体内渗透性研究。此种转基因动物将为研究药物和异生素的皮肤渗透性提供重要的技术。此类认识对于向皮肤的药物递送和用于异生素的风险评价将是重要的。
发明内容
本发明涉及用于评价试剂对组织影响的方法。本发明还用作用于评价另外的化合物有效性的方法，该另外的化合物在试剂之前应用于组织以最小化或最大化所述物理或化学试剂对所述组织的影响。在一个方面中，本发明涉及用于评价试剂在动物组织内影响的方法，包括a)提供转基因动物，其包含至少一种核酸序列，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b)向所述动物施用所述试剂， 和c)评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中所述表达产物在步骤 (b)之前和之后的改变表明对所述组织有影响。在另一个方面中，本发明涉及用于测试化合物改变动物组织内试剂影响能力的方法，包括a)向包含至少一种核酸序列的转基因动物施用所述化合物，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b)向所述转基因动物施用所述试剂，和c)评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中所述表达产物的量在所述化合物存在和缺乏下不同表明所述化合物能够改变所述试剂在所述组织内的影响。在第三个方面中，本发明涉及包含至少一种核酸序列的转基因动物，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。在第四个方面中，本发明涉及从根据本发明的转基因动物衍生的细胞系。本发明还包括非人转基因动物，其包含本发明的传感器和/或报告盒。因此，在一个方面中，本发明涉及转基因动物，包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。转基因动物是选自猪、迷你猪、微型猪、小鼠、大鼠、非人灵长类和啮齿类动物的一个实施方案，并且优选是猪。核受体优选的是甲状腺激素受体-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲状腺激素受体-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、视黄酸受体-α (RARa ；NR1B1, RARA)、 视黄酸受体-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、视黄酸受体-γ (RARy ；NR1B3, RARG)、过氧化物酶体增殖物激活受体-a (PPARa ；NR1C1, PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、过氧化物酶体增殖物激活受体_ Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA a (Rev-ErbA α ；NR1D1)、Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相关孤儿受体-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相关孤儿受体-β (ROR^ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受体-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受体-β (LXR β ；NR1H2)、法尼醇 X 受体(FXR ；NR1H4)、维生素D受体(VDR;NR1I1，VDR)(维生素D)、孕烷X受体(P)CR ;NR1I2)、组成型雄烷受体 (〇八1 ;殿113)、肝细胞核因子-4-0 (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝细胞核因子-4-γ (HNF4 γ ； NR2A2, HNF4G)、类视黄醇 X 受体-a (RXRa ； NR2B1, RXRA)、类视黄醇 X 受体-β (RXR3 ； NR2B2, RXRB)、类视黄醇 X 受体-Y (RXR γ ；NR2B3, RXRG)、睾丸受体 2 (TR2 ；NR2C1)、睾丸受体4 (TR4 ；殿2以)、果蝇tai 1 less基因的人同系物(TLX ；NR2E1)、感光细胞-特异核受体(PNR ；NR2E3)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子 II (C0UP-TFII ； NR2F2)、6 :V_erbA-相关(EAR-2 ； NR2F6)、 雌激素受体-a (ERa ；NR3A1, ESR1)、雌激素受体-β (ER^ ；NR3A2, ESR2)、雌激素相关受体-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)、雌激素相关受体-β (ERRβ ；NR3B2, ESRRB)、雌激素相关受体-Y (ERRy ；NR3B3, ESRRG)、糖皮质激素受体(GR ;NR3C1)(皮质醇)、盐皮质激素受体(MR;NR3C2)(醛固酮)、孕酮受体(PR;NR3C3，PGR)(性激素孕酮)、雄激素受体 (AR ；NR3C4, AR)(性激素睾酮)、神经生长因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受体相关1 (NURR1 ； NR4A2)、神经元衍生的孤儿受体1 (N0R1 ；NR4A3)、类固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)、肝受体同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、生精细胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (剂量敏感性性反转，肾上腺发育不全关键区，在X染色体上，基因l(NROBl))、小异二聚体伴侣(SHP;NR0B2)或具有两个DNA结合结构域的核受体QDBD-NR)，并且更优选地核受体选自维生素D受体、肝X受体、 视黄酸受体、类视黄醇X受体、混杂孕烷X受体和过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)，包括 PPARa、PPARi3 / δ、PPAR γ。在优选的实施方案中，核受体或其部分包含核受体的配体结合结构域或其片段。本发明优选的转基因动物包含a.至少一种编码融合多肽的核酸序列，融合蛋白包含偶联至酵母GAL4 DNA结合结构域的PPAR δ或其部分和/或b.至少一种编码β-半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。本发明转基因动物的DNA结合结构域优选地是GAL4 DNA-结合结构域、LexA DNA-结合结构域、和/或它们的任何部分。此外，核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分优选地从可诱导和/或组织-特异性启动子表达，例如对选自皮肤、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和/或肿瘤的组织具有特异性的启动子。在优选的实施方案中，组织-特异性启动子是角蛋白14增强子/启动子。在一个实施方案中，编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列还包含至少一种酵母上游活化序列(UASgal)、细菌LexA结合位点和/或其部分。此外，编码可检测报告转录物或多肽的核酸序列优选地从异源性和/或可诱导启动子表达。在优选的实施方案中，核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分物理性或化学性偶联，例如，多肽优选的作为融合肽表达。所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的表达优选地促进报告多肽的表达。报告转录物、多肽或其片段优选地包含可目视、光学或放射自显影检测的产物，并且因此，在一个实施方案中报告多肽是选自β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed单体、 ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、萤火虫萤光素酶、lac Z、海肾萤光素酶、SEAP、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增强蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强黄色荧光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增强青色荧光蛋白(eCFP)、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白、人α-1-抗胰蛋白酶 (hAAT)和/或其片段、修饰物或功能变体；在优选的实施方案中，报告多肽是半乳糖苷酶。报告转录物或多肽的表达可通过本领域技术人员可利用的任何适宜检测技术，例如选自酶或光谱测定、共聚焦或多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、酶联免疫吸附测定 (ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、引物延伸和DNA阵列技术检测。在另一个方面中，本发明涉及用于评价试剂对非人动物组织内核受体活性影响的方法，所述方法包括a.提供如上所定义的本发明非人转基因动物，b.向所述转基因动物施用试剂，和c.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达指示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。在又一个方面中，本发明涉及用于检测化合物改变试剂对非人动物组织内核受体活性影响的能力的方法，包括a.提供如上所定义的本发明非人转基因动物，b.向所述转基因动物施用所述化合物，c.向所述转基因动物施用所述试剂，和d.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达指示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。在本发明方法中，编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列的表达在所述试剂和/或化合物存在和缺乏下检测。在本发明方法的优选实施方案中，在所述试剂存在下与所述试剂缺乏下相比a.所述报告转录物或多肽表达升高指示所述试剂对所述核受体的活性具有刺激性影响，b.所述报告转录物或多肽表达降低指示所述试剂对所述核受体的活性具有抑制性影响，和c.所述报告转录物或多肽表达未改变指示所述试剂对所述核受体的活性不具有或者具有很小的影响。同样地，在本发明方法的另外的优选实施方案中，所述化合物存在下与所述化合物缺乏下相比
a.所述试剂对所述报告转录物或多肽表达的影响升高表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响具有刺激性影响，b.所述试剂对所述报告转录物或多肽表达的影响减少表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响具有抑制性影响，和c.所述试剂对所述报告转录物或多肽表达的影响很小或未改变表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响不具有或者具有很小的影响。根据本发明的方法，所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的表达促进所述报告多肽的表达。编码报告多肽的核酸序列的表达优选通过检测编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物检测，例如，所述报告转录物或多肽表达的检测包括通过选自酶或光谱测定、共聚焦或多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、引物延伸和DNA阵列技术的任何技术检测。本发明方法和用途的试剂和/或化合物是任何物理或化学试剂，例如药物组合物、化妆品、药物、异生素化合物、食物成分、糖、脂质、蛋白质、膳食补充剂、辐射和/或电刺激。在优选的实施方案中，化合物是防晒洗剂和/或所述试剂是UV-辐射。试剂和/或化合物为例如溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒和/或纳米颗粒形式，并且试剂或化合物通过例如口服包括颊和舌下、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内施用或通过吸入或吹入施用而施用；优选地试剂或化合物通过局部和/或肺施用而施用。在本发明方法中，转录和/或翻译产物的检测在活动物中开展；例如转录和/或翻译产物的检测在不将组织从活动物中取出下开展。在另一实施方案中，转录和/或翻译报告产物的检测在从动物中取出的组织样品上开展。组织例如选自皮肤、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和/或汗液；优选地组织是皮肤、表皮和/或真皮。在另一个方面中，本发明涉及从本发明的转基因动物衍生的细胞系。本发明的另一个方面涉及转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或从本发明的转基因非人动物衍生的细胞核，和/或转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，其中转基因基因组包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。在又一方面中，本发明涉及产生本发明转基因非人动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、 胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核的方法，包括步骤i.提供供体细胞，ii.通过插入下列对i)的供体细胞进行基因修饰a.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和
b.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或c.任何所述核酸序列的转录或翻译产物，iii.将在ii)中得到的供体细胞的修饰的基因组转移进入宿主细胞，iv.得到形成胚胎的重构胚胎v.培养所述胚胎；和vi.转移所述培养的胚胎至宿主哺乳动物以致于胚胎发育成基因修饰的胎儿，其中所述基因修饰的胚胎通过包括步骤i)至V)的核转移产生，其中所述基因修饰的胚泡通过包括步骤i)至vi)的核转移产生，其中所述基因修饰的胎儿通过包括步骤i)至vi)的核转移产生。此外，本发明的方面涉及本发明的转基因动物、细胞系、卵母细胞、精细胞、胚泡、 胚胎、胎儿、供体细胞和/或细胞核用于评价核受体活性的用途。在优选的实施方案中，用途涉及评价试剂对核受体活性的影响，例如如上所定义试剂。在另一实施方案中，用途涉及体内评价因内源激动剂而引起的核受体活性，例如因在正常皮肤发育过程中产生的激动剂而引起的核受体活性。在特定实施方案中，内源激动剂在疾病，例如银屑病、不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病发展过程中产生。
图1. A 核受体传感器系统原理，C 睡美人(slewing beauty) (SB)基因传感器。图 2. A :pT2/UAS-d2eGFP ；B ρ T 2/UA S-d2 e GFP + pM/h VD R ；C :pT2/ UAS-d2eGFP+Gal4VP16 ；D pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-6M 阿法骨化醇；E :pT2/ UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-8M 阿法骨化醇；F :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10"-10M 阿法骨化醇；G :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10"-6M 钙泊三醇；H pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-8M 钙泊三醇；I :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+l(T-10M 钙泊三醇。图3.如通过对以所标明核受体传感器载体构建体转染的细胞进行的FASC筛选所证实的表达GFP细胞的百分数。图4.以所标明核受体传感器载体构建体转染的表达GFP细胞的平均绿色荧光。图5. A 在同一质粒上具有传感器和受体组件的顺式构建体。该构建体是用于产生转基因猪的本发明优选实施方案。B:与A相同的构建体，但是具有SV40启动子用于 Gal4hVDR表达。C 反式作用构建体，其中传感器和受体部件位于分开的质粒上。反式作用构建体可用在顺式作用构建体的功能性降低的情况下。然而，反式作用载体的使用存在在繁殖过程中丢失一个组件的风险。LIR:左反向重复；4XUAS:4次重复上游激活序列； d2eGFP 不稳定增强绿色荧光蛋白；Neo 新霉素抗性基因；feil4-hVDR 酵母转录激活剂蛋白质；MR:右反向重复；miniTK启动子最小胸苷激酶启动子；SV40启动子猿猴病毒40 启动子；K14启动子人角蛋白14启动子med β-珠蛋白内含子。
具体实施例方式用于检测特异核受体活化的方法学是广泛应用性的。本发明提供检测特异核受体活化的方法。此外，该方法学使得可以用于评价物理或化学试剂对特异核受体活化的影响。在进一步的应用中，本发明的方法还可以用于评价在所述物理或化学试剂施用之前、之后或同时向组织施用化合物的抵消或增强所述物理或化学试剂对核受体活化影响的能力。本发明可检测在发育的各个阶段过程中和/或在先前施用可改变所述试剂影响的化合物之后动物组织内所选择核受体的活化。本发明的方法使得可以用于检测所选择核受体的空间和时间活化。根据本发明的核受体传感器系统可用于数个目的，包括i)研究已知活化所选择核受体的药物物质的有效性，ii)测定组织正常发育和稳态过程中因内源激动剂的产生所引起的核受体活化，iii)研究多种异生素进入组织内的渗透能力，和iv)用于药物递送目的研究不同类型脂质体、纳米颗粒或其它制剂运输化合物进入组织内的能力。通过以包含已知核受体激活剂的在测配方处理组织，报告系统的活化将反映出配方的渗透能力。因此，在一个方面中，本发明涉及用于评价试剂在动物组织内影响的方法。该方法包括a)提供转基因动物，包含至少一种核酸序列，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b)向所述动物施用所述试剂，和c)评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中所述表达产物在步骤(b)之前和之后的改变表明对所述组织有影响。在另一个方面中，本发明涉及用于测试化合物改变试剂在动物组织内影响的能力的方法。该方法包括a)向包含至少一种核酸序列的转基因动物施用所述化合物，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b)向所述转基因动物施用所述试剂，和c)评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/ 或翻译表达产物，其中所述表达产物的量在所述化合物存在和缺乏下存在不同表明所述化合物能够改变所述试剂在所述组织内的影响。在该上下文中，术语“改变”包括降低或增加物理或化学试剂对待评价核受体的影响。本发明的该方面包括向转基因动物组织施用所述化合物，其基因组包含编码报告多肽的核酸序列，和编码偶联至DNA-结合结构域的核受体的另外核酸序列，将转基因动物暴露于施用至组织的物理或化学试剂下，和测量编码报告多肽的核酸序列的表达。如本文所使用，术语“转基因动物”指非人动物，其在其基因组中包含外来基因。外来基因可以包含在种系组织中并且因此被传递至后代。外源性基因可以通过本领域技术人员已知的技术转移至动物的基因组中。用于产生转基因动物的优选方法和技术在本文别处描述。如本文所使用，术语“体内”指在活动物身体内发生的任何过程、反应或实验。如本文所使用，术语“异源性”指正常情况下在天然条件下没有发现紧密相连的核酸序列的任何组合。根据本发明的异源性基因优选地选自，但不限于如本文别处所定义的报告基因、核受体、启动子和增强子。术语“评价”、“评价，，或“评估，，通常指对目的参数的估计。估计有代表性地基于对参数的直接检测或测定和/或对所述参数指示物的检测或测定。由此，具体而言，试剂对核受体活性的影响基于对报告转录物或多肽的检测而评估。术语“多核苷酸”或“核酸序列”指长度至少2个碱基的聚合形式的核苷酸。术语 “氨基酸”和“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列、或它们当中任意一种的片段，并且指天然存在的分子或合成的分子。当为了指天然存在蛋白质分子序列而描述“氨基酸序列”时，“氨基酸序列”和相似术语并不意味着限制氨基酸序列为与所描述蛋白质分子有关的完全天然的氨基酸序列。如本文所使用，术语“核酸”包括包含一个或一个以上修饰碱基的DNA或RNA。因此，具有因稳定性原因或因其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是“核酸序列”，如该术语在本文中所预期的那样。此外，如在本文中所使用的术语那样，包含稀有碱基如肌苷或修饰碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是核酸序列，在此仅举两例。应该意识到，已经对DNA和RNA进行各式各样的修饰，所述修饰用于本领域技术人员已知的诸多有用目的。如在本文所采用的术语核酸包括此类化学、酶学或代谢修饰形式的核酸，以及病毒和细胞特有的化学形式的DNA和RNA，尤其是单细胞和复杂细胞。如本文所使用的与核酸序列或多肽有关的其“片段”或“部分”是本发明核酸序列或多肽的独一无二的部分，其在序列上与亲本序列相同，但长度上短于亲本序列。因此，术语“片段”或“部分”指这样的本发明核酸序列或多肽，其可以包含直至整个长度的所定义序列减去一个核苷酸或氨基酸残基。例如，片段可以包含从5至100000个连续核苷酸或氨基酸残基。片段可优选地选自分子的某些区域，例如特异功能区，例如配体结合结构域或DNA-结合结构域。例如，多肽片段可以包含选自如在某些定义序列中所示多肽的第一个 250个或500个氨基酸(或者第一个25%或50% )的某些长度的连续氨基酸。显然，这些长度是示例性的，并且说明书，包括序列表、表和图所支持的任何长度可以包含在本实施方案之内。术语“同源性”指两个或更多个多核苷酸序列或者两个或更多个多肽序列之间的序列相似性，或者可互换地，序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。描述了多个程序和比对算法，并且提出了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑，例如VECTOR NTI0两个核酸序列或者两个氨基酸序列之间的相似性以序列间用序列相似性表示，否则被称为序列同一性。序列同一性常常以同一性百分数(或者相似性或者同源性)测量； 百分数越高，两个序列将会越相似。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)可从数个来源得到，包括国家生物技术信息中心(NBCI, Bethesda, Md.)和互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、 tblastn 和 tblastx 关联使用。其可以以网址 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 访问。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/blast-help. html 中得到。所公开多肽的同系物有代表性地表征为，与使用有缺口 blastp的NCBI基本Blast 2.0将所公开氨基酸序列与数据库如nr或者swissprot数据库进行全长比对计算时具有至少94%的序列同一性。备选地，可以手工比对序列并计算相同氨基酸的数量。将该数除以你的序列中的氨基酸总数再乘以100得到同一性百分数。如对于多核苷酸序列所适用的术语“同一性百分数”和“ ％同一性”指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间残基匹配的百分数。此种算法可以标准化和重现性方式在被比较序列中插入空隙以便优化两个序列之间的比对，并且因此完成两个序列的更有意义的比较。由于遗传密码的简并性，未显示高程度同一性的核酸序列仍然可编码相似的氨基酸序列。可以理解，可以使用这种简并性对核酸序列进行更改以产生均编码基本相同蛋白质的多个核酸序列。如对于多肽序列所适用的短语“同一性百分数”和“％同一性”指使用标准算法比对的至少两个多肽序列间残基匹配的百分数。多肽序列比对方法是众所周知的。一些比对方法把保守氨基酸替代考虑在内。在上面更详细解释的此类保守替代通常保留了替换部位的电荷和疏水性，因此保留了多肽的结构(由此保留了功能)。同一性百分数可以在全部所定义，例如如由特定SEQ ID号所定义多肽序列的长度上测量，或者可以在更短的长度上测量，例如从来自较长的所定义多肽序列的片段长度上测量，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。此类长度仅是示例性的，并且应当理解，通过本文在表、图或序列表中所示序列所支持的任何片段长度可以用于描述可以在其上测量同一性百分数的长度。同一性百分数可以在整个所定义序列，例如通过特定SEQ ID号所定义的序列的长度上测量，或者可以在更短的长度上测量，例如，来自较长的所定义序列的片段的长度上测量，如至少20、至少30、至少40、至少50、至少70、至少100或至少200个连续核苷酸的片段。此类长度仅是示例性的，并且应当理解，通过本文在表、图或序列表中所示序列支持的任何片段长度可以用于描述在其上可以测量同一性百分数的长度。如本文关于两个或更多个多肽所使用的术语“物理或化学偶联的”意思是指多肽通过物理和/或化学相互作用连接。通过使用化学或物理交联剂的化学偶联方法在本领域中众所周知。在优选的实施方案中，本发明的物理或化学偶联多肽作为融合肽表达，其中多肽通过肽键(酰胺键)偶联。片段用于指非全长部分的核酸或多肽。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。功能同系物功能同系物可以是表现出与给定基因/基因产物/蛋白质/多肽的野生型形式/序列具有至少一些序列同一性并且保留了至少一个方面的最初序列功能性的任何核酸/蛋白质/多肽。因此，Hiv-I包膜的功能同系物具有诱导针对表达Hiv-I包膜的细胞的免疫应答的能力。启动子DNA链上的结合部位，RNA聚合酶结合于此通过一个或更多个附近结构基因启动信使RNA的转录。如本文所使用的术语“生物学样品”或“样品”指包含遗传物质，如RNA或DNA和/ 或蛋白质的任何适宜生物学样品。在优选的实施方案中，样品从受试者，例如猪、小鼠或另一哺乳动物分离。在优选的实施方案中，样品是选自皮肤、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和/或汗液的组织样品。最方便的样品类型是血液样品；然而，样品的选择取决于特定疾病或临床状态以及检测方法并且对本领域技术人员而言是显而易见的。术语“激动剂”指模拟激活分子功能的物质。术语“拮抗剂”指与激动剂竞争结合部位但不引起有效反应的分子。拮抗剂包括，但不限于，药物、激素、抗体和神经递质，以及其类似物和片段。术语“配体”指结合另一分子上特异部位(配体结合结构域(LBD))的任何分子。 因此，术语“配体结合结构域”是例如核受体中结合配体的部位。配体与多肽如核受体的配体结合结构域的结合引起多肽中的构象改变，这将改变多肽的催化或调节活性。术语“调整”包括与适宜对照相比所测量活性的增加或降低、刺激、抑制或阻断。表达水平的“调整”包括与缺乏正测试的试剂的对照相比，本发明多核苷酸所编码mRNA或多肽水平的增加和降低。在一些实施方案中，特别感兴趣的试剂是抑制受试多肽生物学活性、 和/或降低细胞中受试多肽水平、和/或降低细胞中受试mRNA水平和/或降低受试多肽从真核细胞释放的那些。在另外的实施方案中，感兴趣的试剂是增加受试多肽生物学活性、和 /或增加细胞中受试多肽水平、和/或增加细胞中受试mRNA水平和/或增加受试多肽从真核细胞释放的那些。如本文所使用的术语“基因产物”指基因的任何转录或翻译产物。转录产物包括从特定基因转录的任何RNA种类，例如前体RNA、mRNA、tRNA、miRNA、剪接的和非剪接的RNA。 转录物可以被RNA结合蛋白结合，并且因此被包装进入核糖核蛋白(RNP)中，例如mRNP分子。本发明的翻译基因产物包括由基因或其片段编码的任何肽或多肽。因此，“由本发明基因编码的多肽”包含在术语“基因产物”或“翻译基因产物”中。本发明的翻译基因产物包括由本发明核酸序列编码的任何多肽种类。例如，本发明的翻译基因产物包括由选自任意的SEQ ID NO=I- 或其互补物或其部分的序列所编码的任何多肽种类。如本文所使用的关于转录和/或翻译基因产物表达的术语“增加”或“降低”分别指所述转录和/或翻译基因产物的增多或减少；即例如在给定处理，如施用本发明试剂或化合物之前或之后动物、组织和/或细胞群体中，转录和/或翻译基因产物的水平比平均水平更低。关于本发明的转录产物，转录物水平可以通过例如定量或半定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定。转录物水平可以根据内源转录物标准化。降低的转录产物活性可以通过例如如通过RT-PCR所测定的特异RNA转录物水平的减少或降低观察到。在优选的实施方案中，RNA水平通过RT-PCR测定。翻译产物活性降低包括多肽如报告多肽数量/水平两者的降低，和/或降低的所述多肽的酶活性和/或降低的多肽与另外多肽相互作用并进行信号级联的能力。多肽水平可通过本领域技术人员可得到的任何适宜方法测定，例如通过western印迹或ELISA。在一个实施方案中，与缺乏本发明试剂相比，在所述试剂存在下表达增加至少10%、例如至少20%、例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%、例如至少100%、例如至少200%、例如至少300%、例如至少 400%、例如至少500%、例如至少600%、例如至少700%、例如至少800%、例如至少900%、 例如至少1000%。在另一实施方案中，与缺乏本发明试剂相比，在所述试剂存在下表达降低至小于95%、例如小于90%、例如小于80%、例如小于70%、例如小于60%、例如小于 50%、例如小于40%、例如小于30%、例如小于20%、例如小于10%、例如小于9%、例如小于8%、例如小于7%、例如小于6%、例如小于5%、例如小于4%、例如小于3%、例如小于 2%、例如小于1%、例如小于0.5%。
核受体传感器系统本发明方法包括用于体内检测核受体活化的分子传感器系统。核受体系统包括传感器组件和报告器组件。核受体传感器系统依赖于组织细胞内传感器系统和报告系统之间的分子相互作用。传感器系统包含核受体或其片段，其物理性或化学性偶联，如融合至异源性DNA结合结构域。配体与核受体的结合引起融合多肽的构象变化，融合多肽与对融合多肽DNA结合结构域特异性的DNA元件结合，由此促进下游基因簇的转录。本发明还涉及包含核受体传感器盒和/或报告盒的非人转基因动物，其中传感器盒通常包含至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，并且传感器盒通常包含至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点。在本发明非人转基因动物，优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核以及方法和用途的优选实施方案中，核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的表达促进所述报告多肽的表达。具体而言，当存在所述核受体的配体或激动剂时，核受体或其部分，例如所述核受体的配体结合结构域促进报告转录物或多肽的表达。传感器系统本发明涉及在其基因组中包含传感器组件和/或报告器组件的非人转基因动物， 优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核。通常，传感器组件包含至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和/或任何所述核酸序列的转录或翻译产物。因此，本发明包含编码报告多肽的一种核酸序列和编码融合多肽的另外的核酸序列，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。该另外的核酸序列是本发明传感器系统的一部分。在一个实施方案中，本发明的传感器系统包含编码含有DNA结合结构域和核受体配体结合结构域的融合肽的核酸盒。在一个实施方案中，核酸序列或编码传感器系统的另外的核酸序列之前是启动子。因此，在一个实施方案中，所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分从可诱导启动子和/或组织-特异性启动子或者可诱导组织-特异性启动子表达。在特定实施方案中，启动子是可诱导启动子。在一个实施方案中，核酸序列或另外的核酸序列包含组织特异性增强子/启动子以在特异组织中靶向表达融合肽。由此，本发明的报告系统可以通过表达此类融合肽活化。特别地，组织-特异性启动子是对选自皮肤、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和/或肿瘤的组织特异性的。在优选的实施方案中，启动子是皮肤-特异性启动子。在另一优选的实施方案中，启动子是角蛋白14增强子/启动子。因此，在一个此类实施方案中，编码偶联至DNA结合结构域的核受体的另外的核酸序列从组织-特异性启动子表达。在一个实施方案中，启动子包含增强子元件。在一个实施方案中，启动子包含光可诱导序列。在又一实施方案中，启动子包含化学可诱导序列。传感器组件的DNA-结合结构域是可偶联至传感器组件核受体或其部分的任何多肽或其它化学基。DNA-结合结构域的功能是指导核受体或其部分至靶区域，例如本发明报告基因的启动子区或上游活化序列。在优选的实施方案中，DNA-结合结构域是酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)) Gal4 上游活化区(GAL 4 UAS 或 UASgal)，或其任何部分或功能同系物。在另一优选的实施方案中，DNA-结合结构域是细菌LexA DNA-结合结构域，或其任何部分或功能同系物。在另一实施方案中，DNA-结合结构域是酵母UASgal，LexA DNA-结合结构域，或其任何部分或功能同系物。在优选的实施方案中，核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分物理性或化学性偶联。本领域技术人员可以利用用于通过使用化学或物理交联剂进行化学交联的数个方法。在优选的实施方案中，核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分作为融合肽表达， 其中多肽通过肽键(酰胺键)偶联。因此，在优选的实施方案中，传感器多肽作为融合肽表达。在优选的实施方案中，传感器组件的DNA结合结构域选自酵母GAL4DNA结合结构域和/或LexA DNA结合结构域，并且配体结合结构域衍生自核受体，例如视黄酸受体、维生素D受体、肝X受体、混杂孕烷X受体或PPAR。在特定实施方案中，融合构建体的启动子区被已知驱动表皮特异性表达的角蛋白14增强子/启动子替换，以保证皮肤特异性表达。在优选的实施方案中，包含在本发明融合多肽内的核受体或其部分包含至少一个核受体的配体结合结构域或配体结合结构域的片段，如下面所定义。核受体或其部分可以插入至DNA结合结构域中的任何位置和/或偶联至DNA-结合结构域的任意末端。因此，在一个实施方案中，融合多肽包含插入至DNA结合结构域或其部分内和/或在DNA结合结构域或其部分的N-末端和/或C-末端的核受体或其部分。在特定实施方案中，融合多肽包含插入在DNA结合结构域或其部分C-末端的核受体或其部分。在本发明方法、动物和/或细胞的优选的实施方案中，本发明融合多肽的表达促进任何报告多肽的表达，如本文所定义。核受体本发明使得可以检测组织中所选择核受体的活化。检测可以在该组织发育的所有阶段进行。核受体属于对激素和某些其它分子响应的一类蛋白质。核受体与另外的蛋白质协作以增加特异基因的表达。核受体归类于转录因子它们与DNA相互作用并且调节临近基因的表达。通过核受体对基因表达的这种调节是配体依赖性的，并且核受体正常情况下仅在配体存在下是活化的。配体是化学物质，其与核受体的结合引起受体的构象改变，导致受体的活化和相应基因表达的上调。结合活化核受体的配体包括亲脂性物质，例如内源激素、维生素A和D、和异生素。大量基因的表达由核受体调节并且活化这些受体的配体将对生物体具有重要的影响。具体而言，核受体调节与多种病症有关的基因，例如多种癌症类型和其它高增生性病症。由此，核受体是大范围药物的共同靶标。此外，核受体在生物体发育和稳态过程中基因表达的时空调节中起着重要的作用。称作孤儿受体的特定组核受体不具有已知的内源配体。这些受体中的一些，例如 FXR、LXR和PPAR结合大量的代谢中间体，例如脂肪酸、胆汁酸和/或具有相对低亲和性的固醇，并且由此将作为代谢传感器起作用。另外的核受体，例如CAR和P)(R表现出作为刺激代谢异生素的细胞色素P450酶表达的异生素传感器起作用。核受体具有模块结构并且包含下列A-F结构域A-B)N_末端调节结构域包含活化功能I(AF-I)，其是配体不依赖性的。AF-I的转录活化作用通常非常弱，但是与下面提到的活化功能2(AF-2)相联合时利于引起基因表达的更强的上调。A-B结构域在序列上高度可变。ODNA结合结构域(DBD)该结构域包含两个锌指，其结合至称作激素应答元件 (HRE)的特异DNA区。DBD是高度保守的。D)铰链区该可变形结构域连接DBD与LBD，见下。铰链区还影响细胞内运输和亚细胞分布。E)配体结合结构域(LBD) :LBD是α螺旋夹层折叠结构，其中三个反平行α螺旋的一侧为两个α螺旋另一侧为三个α螺旋。配体结合腔位于LBD内部并且刚好在三个反平行α螺旋下面。LBD与DBD—起促成受体的二聚化以及共激活剂和辅阻遏物蛋白质的结合。该结构域也包含活化功能2 (AF-2)，其作用依赖于配体结合。在不同核受体之间，LBD 在序列上是适度保守性的，并且不同核受体之间在结构上是高度保守的。F)C_末端结构域在不同核受体之间该结构域在序列上不同。在一般的机制中，配体与核受体的结合导致受体构象变化，这触发了大量的下游事件，最终导致基因表达的上调或下调。根据它们的特定作用机制和在配体缺乏时的亚细胞分布，可将核受体归为两个大类。类型I核受体主要位于胞液中，而类型II核受体位于细胞核内。类型I配体与胞液中类型I核受体的结合导致热休克蛋白的游离和同二聚化，接着是从胞液易位进入细胞核，在其中核受体结合至称作激素应答元件(HRE)的特异DNA区。类型 I核受体结合由通过可变长度DNA分开的两个半位点组成的HRE，其中第二个半位点是第一个半位点的反向重复。然后核受体/DNA复合体引起另外的蛋白质的募集，这最终活化位于 HRE下游的基因的转录。类型II类型II受体主要滞留在细胞核内，而不管配体结合状态如何。此外，类型II核受体通常与RXR —起作为异二聚体结合至DNA。在配体缺乏情况下，类型II核受体常常与辅阻遏物蛋白质形成复合物。配体与核受体的结合导致辅阻遏物的游离和共激活剂蛋白质的募集。然后另外的蛋白质，包括RNA聚合酶被募集至核受体/DNA复合体以活化下游基因的转录。类型III类型III核受体(主要是NR亚家族2)与类型I受体相似，在结合至DNA时具有同二聚体。然而，类型III结合至同向重复而不是反向重复HRE。类型IV类型IV核受体将作为单体或者二聚体两者结合。然而，仅核受体的一个DNA结合结构域结合至一个半位点HRE。类型IV受体的实例在大多数NR亚家族中存在。激动和拮抗取决于所涉及到的受体、配体的化学结构和被影响的组织，核受体配体表现出从激动至拮抗和反向激动的广泛的多种影响。激动剂配体与其相应核受体的结合将导致基因表达的上调。这种配体刺激的基因表达被称为激动剂响应。内源激素配体的激动作用还可以被某些合成的配体例如糖皮质激素受体抗炎症药物地塞米松模拟。激动剂配体通过诱导受体的利于共激活剂结合的构象而工作。 共激活剂在结合至DNA时被核受体募集，并且用于活化转录。共激活剂常常具有固有的组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性，其减弱组蛋白与DNA的结合，并且由此促进基因转录。拮抗剂一些合成的核受体配体在内源配体缺乏时对基因转录不具有影响。然而，它们可通过竞争性结合核受体的同一部位而阻断激动剂配体的作用。此类配体称作拮抗剂。拮抗剂通常用作药物，例如拮抗性核受体药物是结合糖皮质激素和孕酮受体的米非司酮，由此分别阻止了内源激素皮质醇和孕酮的活性。拮抗剂配体通过诱导受体的阻止共激活剂结合和促进辅阻遏物结合的构象起作用。辅阻遏物常常通过募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)而起作用，这加强了组蛋白与DNA的结合并且因此抑制基因转录。反向激动剂一些核受体是组成型活化的，在激动剂缺乏时刺激DNA转录。该组成型活性可被称作反向激动剂的合成的配体抑制。选择性受体调节剂指向核受体的一些药物化合物在一些组织内表现出激动剂反应并且在另外的组织内表现出拮抗反应。该行为使得可以在一种组织内保留预期有益治疗作用，而在另外的组织内使药物的不良副作用最小化。具有该种混合的激动剂/拮抗剂行为的药物被称为选择性受体调节剂(SRM)。实例包括选择性雌激素受体调节剂(SERM)和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。SRM的作用机制取决于所涉及到的配体和受体的化学结构而变化。然而，通常认为，许多SRM通过促进受体的激动和拮抗间接近平衡的构象而起作用。在共激活剂蛋白质浓度高于辅阻遏物的组织中，平衡状态移向激动剂方向，并且相反在辅阻遏物占优势的组织内，配体作为拮抗剂起作用。家族成员下面是根据序列同源性归类的48个已知的人核受体列表。核受体组织为亚家族名称 组名称(如果整个组共有，为内源配体)〇成员名称(缩写；NRNC符号，基因)(内源配体)亚家族1 甲状腺激素受体-样 组A 甲状腺激素受体(甲状腺激素)〇1 甲状腺激素受体-a (TRa ；NRlAl, THRA)〇2 甲状腺激素受体- β (TR β ；NR1A2, THRB) 组B 视黄酸受体(维生素A和相关化合物)〇 1 视黄酸受体-a (RARa ；NRlBl，RARA)〇 2 视黄酸受体-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)〇3 视黄酸受体-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)
组C 过氧化物酶体增殖物激活受体〇1 过氧化物酶体增殖物激活受体-a (PPARa ；NRlCl, PPARA)〇2 过氧化物酶体增殖物激活受体-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)〇3 过氧化物酶体增殖物激活受体-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG) 组 D:Rev_ErbA〇 1 =Rev-ErbAa (Rev-ErbA α ；NR1D1)〇 2 =Rev-ErbA^ (Rev-ErbA β ；NR1D2) 组F =RAR-相关孤儿受体〇 1 :RAR_ 相关孤儿受体-a (RORa ；NRlFl, R0RA)〇 2 =RAR-相关孤儿受体- β (R0R β ；NR1F2, R0RB)〇3 =RAR-相关孤儿受体-Y (R0R γ ；NR1F3, R0RC) 组H:肝X受体-样〇 3 肝 X 受体-a (LXR α ；NR1H3)〇 2 肝 X 受体-β (L)(R3 ;NR1H2)〇 4 法尼醇 X 受体(F)CR ；NR1H4) 组I:维生素D受体-样〇1 维生素D受体(VDR ；NRlIl，VDR)(维生素D)〇 2 孕烷 X 受体(PXR ；NRl 12)〇3 组成型雄烷受体(CAR ；NRl 13)亚家族2 类视黄醇X受体-样 组A 肝细胞核因子_4(HNF4)〇 1 肝细胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)〇2 肝细胞核因子-4- y (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G) 组B 类视黄醇X受体(RXR a )〇 1 类视黄醇 X 受体-a (RXR α ；NR2B1，RXRA)〇 2 类视黄醇 X 受体- β (RXR β ；NR2B2, RXRB)〇3 类视黄醇 X 受体-Y (RXR Y ；NR2B3, RXRG) 组C:睾丸受体〇 1 睾丸受体 2(TR2 ；NR2C1)〇 2 睾丸受体 4 (TR4 ；NR2C2)參组 E:TLX/PNR〇1 果蝇tailless基因的人同系物(TLX ；NR2E1)〇3 感光细胞-特异核受体(PNR ；NR2E3) 组 F:C0UP/EAR〇1 鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)〇2 鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)〇 6 :V-erbA-相关(EAR-2 ；NR2F6)亚家族3 雌激素受体-样 组A 雌激素受体(性激素雌激素)
〇 1 雌激素受体-a (ERa ；NR3A1, ESR1)〇 2 雌激素受体-β (ERβ ；NR3A2, ESR2) 组B:雌激素相关受体〇 1 雌激素相关受体-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)〇2 雌激素相关受体- β (ERR^ ；NR3B2, ESRRB)〇3 雌激素相关受体-Y (ERR γ ；NR3B3, ESRRG) 组C :3-酮类固醇受体〇1 糖皮质激素受体(GR ；NR3C1)(皮质醇)〇2 盐皮质激素受体(MR ；NR3C2)(醛固酮)〇3 孕酮受体(PR ；NR3C3, PGR)(性激素孕酮)〇4 雄激素受体(AR ；NR3C4, AR)(性激素睾酮)亚家族4 神经生长因子IB-样 组 A :NGFIB/NURR1/N0R1〇 1 神经生长因子 IB(NGFIB ；NR4A1)〇 2 核受体相关 1 (NURR1 ；NR4A2)〇3 神经元衍生的孤儿受体1 (N0R1 ；NR4A3)亚家族5 类固醇生成因子-样 组 A:SF1/LRH1〇1 类固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)〇2 肝受体同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)亚家族6 生精细胞核因子-样 组 A:GCNF〇1 精细胞核因子(GCNF ；NR6A1)亚家族0:混杂的 组 B:DAX/SHP〇1 =DAXl,剂量敏感性性反转，肾上腺发育不全关键区，在X染色体上，基因 1(NROBl)〇2 小异二聚体伴侣(SHP ；NR0B2) 组C 具有两个DNA结合结构域的核受体QDBD-NR)(新的亚家族)本发明提供用于检测所选择核受体活性的转基因动物，和从其衍生的细胞，以及检测特异核受体活化或活性的方法。具体而言，本发明提供转基因动物，优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，其包含至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和/或任何所述核酸序列的转录或翻译产物。本发明的核受体是任何哺乳动物或非哺乳动物核受体，包括任何上面所列核受体。在本发明的一个实施方案中，核受体选自甲状腺激素受体-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲状腺激素受体-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、视黄酸受体-a (RARa ；NR1B1, RARA)、 视黄酸受体-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、视黄酸受体-γ (RARy ；NR1B3, RARG)、过氧化物酶体增殖物激活受体-a (PPARa ； NR1C1, PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、过氧化物酶体增殖物激活受体_ Y (PPAR γ ；NR1C3,PPARG)、Rev-ErbA α (Rev-ErbA α ；NR1D1)、Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相关孤儿受体-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相关孤儿受体-β (ROR^ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受体-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受体-β (LXR β ；NR1H2)、法尼醇 X 受体(FXR ；NR1H4)、维生素D受体(VDR;NR1I1，VDR)(维生素D)、孕烷X受体(P)CR ;NR1I2)、组成型雄烷受体 (〇八1 ;殿113)、肝细胞核因子-4-0 (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝细胞核因子-4-γ (HNF4 γ ； NR2A2, HNF4G)、类视黄醇 X 受体-a (RXRa ； NR2B1, RXRA)、类视黄醇 X 受体-β (RXR3 ； NR2B2, RXRB)、类视黄醇 X 受体-Y (RXR γ ；NR2B3, RXRG)、睾丸受体 2 (TR2 ；NR2C1)、睾丸受体4 (TR4 ；殿2以)、果蝇tai 11 ess基因的人同系物(TLX ；NR2E1)、感光细胞-特异核受体(PNR ；NR2E3)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子 II (C0UP-TFII ； NR2F2)、6 :V_erbA-相关(EAR-2 ； NR2F6)、 雌激素受体-a (ERa ；NR3A1, ESR1)、雌激素受体-β (ER^ ；NR3A2, ESR2)、雌激素相关受体-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)、雌激素相关受体-β (ERRβ ；NR3B2, ESRRB)、雌激素相关受体-Y (ERRy ；NR3B3, ESRRG)、糖皮质激素受体(GR ;NR3C1)(皮质醇)、盐皮质激素受体(MR;NR3C2)(醛固酮)、孕酮受体(PR ；NR3C3, PGR)(性激素孕酮)、雄激素受体 (AR ；NR3C4, AR)(性激素睾酮)、神经生长因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受体相关1 (NURR1 ； NR4A2)、神经元衍生的孤儿受体1 (N0R1 ；NR4A3)、类固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)、肝受体同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、精细胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (剂量敏感性性反转，肾上腺发育不全关键区，在X染色体上，基因l(NROBl))、小异二聚体伴侣(SHP;NR0B2)和/或具有 DNA结合结构域的核受体QDBD-殿)。上面指定的每一核受体旨在是个别的实例。因此，根据本发明对它们当中每一个活化的检测可各自要求专利保护。在一个优选的实施方案中，核受体选自维生素D受体、肝X受体、视黄酸受体、类视黄醇X受体、混杂孕烷X受体和/或过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)，包括PPAR a、 PPAR β / δ、PPAR γ。在一个优选的实施方案中，核受体选自过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)。在特别优选的实施方案中，核受体是PPARii/δ。在另一特别优选的实施方案中， 核受体是PPARa.在另一特别优选的实施方案中，核受体是PPAR β。在另一特别优选的实施方案中，核受体是PPAR Y。在另一特别优选的实施方案中，核受体是PPAR δ。PPARS是人表皮中表达的主要的PPAR亚型。在另一优选的实施方案中，核受体是孕烷X受体(PXR)。 P)(R是为数众多的异生素的可能的靶标。在另一优选的实施方案中，核受体选自视黄酸受体(RARs)。视黄酸受体是经验证的皮肤靶标和皮肤稳态调节者。在特别优选的实施方案中，核受体是视黄酸受体-a (RARa)0在另一特别优选的实施方案中，核受体是视黄酸受体-β (RAR^)0在甚至进一步特别优选的实施方案中，核受体是视黄酸受体-Y (RARy)0 在进一步优选的实施方案中，核受体是维生素D受体。维生素D受体是银屑病治疗中的已知药物靶标。本文所提到的任何一个核受体的任何部分或功能同系物也处于本发明的范围内。在优选的实施方案中，核受体或其部分是核受体或其部分的配体-结合结构域， 例如上面所列。在最优选的实施方案中，本发明的非人转基因动物，优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核包含至少一种编码融合多肽的核酸序列，其中融合多肽含有偶联至酵母GAL4 DNA结合结构域的PPAR δ或其部分，和/或至少一种编码β -半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。报告系统本发明涉及在其基因组中包含传感器组件和/或报告器组件的非人转基因动物， 优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核。通常，报告器组件包含至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点，和/或任何所述核酸序列的转录或翻译产物。因此，本发明包含一种编码报告转录物或多肽的核酸序列。报告系统包含盒，所述盒包含编码报告多肽的核酸序列。报告系统将包含于如本文其它地方所述的载体中。如本文所使用的术语“报告基因”指其转录活化可以被检测的任何基因。因此，在一个实施方案中，本发明的方法、动物和细胞包含报告多肽或其含有可检测产物的片段。转录活化的检测在本文别处描述，然而；通常报告多肽或其片段包含视觉可检测的、光学可检测的或放射自显影可检测的产物。动物，优选猪，以及卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核包含编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸。本领域技术人员会认识到存在许多用于检测的报告基因和系统。例如编码本发明报告多肽的报告基因或核酸选自半乳糖苷酶、HcRecUDsRecUDsRed 单体、hGreen、AmCyan、ZsYellow、萤火虫萤光素酶、lac Z、 海肾萤光素酶、SEAP、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增强蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强黄色荧光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增强青色荧光蛋白(eCFP)、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白、人α "I"抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修饰物和/或功能变体。应当理解，任何的β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed 单体、ZsGreen, AmCyan, ^^ellow、萤火虫萤光素酶、lac Z、海肾萤光素酶、SEAP、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、 d2EGFP、增强蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强黄色荧光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增强青色荧光蛋白(eCFP)、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白、人α-l-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修饰物或功能变体将各自用于它们单独的实施方案中。在优选的实施方案中，编码报告多肽的报告基因或核酸是半乳糖苷酶，或其变体或功能同系物。在另一优选的实施方案中，报告基因是eGFP，或其变体或功能同系物。在本发明优选的实施方案，编码报告多肽的报告基因或核酸是半乳糖苷酶基因，或其功能同系物或部分。该酶由大肠杆菌Iac操纵子中的IacZ基因编码，并将乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖苷酶也在人消化道中产生。半乳糖苷酶作为报告基因的使用使得可以通过本领域技术人员已知的方法简单地进行酶学检测。根据本发明的检测和分析方法描述于本文别处。在本发明另一优选的实施方案中，报告基因是荧光蛋白。在特别优选的实施方案中，报告基因是绿色荧光蛋白，或者其衍生物或功能同系物，包括增强绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。编码荧光肽的报告基因的使用使得可以通过共聚焦和多光子荧光显微镜进行直接荧光检测。包含编码报告多肽的核酸序列的盒可进一步包含启动子元件。在一个实施方案中，编码报告多肽的核酸序列之前是启动子。在特定实施方案中，盒包含驱动报告基因表达的启动子。在一个实施方案中，启动子是异源性启动子。在另一实施方案中，启动子是可诱导启动子。在特定实施方案中，启动子是胸苷激酶启动子，或其片段或功能同系物。在优选的实施方案中，启动子元件是胸苷激酶启动子。包含编码报告多肽的核酸序列的盒还进一步包含至少一个增强子和/或调节元件。增强子元件是促进基因转录的调节性DNA序列。增强子将通过提高同一 DNA分子上最近启动子的活性来提高基因转录速率。增强子不需要特别地接近于其所作用的基因，但是增强子主要位于与其所作用的基因同一核酸序列上，虽然会出现例外。在一个实施方案中，编码报告多肽的核酸序列之前是增强子。在特定实施方案中， 盒包含至少一个促进报告基因表达的增强子元件。在一个实施方案中，至少一个增强子元件是异源性增强子。在特定实施方案中，增强子元件选自酵母UASgal增强子和/或细菌LexA 结合位点。在优选的实施方案中，增强子元件是酵母UASgal增强子，或其片段或功能同系物。 在另一优选的实施方案中，增强子元件是细菌LexA结合位点，或其片段或功能同系物。增强子/启动子是酵母UASgal增强子或细菌LexA结合位点与胸苷激酶启动子的优选常规组合。在本发明转基因动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核、用途和方法的优选实施方案中，编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列还包含至少一种酵母上游活化序列(UASgal)，细菌LexA结合位点和/或其部分。 此外，编码可检测报告转录物或多肽的核酸序列从异源性和/或可诱导启动子表达，例如上面所定义。分析和检测本发明提供用于评价试剂或化合物在动物组织内影响的方法，其中在施用所述试剂步骤之前和之后表达产物的改变表明对所述组织有影响。如果表达产物的量增加或降低至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、 至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500%、至少550%、至少600%、至少750%、至少800%、至少850%、至少 900%、至少950%、至少1000%、至少1100%、至少1200%、至少1300%、至少1400%、至少 1500%、至少 1600%、至少 1700%、至少 1800%、至少 1900%、至少 2000%、至少 2500%、至少 3000 %、至少；3500 %、至少 4000 %、至少 4000 %、至少 4500 %、至少 5000 %、至少 5500 %、 至少6000%、至少6500%、至少6500 %、至少7000 %、至少7500 %、至少8000%、至少 8500 %、至少9000 %、至少10000 %、至少15000 %、或至少20000 %，则视为试剂或化合物对组织具有影响。在本文中使用术语“评价”来包括检测本发明报告基因活化。检测可以通过测量转录或翻译产物的水平实现，即表达产物包括RNA和/或多肽。通常，本发明动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核的报告转录物、多肽或其片段包括视觉可检测的、光学可检测的或放射自显影可检测的产物。因此，在一个实施方案中，本发明的方法、动物、胚胎、胚泡和/或细胞包含报告多肽或其含有可检测产物的片段。报告多肽或其片段或功能同系物包含视觉可检测的、光学可检测的和 /或放射自显影可检测的产物。然而，检测可以通过本领域技术人员已知的任何技术开展，包括酶学和分光光度测定、共聚焦和多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、 引物延伸和/或DNA阵列技术。此外，可以采用基于特异PCR的技术例如RT-PCR、q_PCR以及荧光显微镜和免疫组织化学。当使用半乳糖苷酶作为本发明的报告基因时，表达产物可以通过使用本领域技术人员已知的酶学方法检测。存在用于快速方便检测和定量半乳糖苷酶活性的数个方法和商业试剂盒。在一个实施方案中，半乳糖苷酶活性通过提供底物如 X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)测量。Χ-gal是β-半乳糖苷酶的惰性生色底物。β -半乳糖苷酶将X-Gal水解成无色的半乳糖和形成强蓝色沉淀物的 4-氯-3-溴-靛蓝，其可以通过光学和/或显微镜方法检测。然而，半乳糖苷酶表达还可以通过抗β -半乳糖苷酶抗体使用免疫测定，如ELISA、western印迹和原位杂交检测。评价可在从动物取出的样品上开展。在一个实施方案中，评价在选自乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和汗液的组织上开展。在优选的实施方案中，样品选自皮肤组织，包括表皮和真皮组织、乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、 骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和汗液。在另一实施方案中，样品选自乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、泌尿生殖组织、干细胞包括癌干细胞，和体液例如痰、尿、血液和汗液。在另一优选的实施方案中，组织选自皮肤、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤。在甚至另一实施方案中，样品选自乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织和肺组织。在又一实施方案中，样品选自干细胞和癌干细胞。在甚至另外的实施方案中，样品选自体液、痰、尿、血液和汗液。在甚至进一步的实施方案中，样品选自卵巢组织、子宫组织、结肠组织和泌尿生殖组织。在尤其优选的实施方案中，样品是皮肤组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是表皮组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是真皮组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是血液组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是肺组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是皮肤组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是前列腺组织。在另一尤其优选的实施方案中，样品是卵巢组织。在与本发明试剂或化合物有关的分析中，在一个实施方案中，转录和/或翻译产物的评价在活动物中开展。在另一实施方案中，转录和/或翻译产物的评价在无需从活动物中取出组织的情况下开展。然而，在另一实施方案中，转录和/或翻译产物的评价在从动物取出的样品上开展。样品可以衍生自如本文别处所定义的任何组织。例如，样品选自皮肤组织包括表皮和真皮组织、乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、 肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和/或汗液。本发明方法可包括一个或一个以上评价步骤。在一个实施方案中，本发明方法还包括至少一个额外的评价步骤。评价可发生1次或更多次，例如评价步骤通过至少1、2、3、4、5、10、20、30、60、180、365 或 700 天分开。载体本发明的传感器系统和报告系统将包含于一个或一个以上重组DNA载体中。载体可以是任何载体，包括任何商业可获得的载体和本领域技术人员已知的另外的载体。因此， 载体是逆转录病毒载体、穿梭载体或者哺乳动物表达载体。在一个实施方案中，载体是基于转座子的载体，例如基于睡美人DNA转座子的载体。在另一实施方案中，载体是基于重组酶的载体，例如特别是FLP-FRT重组酶载体。施用可以通过本发明方法或用途评价的物理或化学试剂和/或化合物通过本领域技术人员已知的任何适宜施用方法施用。在一个实施方案中，施用包括经口包括颊和舌下、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内施用或通过吸入或吹入施用。在优选的实施方案中，试剂通过局部施用而施用。在另一实施方案中，所述施用是肺施用。在一些情况中，本发明方法包括向组织重复施用试剂和/或化合物。因此，试剂和 /或化合物可以经多次循环施用，例如至少2、例如至少3、例如至少4、例如至少5、例如至少6、例如至少7、例如至少8、例如至少9例如至少10、例如至少20、例如至少30、例如至少 40、例如至少50、例如至少60、例如至少70、例如至少80、例如至少90例如至少100次循环施用。多个施用循环分开至少1小时、例如至少2小时、例如至少3小时、例如至少4小时、例如至少5小时、例如至少6小时、例如至少7小时、例如至少8小时、例如至少9小时、 例如至少10小时、例如至少11小时、例如至少12小时、例如至少13小时、例如至少14小时、例如至少16小时、例如至少18小时、例如至少20小时、例如至少22小时、例如至少24 小时。在另一实施方案中，施用循环分开至少1天、例如至少2天、例如至少3天、例如至少 4天、例如至少5天、例如至少6天、例如至少7天、例如至少8天、例如至少9天、例如至少 10天、例如至少12天、例如至少14天、例如至少16天、例如至少18天、例如至少20天、例如至少30天、例如至少40天、例如至少50天、例如至少100天。动物在一个方面中，本发明涉及转基因动物，包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。在一个实施方案中，转基因动物选自猪、迷你猪、微型猪、小鼠、大鼠、非人灵长类和啮齿类动物。本发明转基因动物优选是猪。本发明还涉及评价试剂在动物组织内影响的方法。因此，在一个方面中，本发明涉及用于评价试剂对非人动物组织内核受体活性影响的方法，所述方法包括a.提供非人转基因动物，包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。b.向所述转基因动物施用试剂，和c.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达指示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。在另一个方面中，本发明涉及用于检测化合物改变试剂对非人动物组织内核受体活性的影响的能力的方法，包括a.提供非人转基因动物，包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和 /或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。b.向所述转基因动物施用所述化合物，c.向所述转基因动物施用所述试剂，和d.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达指示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。在本发明方法中，编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列的表达在所述试剂和/或化合物存在和缺乏下检测。在本发明方法的优选实施方案中，在所述试剂存在下与所述试剂缺乏下相比a.所述报告转录物或报告多肽表达升高指示所述试剂对所述核受体的活性具有刺激性影响，b.所述报告转录物或报告多肽表达降低指示所述试剂对所述核受体的活性具有抑制性影响，和c.所述报告转录物或报告多肽表达未改变指示所述试剂对所述核受体的活性不具有或者具有很小的影响。类似地，在本发明方法的另外的优选实施方案中，所述化合物存在下与所述化合物缺乏下相比a.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响升高表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响具有刺激性影响，b.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响降低表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响具有抑制性影响，和c.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响很小或未改变表明所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响不具有或者具有很小的影响。在一个实施方案中，所述动物是人、非人灵长类动物、猪、迷你猪、微型猪、小鼠、大鼠和啮齿类动物。在特定实施方案中，所述动物是人。根据本发明，试剂在动物组织内，包括人组织内的影响通过提供转基因动物评价，所述转基因动物包含至少一种核酸序列，其中所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或另外的核酸序列编码融合多肽， 融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。向转基因动物施用试剂并且评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物。施用试剂之前和之后的表达产物的改变表明对所述组织有影响。根据本发明的转基因动物是在其基因组中包含外来基因的非人动物。外来基因可以包含于种系组织中，并且因此可以传给后代。外源性基因可以通过本领域技术人员已知的技术转移至动物的基因组。在一个实施方案中，本发明的转基因动物选自非人灵长类动物、猪、迷你猪、微型猪、小鼠、大鼠和啮齿类动物。在优选的实施方案中，转基因动物是猪(野猪(sus scrofus))0在另一优选的实施方案中，转基因动物是小鼠(mus musculus)。转基因动物可以通过本领域技术人员已知的多种方法得到。此类技术的实例包括向单一细胞胚胎的微管注射、使用Cre/lox或Flp/FRT系统的重组技术、和使用脂质体或电穿孔的转染。修饰的遗传物质还可以通过转座提供(例如通过使用睡美人转座子)。此外， 病毒转导(例如基于逆转录病毒或慢病毒的载体)适宜产生转基因动物。在优选的实施方案中，用于转移的胚泡通过体细胞核转移(SCNT)完成，如本文别处所述。在一个方面中，本发明涉及包含至少一种核酸序列的转基因动物，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。该转基因动物适宜评价试剂对组织的影响和/或适宜测试化合物改变试剂在该动物的组织内影响的能力。在一个实施方案中，动物选自猪、小鼠、大鼠、啮齿类动物、狗、猴、豚鼠、 迷你猪和/或微型猪。在优选的实施方案中，转基因动物是猪。在另一实施方案中，动物是小鼠。转基因动物的报告多肽可以选自本文所述的任何报告多肽。在一个实例中，转基因动物的报告多肽选自β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed单体、ZsGreen, AmCyan, llow、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、SEAP、EGFP、EBFP、EYFP、d2EGFP和GFPuv、青色、 绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白和/或其片段、修饰物和/或功能变体。在优选的实施方案中，报告多肽是半乳糖苷酶或其片段或功能变体。而且，转基因动物的核受体可以选自本文别处定义的那些的任何核受体。在一个实施方案中，核受体选自维生素D受体、肝X受体、混杂孕烷X受体和/或PPAR，和/或其片段，特别是配体-结合结构域。转基因动物的DNA结合结构域优选地选自GAL4 DNA结合结构域和LexA DNA结合结构域，然而，可选择任何DNA结合结构域用于此目的。在特定实施方案中，本发明涉及转基因猪，包含至少一种核酸序列，其中a.所述至少一种核酸序列编码半乳糖苷酶或其部分，和/或b.另外的核酸序列编码融合多肽，包含偶联至酵母GAL4 DNA结合结构域的PPAR δ或其部分，或者所述另外核酸序列的转录或翻译产物。本发明的转基因动物，例如转基因猪可以用于体内测定因内源激动剂产生所引起的核受体活化。在一个实例中，激动剂在正常皮肤发育过程中产生，然而，在另一实施方案中，内源激动剂在疾病发展过程中产生，如银屑病、不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病。在优选的实施方案中，疾病是银屑病。本发明的转基因动物，例如转基因猪适宜测定试剂在组织内的原位穿透和/或核受体被试剂，例如本文别处所定义试剂的活化。
在另一个方面中，本发明涉及从本文所定义转基因动物衍生的细胞系。术语衍生的意思是指细胞系起源于从本发明转基因动物而来的细胞。还可以在从转基因动物分离后对细胞进一步修饰以开发修饰的转基因细胞系。在一个方面中，本发明涉及从本发明转基因非人动物衍生的转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，和/或转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，其中转基因基因组包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。本发明还在一个方面中涉及本发明转基因动物，特别是转基因猪的产生，以及产生本发明卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核的方法。因此，在一个方面中，本发明涉及产生本发明转基因非人动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核的方法，包括步骤i.提供供体细胞，ii.通过插入下列对i)的供体细胞进行基因修饰a.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和b.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/ 或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点和/或c.任何所述核酸序列的转录或翻译产物，iii.将在ii)中得到的供体细胞的修饰的基因组转移进入宿主细胞，iv.得到形成胚胎的重构胚胎v.培养所述胚胎；和vi.转移所述培养的胚胎至宿主哺乳动物使得胚胎发育成基因修饰的胎儿，其中所述基因修饰的胚胎通过包括步骤i)至V)的核转移产生，其中所述基因修饰的胚泡通过包括步骤i)至vi)的核转移产生，其中所述基因修饰的胎儿通过包括步骤i)至vi)的核转移产生。对于本发明转基因动物如转基因猪的产生，根据本发明在细胞核转移方法中所涉及到的供体(体细胞或体细胞的细胞核)和受体(细胞质)是非人哺乳动物。同样，根据本发明，重构胚胎可以植入的动物是非人哺乳动物，优选。哺乳动物可以是选自驯养的或野生的典型的牛科、羊科、鹿科、猪科、马科和骆驼科的有蹄动物。在特别的实施方案中，哺乳动物是母牛或公牛、野牛、水牛、绵羊、大角绵羊、马、矮马、驴、骡、鹿、麋鹿、驯鹿，山羊、水牛、 骆驼、驮马、羊驼或猪。在本发明的特别的实施方案中，哺乳动物是猪。在一个实施方案中， 猪是野猪。在另一实施方案中，猪是驯养猪野猪(Sus scrofa)或家猪(S. domesticus)。在再一实施方案中，本发明涉及迷你猪，但是还涉及近亲繁殖的猪。在特定实施方案中，猪可选自兰德瑞斯猪、约克夏猪、汉普夏猪、杜洛克猪、中国眉山猪、巴克夏猪和皮特兰猪。在再一实施方案中，本发明涉及由兰德瑞斯猪、约克夏猪、汉普夏猪和杜洛克猪组成的组。然而， 本发明还涉及由兰德瑞斯猪、杜洛克猪和中国眉山猪的组。类似地，由巴克夏猪、皮特兰猪、 兰德瑞斯猪和中国眉山猪组成的组可以是本发明的对象。并且由兰德瑞斯猪和中国眉山猪组成的组也是本发明的对象。在特别的实施方案中，猪是兰德瑞斯猪或约克夏猪。在特别的实施方案中，本发明不但涉及繁殖的汉普夏猪，还涉及杜洛克猪。在再一优选的实施方案， 猪是繁殖的中国眉山猪。然而，本发明还涵盖巴克夏猪，并且在特别的实施方案中，本发明涵盖皮特兰猪。本发明的另一实施方案涉及选自Goettingen、Yucatan、Bama Xiang Zhu, ffuzhishan.Xi Shuang Banna的迷你猪。在另外的实施方案中，本发明涉及由Goettingen、 Yucatan 组成的组。备选地，本发明涉及由 Bama XiangZhu、Wuzhishan、Xi Shuang Banna 组成的组。具体而言，本发明涉及Goettingen。但是Yucatan也与本发明有关。类似地， Bama Xiang Zhu涵盖在本发明之内，但是mizhishan，尤其是Xi Shuang Banna也涵盖在本发明之内。根据本发明的供体哺乳动物可以是雌性的或者雄性的。哺乳动物的年龄可以是任何年龄，例如成体，或者例如胎儿。转基因猪和猪的克隆根据本发明的转基因猪包含至少一种核酸序列，其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至 DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。在一个实施方案中，包含至少一种核酸序列的转基因猪其中i)所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，即将包含至少一种核酸序列，是通过将包含编码报告多肽或其部分的所述至少一种核酸序列的转基因猪与包含编码融合多肽(融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物)的至少一种核酸序列的转基因猪杂交获得。因此，本发明还涉及包含至少一种核酸序列的转基因猪，其中所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分。在另一实施方案中，本发明涉及包含至少一种核酸序列的转基因猪，其中所述至少一种核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分， 或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。通过使用当今技术水平的猪克隆和基因转移技术，可以将报告基因系统和/或传感器系统，例如i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列， 和ii.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列整合在一起，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点，和/或进入猪成纤维细胞的细胞核内，其随后用于向卵胞质中转移。在优选的实施方案中，根据本发明的转基因猪通过从遗传工程改造的成纤维细胞体细胞转移到卵胞质克隆产生。由此，本文别处描述的基因报告系统和/或传感器系统被整合在基因组中以分别得到转基因报告猪和/或传感器猪。具体而言，体细胞核转移通过手工克隆，例如由Gabor Vajta所描述的手工克隆(trends in biotechnology，2007)开展。包含本发明核受体传感器系统的猪品种可以用于体内测定因内源激动剂产生所引起的核受体活化。在一个实施方案中，内源激动剂在皮肤的正常发育过程中产生。在另一实施方案中，内源激动剂在疾病状态发展过程中产生。在特定实施方案中，所述疾病是银屑病、不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病。在一个实施方案中，所述疾病是任何皮肤疾病。在另一实施方案中，所述疾病是任何癌症疾病。在优选的实施方案中，所述疾病是银屑病。在另一优选的实施方案中，所述疾病是皮肤癌症。
在本发明的另一个方面中，包含本发明核受体传感器系统的猪品种可以用于研究组织的原位穿透和核受体被试剂，包括异生素的活化。在特定实施方案中，转基因猪品种包含整合在基因组中并在特异组织中表达的 GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域与PXR、视黄酸受体、维生素D受体或任何PPAR 的配体结合结构域的融合物。在优选的实施方案中，该组织是皮肤、表皮、真皮、皮下组织或表皮基细胞。在另一特别的实施方案中，角蛋白14增强子/启动子被整合在编码融合多肽的基因的上游以驱动皮肤的特异表达。在另外的实施方案中，转基因猪包含至少一种核酸序列，其中所述至少一种核酸序列编码包含偶联至GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域的孕烷X受体配体结合结构域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的转录或翻译产物。在另一实施方案中，转基因猪包含至少一种核酸序列，其中所述至少一种核酸序列编码包含偶联至GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域的视黄酸受体配体结合结构域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的转录或翻译产物。在又一实施方案中，转基因猪包含至少一种核酸序列，其中所述至少一种核酸序列编码偶联至GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域的维生素D受体配体结合结构域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的转录或翻译产物。在另外的实施方案中，转基因猪包含至少一种核酸序列，其中所述至少一种核酸序列编码偶联至GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域的任何PPAR，包括PPAR δ配体结合结构域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的转录或翻译产物。体细胞核转移在克隆中，将身体的(身体)细胞或体细胞的细胞核转移进入其自身细胞核被去除(去核的或无核的)的卵细胞中称作体细胞核转移(SCNT)。将从该重构胚胎发育成新个体并且新个体与体细胞供体在遗传学上相同。在本发明中，体细胞核转移方法是细胞核转移方法，包括步骤a)提供至少一个具有至少部分修饰透明带的卵母细胞，b)将卵母细胞分成至少两个部分，得到至少一个胞质体，c)提供至少一个具有预期遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个胞质体与供体细胞或膜包绕细胞核融合。然而，本发明还涉及细胞核转移方法，包括步骤a)提供至少一个卵母细胞，b)将卵母细胞分成至少三部分，得到至少两个胞质体，c)提供至少一个具有预期遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个胞质体与供体细胞或膜包绕细胞核融合。对于所列步骤的参数可以改变以便得到对于给定动物种类最有效的核转移。多个参数在下面详细描述。卵母细胞根据本发明，术语“卵母细胞”意思是指未成熟的雌性生殖细胞，它是一种没有完成成熟过程以形成卵子(配子)的细胞。在本发明中，去核的卵母细胞是核转移过程的受体细胞。根据本发明的卵母细胞从哺乳动物的输卵管和/或卵巢分离。虽然卵母细胞可以从活动物的输卵管和/或卵巢分离，但是正常情况下，卵母细胞从已故动物取回。在一个实施方案中，卵母细胞通过输卵管恢复法或经阴道恢复法分离。在优选的实施方案中，卵母细胞通过吸出分离。卵母细胞有代表性地在去核之前在本领域技术人员已知的多种介质中成熟。卵母细胞还可以从新近处死动物的卵巢分离，或者当卵巢已经被冰冻和/或解冻时分离。优选地，卵母细胞从输卵管新鲜地分离。卵母细胞或胞质体还可以在使用之前冷冻保存。虽然本领域技术人员应当认识到，新分离和成熟的卵母细胞是优选的，但是也应当认识到，可以在收获之后或者在成熟之后冷冻保存卵母细胞。如果利用冷冻保存的卵母细胞，则必须在将卵母细胞置于成熟培养基中之前将它们最初解冻。解冻冷冻保存的材料以致于它们在解冻过程之后是具有活性的方法是本领域普通技术人员众所周知的。然而，通常，卵母细胞和胞质体的冷冻保存是要求极高的过程，并且其在猪中特别困难，这是因为上述提到过猪卵母细胞和胞质体通常脆弱， 并且因为高脂质含量使得它们对低温冻害极其敏感(即在降温和升温步骤过程中，在+15 和+5°C之间出现的伤害)。在另一实施方案中，已经体内成熟的成熟(中期II)卵母细胞将被收取并用于本文所述的核转移方法中。实质上，成熟中期II卵母细胞从非超排卵哺乳动物或者从发情开始或者注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或相似激素后35至48小时后的超排卵哺乳动物通过手术收集。在卵母细胞已经体外培养情况下，体内包绕卵母细胞的卵丘细胞将积累并去除以提供处于更适宜成熟阶段的卵母细胞用于去核。卵丘细胞将在例如0. 1至5%范围透明质酸酶、例如0. 2至5%范围透明质酸酶、例如0. 5至5%范围透明质酸酶、例如0. 2至3%范围透明质酸酶、例如0. 5至3%范围透明质酸酶、例如0. 5至2%范围透明质酸酶、例如0. 5 至范围透明质酸酶、例如0. 5%透明质酸酶存在下通过移液或涡旋去除。优选方法中的第一个步骤涉及从适宜动物分离受体卵母细胞。为此，卵母细胞可从任何动物来源得到并且处于任何成熟阶段。已经报导在去核和核转移时卵母细胞的成熟阶段对于核转移方法的成功是至关重要的。来自哺乳动物卵巢的未成熟(前期I)卵母细胞常常通过吸出收集。为了采用技术如遗传工程、核转移和克隆，在卵母细胞将用作核转移受体细胞之前，此种收集的卵母细胞优选体外成熟。优选地，成功的哺乳动物胚胎克隆使用中期II阶段卵母细胞作为受体卵母细胞， 因为据信在该阶段成熟的卵母细胞可被或被充分活化以将所引入细胞核看作是它似乎是一个受精的精子。然而，本发明涉及适宜开展体细胞核转移的任何成熟阶段的卵母细胞、可通过本发明体细胞核转移方法得到的胚胎、胚泡和/或动物。卵母细胞的体外成熟通常在成熟介质中发生直到卵母细胞已经达到中期II阶段或者已经挤出第一极体。未成熟卵母细胞达到成熟的时间称作成熟期。在本发明优选的实施方案中，卵母细胞来自大母猪或者小母猪，优选来自大母猪。胚胎根据本发明，重构胚胎(即单细胞胚胎)包含供体细胞的遗传物质。随后，重构胚胎在开始有丝分裂后进行性地分裂成为多细胞胚胎。有丝分裂的体外起始有代表性地通过如本文所述的活化诱导。在本发明中，术语“胚胎”还指重构胚胎，其是在通过活化诱导有丝分裂开始后的核转移过程后形成的胚胎。重构胚胎体外培养。当胚胎包含大约12-16个细胞时，称作“桑椹胚”。随后，胚胎进一步分裂并形成许多细胞，并在其中心具有充满流体的囊腔，即囊胚腔。在该阶段，胚胎被称作“胚泡”。此时， 处于容易移植阶段的发育阶段的“受精的”卵母细胞从桑椹胚形成并由内细胞团、内腔和称作滋养外胚层细胞的外层细胞构成。根据本发明的胚泡可以移植入宿主哺乳动物的子宫并持续生长成胎儿，然后生长成动物。在本文提供的用于产生基因修饰或转基因非人哺乳动物、用于克隆非人哺乳动物、用于培养重构胚胎和/或用于冷冻保存猪胚胎的方法中，胚胎可以体外培养。胚胎可以例如以连续培养进行培养。应当意识到，胚胎可以是正常胚胎或者重构胚胎，如本文别处所定义。胞质体已经去除核的卵母细胞或卵母细胞部分。供体细胞本发明的术语“供体细胞”意思是指体细胞和/或从种系衍生的细胞。本发明的术语“体细胞”意思是指来自任何发育阶段动物的任何“身体”细胞。例如体细胞可以源于胎儿或成体组织。特别优选的体细胞是胎儿起源的体细胞。然而，来自种系的细胞也可以使用。根据本发明，供体细胞是体细胞。在本发明的另一实施方案中，供体细胞是从生殖细胞系衍生的细胞。在本发明优选的实施方案中，供体细胞具有预期特性。然而，供体细胞可具有通过如本文别处所述遗传操作获得的预期特性。体细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、 软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌肉细胞。这些细胞可以从不同器官得到，例如皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、 膀胱、肾、尿道和其它泌尿器官。可从中获取体细胞的动物在本文别处描述。本发明的优选实施方案是使用来源于与作为受体卵母细胞(胞质体)同一物种的体细胞。优选地，体细胞是可以从发育中的胎儿和成体动物两者大量获得的成纤维细胞。 此外，成纤维细胞可以容易地体外繁殖。最优选地，体细胞是胎儿来源的体外培养的成纤维细胞。在优选的实施方案中，体细胞是基因修饰的。在本发明的仍然进一步的优选的实施方案中，体细胞是猪细胞，并且优选胎儿来源，或者如来自成体。转基因细胞系本发明还涉及本文所述任何转基因动物来源的细胞系。因此，本发明的细胞系包含至少一种核酸序列，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或 ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。特别的报告多肽、核受体、融合多肽、启动子等实例在本文别处提供。组织本发明提供转基因动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，以及用于评价物理和/或化学剂在组织中对组织核受体影响的方法和用途。本发明可以在多种组织上实施。在一个实施方案中，组织选自皮肤、肌肉、肝、肺、肿瘤和角膜。在另一实施方案中，组织选自皮肤、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤。在优选实施方案中，本发明方法涉及皮肤组织，即所述组织是皮肤。在特别优选的实施方案中，本发明方法涉及表皮组织，即所述组织是表皮。在另一特别优选的实施方案中，本发明方法涉及真皮组织，即所述组织是真皮。本发明的核受体传感器系统可以在多种组织中表达。根据本发明用于检测核受体活化的优选组织是皮肤。皮肤包含两个主要层，即表皮和真皮，其位于下皮(皮下的组织)上面，包含成纤维细胞、脂肪细胞和巨噬细胞。上面的皮肤层即表皮由成层的上皮细胞组成，其中细胞通过最深层有丝分裂形成并迁移至表面替代连续不断脱掉的细胞。通过表皮层的迁移使细胞改变形状和组成，因为它们在称作角质化的过程中分化并变得充满角蛋白。最外层的表皮由大约25层死细胞组成。表皮可以分成5个不同层角质层、透明层、颗粒层、棘层和生发层(或基底层、基层)。角质层由死亡的去核角质形成细胞组成， 其中交联的结构蛋白提供机械保护。在下层颗粒层中的角质形成细胞合成形成几乎水不透性屏障即透性屏障所需的大量脂质。构成透性屏障的脂质主要是胆固醇、脂肪酸和神经酰胺。脂质在颗粒层完全分化角质形成细胞内的大量包含脂质的板层小体中装配，然后通过胞吐作用释放。在释放后，脂质被加工和重组织以形成连续的层状单位结构基质，构成功能透性屏障(Madison, K. C. (2003). Barrier function of the skin “ la raison d' ete" of the epidermis. J Invest Dermatol 121:231-241)。透性屏障防止身体失水，但是同时它降低了对通过局部应用所施用生物学活性分子的吸收。多种基于脂质体的制剂已经用于通过皮肤递送药物，并且基于所谓柔韧脂质体的新制剂已经证明能深入渗透并有效进入皮肤。Application of vesicles to rat skin in vivo :a confocal laser scanning microscopy study. J Control Release 56 :189-96 ；van Kuijk—Meuwissen， Μ. E.，Junginger, H. Ε. and Bouwstra, J. A. (1998). Interaction between liposomes and human skin in vitro,a confocal laser scanning microscopy study. Biochim Biophys Actal371 :31-9.)。最近，纳米颗粒也考虑作为获得有效皮肤渗透的载体。真皮是表皮下面的皮肤层。真皮由结缔组织组成并且使身体抵抗不同类型的压力和拉力。真皮还包含神经纤维用于触觉和热觉。其还包含毛囊、汗腺、皮脂腺、顶泌腺和血管。血管向真皮细胞以及表皮的生发层提供营养并带走废物。关于不同层皮肤中核受体活化的信息可以通过将本发明的核受体传感器系统靶向转基因动物，如转基因克隆猪的皮肤中得到，由此建立对于人皮肤的体内模型。猪皮肤的组织结构与人皮肤相似，因此使得猪皮肤成为人皮肤的良好模型。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的核受体传感器系统整合入皮肤组织内。 在另一优选的实施方案中，根据本发明的核受体传感器系统整合入表皮组织内。在另一优选的实施方案中，根据本发明的核受体传感器系统整合入真皮组织内。试剂和化合物本发明提供用于评价试剂在动物组织内影响的方法。本发明还涉及用于测试化合物改变试剂在动物组织内影响的能力的方法。根据本发明的试剂和/或化合物包含任何可能的物理或化学试剂、化合物、混合物、复合物、复合体、物质、材料、物品、颗粒、元素、单元、成分或制剂。在一个实施方案中，试剂和/或化合物是药物组合物、化妆品、药物、异生素化合物、食物成分、糖、脂质、蛋白质、 膳食补充剂、辐射或电刺激。在优选的实施方案中，试剂和/或化合物是异生素化合物。术语“异生素化合物” 如本文所使用指不是所接触生物体的天然成分的任何化学化合物。异生素化合物也称作外来或外源物质或化合物。异生素化合物还涵盖以比通常高得多的浓度出现的天然存在物质。异生素化合物实例包括但不限于天然存在化合物、药物、抗生素、环境试剂、污染物如二恶英和多氯联苯、致癌物和杀虫剂。在优选的实施方案中，试剂和/或化合物是维生素D类似物。在另一优选的实施方案中，试剂和/或化合物是辐射，包括紫外线辐射(UV-辐射)、红外线辐射、电磁辐射、伽玛-辐射(Y -辐射)、Χ"射线和日晒。在特别优选的实施方案中，试剂和/或化合物是UV-辐射。在另一优选的实施方案中，试剂和/或化合物是化妆品，例如皮肤洗剂、防晒洗剂或防晒隔离洗剂。更加具体而言，在一个实施方案中，试剂是UV-辐射，例如UV-C辐射并且化合物是防晒洗剂或防晒乳。以该方式，本发明的转基因动物、细胞、方法和用途可以用于评价防晒洗剂/防晒组合物抵抗UV-辐射对组织如皮肤组织内核受体活性的影响的能力。本发明的试剂和化合物包含任何形状、大小或构象。在一个实施方案中，试剂是流体、结晶、溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒或纳米颗粒形式。具体应用本发明的方法、动物和细胞系可用于许多具体应用。在一个实施方案中，本发明的方法、动物和细胞系可用于评价物理或化学试剂在组织，例如皮肤组织中对特定核受体活化的影响。此种影响可用于解释试剂穿透特定组织的能力。本发明的该方面涵盖着评价试剂在动物组织内影响的方法，包括a.提供转基因动物，包含至少一种核酸序列，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或 .另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b.向所述动物施用所述试剂，和c.评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中所述表达产物在步骤(b)之前和之后的改变表明对所述组织有影响。在另一实施方案中，本发明的方法、动物和细胞系可用于评价化合物抵抗或增强物理或化学试剂在组织中影响的能力。在一个实施方案中，此种化合物是防晒洗剂。本发明的该方面被用于测试化合物改变试剂在动物组织内影响能力的方法所涵盖，所述方法包括a.向转基因动物施用所述化合物，转基因动物包含至少一种核酸序列，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物， b.向所述转基因动物施用所述试剂，和c.评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中在所述化合物存在和缺乏下所述表达产物量的差异表明所述化合物能够改变所述试剂在所述组织内的影响。该后一方面的化合物可以是如本文别处所详细说明的任何物理或化学试剂。在一个实施方案中，化合物选自药物组合物、化妆品、药物、异生素化合物、食物成分、糖、脂质、膳食补充剂、辐射和/或电刺激。在特定实施方案中，化合物是溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒和/或纳米颗粒形式。在优选的实施方案中，化合物是防晒洗剂。 在另一实施方案中，后一方面的试剂是辐射，例如试剂是UV-辐射。因此，在一个方面中，本发明涉及本发明的非人转基因动物、细胞系、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞和/或细胞核用于评价核受体活性的用途。在优选的实施方案中，用途涉及评价试剂，如上面所定义的试剂对核受体活性的影响。因此，本发明的动物、细胞系、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞和/或细胞核可用于通过比较在所述试剂存在和缺乏下报告转录物和/或多肽的表达来评价物理或化学试剂对核受体活性的影响，如本文别处所描述的那样。在另一实施方案中，用途涉及体内评价因内源激动剂而引起的核受体活性，例如因在正常皮肤发育过程中产生的激动剂而引起的核受体活性。以这种方式，可以通过检测报告转录物和/或多肽的时空表达评价特定核受体的时空活化。然而，在特定实施方案中，内源激动剂在疾病，例如银屑病、不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病发展过程中产生。实施例为了得到关于不同皮肤层中核受体活化的信息，设计了可以靶向转基因克隆猪皮肤的基因报告系统，以建立人皮肤的替代体内模型。核受体传感器系统可用于三个目的。首先，本发明可以用于检查不同类型脂质体或其它制剂转运化合物进入皮肤的能力。通过以包含核受体激活剂的制剂处理皮肤，报告基因的活化将反映出制剂的穿透能力。第二，传感器-细胞系统使得可以检查多种异生素穿透进入表皮的能力。最后，传感器-细胞系统还使得可以测定正常发育和皮肤稳态过程中和/或不同疾病阶段过程中因内源激动剂的产生所引起的核受体活化。实施例1核受体传感器系统报告基因系统由含有驱动报告基因表达的增强子/启动子的盒组成。使用常规 P-半乳糖苷酶基因，因此使得对表达的酶性检测简单。随后，使用基于绿色荧光蛋白(或绿色荧光蛋白的多种衍生物)的报告子使得能够通过共聚焦和多光子荧光显微镜进行直接荧光检测。增强子/启动子是酵母UAS (gal)增强子或细菌LexA结合位点与胸苷激酶启动子融合的常规组合。为活化这些报告基因系统，酵母GAL4 DNA结合结构域或LexA DNA结合结构域与视黄酸受体、维生素D受体、肝X受体配体的结合结构域之间的融合活化混杂孕烷X受体并且将使用PPAR。为了保证皮肤-特异性表达，这些构建体的启动子区将被已知驱动表皮特异性表达的角蛋白14增强子/启动子取代。为了产生传感器细胞系和转基因克隆猪，使用PXR-众多异生素的可能靶标-还有PPAR δ -在人表皮中表达的主要PPAR亚型-维生素D受体-已知在银屑病治疗中的药物靶标-和视黄酸受体-经验证的皮肤靶标和皮肤稳态的调节者。实施例2转基因猪作为测试药物和异生素穿透入皮肤的模型猪皮肤是人皮肤的良好模型。转基因猪通过从遗传工程改造的纤维细胞向卵胞质体的体细胞核转移克隆而来。通过这种方法，本发明描述的基因报告系统整合入基因组以得到转基因报告猪。此外，将产生这样的转基因猪品种，即其中GAL4 DNA结合结构域或LexADNA结合结构域与PXR、视黄酸受体、维生素D受体和PPAR的配体结合结构域的融合物被整合入基因组并且通过使用驱动皮肤-特异性表达的K14增强子/启动子在表皮的基细胞中表达。转基因报告猪与转基因K14-核受体转基因猪的杂交将产生传感器猪品种。这些传感器猪品种可以用于确定因正常皮肤发育过程中所产生内源激动剂的产生导致的活化。此外，传感器猪品种还可用于研究原位皮肤渗透性和核受体被异生素的活化。随后如下所述开展皮肤渗透性分析。如通过核受体活化所测定，分析例如不同制剂促进测试化合物进入皮肤的渗透性以及不同异生素的渗透性。可以测定响应于接触不同制剂中所选择药物和异生素的核受体的空间活化。所读出的是通过免疫组织化学检测的报告基因表达的酶的诱导或者通过共聚焦荧光和/或多光子激发荧光显微镜检测的报告基因表达的荧光蛋白的诱导。此外，不同脂质体和纳米颗粒制剂在皮肤中的渗透性可以通过共聚焦荧光和/或外部荧光探针的多光子激发荧光显微镜直接检查，由此可以得到制剂的空间分布与皮肤结构之间的直接相互关系。共聚焦荧光和/或多光子激发荧光显微镜已经成功地用于确定关于皮肤的动力学和结构信息。例如，这两种技术的剖切能力对于以无创方式，例如通过使用天然存在或者外部荧光探针解开皮肤组织的复杂3D结构是非常有用的。对动物和人皮肤真皮和皮下结构的体内和间接体内成像均可用于此目的。实施例3传感器受体系统的瞬时体外转染HEK 细胞以 1. 0 μ g 载体 pT2/UAS-d2eGFP 或 1. 0 μ g pM/hVDR 或 Gal4VP16 转染。 在转染前12小时、向细胞提供维生素D类似物，转染时不提供，并且在转染后3小时再次提供。在转染后M小时通过荧光显微镜和流式细胞术分析细胞，见图2-4。载体描述PT2/UAS-d2eGFP包含处于最小胸苷激酶(TK)启动子控制下的带有非稳定GFP和 UAS元件的传感器组件。pM/hVDR和Gal4VP16分别包含融合至fell 4的UAS结合区的hVDR或VP16。VP16 是组成型活性的，而hVDR需要配体结合以作为转录活化剂起作用。序列SEQ ID NO 1Gal4 DBD Atgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaa gaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgct gactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgag aagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagat aatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatag aataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgSEQ ID NO 2hVDR LBD aagcggaaggaggaggaggccttgaaggacagtctgcggcccaagctgtctgaggagcagcagcgcatc attgccatactgctggacgcccaccataagacctacgaccccacctactccgacttctgccagttccggcctccagttcgtgtgaatgatggtggagggagccatccttccaggcccaactccagacacactcccagcttctctggggactcct cctcctcctgctcagatcactgtatcacctcttcagacatgatggactcgtccagcttctccaatctggatctgagt gaagaagattcagatgacccttctgtgaccctagagctgtcccagctctccatgctgccccacctggctgacctggt cagttacagcatccaaaaggtcattggctttgctaagatgataccaggattcagagacctcacctctgaggaccaga tcgtactgctgaagtcaagtgccattgaggtcatcatgttgcgctccaatgagtccttcaccatggacgacatgtcc tggacctgtggcaaccaagactacaagtaccgcgtcagtgacgtgaccaaagccggacacagcctggagctgattga gcccctcatcaagttccaggtgggactgaagaagctgaacttgcatgaggaggagcatgtcctgctcatggccatct gcatcgtctccccagatcgtcctggggtgcaggacgccgcgctgattgaggccatccaggaccgcctgtccaacaca ctgcagacgtacatccgctgccgccacccgcccccgggcagccacctgctctatgccaagatgatccagaagctagc cgacctgcgcagcctcaatgaggagcactccaagcagtaccgctgcctctccttccagcctgagtgcagcatgaagc taacgccccttgtgctcgaagtgtttggcaatgagatctcctgaSEQ ID NO 34 X UASCaaggcggagtactgtcctccgggctggcggagtactgtcctccggcaaggtcggagtactgtcctccg acactagaggtcggagtactgtcctccgacgSEQ ID NO 4最小TK启动子Gtggccgccccgactgcatctgcgtgttcaaattcgccaatgacaagacgctgggcggggtttgtgtc atcatagaactaaagacatgcaaatatatttcttccggggacaccgccagcaaacgcgagcaacgggccacgggga tgaagcagSEQ ID NO 5d2eGFPatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgta aacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctg caccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctggggcgtgcagtgcttcagccgct accccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagct gaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacatcagccacaacgtct atatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtg cagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgag cacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccg ggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaagSEQ ID NO 6RIR(T2-2.代)agtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctct ctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttacta ggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaac tgSEQ ID NO 7
LIR(T2-2.代)项目下列项目定义本发明的优选的实施方案。第1项.用于评价试剂在动物组织内影响的方法，包括a.提供转基因动物，包含至少ー种核酸序列，其中i.所述至少ー种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受 体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b.向所述动物施用所述试剂，和c.评价编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物，其中所述表达产物在步骤(b)之前和之后发生改变表明对所述组织有影响。第2项.根据第1项的方法，其中所述试剂是任何物理或化学试剂。第3项.根据第1项的方法，其中所述试剂是药物组合物、化妆品、药物、异生素化 合物、食物成分、糖、脂质、蛋白质、膳食补充剂、福射、电刺激。第4项.根据第3项的方法，其中所述试剂是溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒、纳米颗 粒形式。第5项.根据前述任意ー项的方法，其中所述组织选自皮肤、表皮、真皮、下皮、月旨 肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤。第6项.根据前述任意ー项的方法，其中所述组织是皮肤。第7项.根据前述任意ー项的方法，其中所述组织是表皮。第8项.根据前述任意ー项的方法，其中所述组织是真皮。第9项.根据前述任意ー项的方法，其中所述动物选自人、非人灵长类动物、猪、迷 你猪、微型猪、小鼠、大鼠和哨齿类动物。第10项.根据前述任意ー项的方法，其中所述动物是人。第11项.根据前述任意ー项的方法，其中所述转基因动物是猪。第12项.根据前述任意ー项的方法，其中所述转基因动物是小鼠。第13项.根据前述任意ー项的方法，其中所述报告多肽或其片段包含可检测产 物。第14项.根据第13项的方法，其中所述报告多肽或其片段包含可视觉检测、光学 检测或放射自显影检测的产物。第15项.根据前述任意ー项的方法，其中所述报告多肽选自0-半乳糖苷酶、 HcRecU DsRecU DsRed单体、ZsGreen. AmCyan、むれ110*、萤火虫萤光素酶、Iac 2、海肾萤光 素酶、5￡六 、增强绿色焚光蛋白(66ド )、42￡6ド 、增强蓝色焚光蛋白(68ド )、增强黄色焚光 蛋白(6￥ド )、和6ド じ 、增强青色焚光蛋白(6〔ド )、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚焚光蛋 白、人a-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修饰物或功能变体.
第16项.根据前述任意一项的方法，其中所述报告多肽是β -半乳糖苷酶。第17项.根据前述任意一项的方法，其中所述评价包括通过选自酶学和分光镜学测定、共聚焦和多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、引物延伸和DNA阵列技术的任何技术检测。动子。
第18项.根据前述任意一项的方法，其中编码报告多肽的所述核酸序列前面是启
第19项第20项第21项第22项第23项,
菌LexA结合位点(第M 项第25 项·
根据第18项的方法，其中所述启动子是异源性启动子。 根据第18项的方法，其中所述启动子是可诱导启动子。 根据第18项的方法，其中所述启动子是胸苷激酶启动子。 根据前述任意一项的方法，其中所述启动子还包含增强子元件。 根据第22项的方法，其中所述增强子元件选自酵母UASgal增强子和细
根据第23项的方法，其中所述增强子元件是酵母UASgal增强子。 根据前述任意一项的方法，其中所述融合多肽包含核受体或其部分插入 DNA结合结构域或其部分内和/或插入在DNA结合结构域或其部分的N-末端和/或C-末端。第沈项.根据前述任意一项的方法，其中所述融合多肽包含核受体或其部分插入在DNA结合结构域或其部分的C-末端。
的表达t
第27项.根据前述任意一项的方法，其中所述融合多肽的表达促进所述报告多肽
第观项第四项第30项
根据前述任意一项的方法，其中所述另外的核酸序列前面是启动子。 根据第观项的方法，其中所述启动子是可诱导启动子。 根据第观项的方法，其中编码偶联至DNA结合结构域的核受体的另外的所述核酸序列从组织-特异性启动子表达。 第31项.根据第30项的方法，其中所述组织-特异性启动子对选自皮肤、表皮、 真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、 角膜和/或肿瘤的组织是特异的。
第32项.根据第30项的方法，其中所述启动子是皮肤-特异性启动子。
根据第观项的方法，其中所述启动子是角蛋白14增强子/启动子。 根据第观项的方法，其中所述启动子包含增强子元件。 根据第观项的方法，其中所述启动子包含光可诱导序列。 根据第观项的方法，其中所述启动子包含化学可诱导序列。 根据前述任意一项的方法，其中所述核受体或其部分包含核受体配体结个片段。
.根据前述任意一项的方法，其中所述核受体是甲状腺激素受体- a (TRa ；NRlAl，THRA)、甲状腺激素受体-β (TRβ ；NR1A2, THRB)、视黄酸受体-a (RARa ；NR1B1, RARA)、视黄酸受体-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、视黄酸受体-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)、过氧化物酶体增殖物激活受体_ a (PPAR α ；NRlCl，
第33项第；34项第35项第36项第37项.
合结构域的至少-
第 38 项PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、过氧化物酶体增殖物激活受体-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA α (Rev-ErbA α ；NR1D1)、 Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相关孤儿受体-α (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相关孤儿受体-β (R0R β ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受体-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受体-β (LXR β ； NR1H2)、法尼醇X受体(FXR ；NR1H4)、维生素D受体(VDR ；NRlIl, VDR)(维生素D)、孕烷X 受体(P)CR ;NR1I2)、组成型雄烷受体(CAR;NR1I3)、肝细胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝细胞核因子-4-γ (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G)、类视黄醇 X 受体-a (RXRa ；NR2B1, RXRA)、类视黄醇 X 受体-β (RXR β ；NR2B2，RXRB)、类视黄醇 X 受体-Y (RXR Y ；NR2B3， RXRG)、睾丸受体2(TR2 ；NR2C1)、睾丸受体4 (TR4 ；NR2C2)、果蝇tailless基因的人同系物(TLX;NR2E1)、感光细胞-特异核受体(PNR;NR2E3)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)、6 V-erbA-相关(EAR-2 ;NR2F6)、雌激素受体-a (ERa ；NR3A1，ESR1)、雌激素受体-β (ERβ ； NR3A2，ESR2)、雌激素相关受体-a (ERRa ； NR3B1, ESRRA)、雌激素相关受体-β (ERR β ； NR3B2, ESRRB)、雌激素相关受体-γ (ERRy ； NR3B3, ESRRG)、糖皮质激素受体(GR ；NR3C1) (皮质醇)、盐皮质激素受体(MR ；NR3C2)(醛固酮)、孕酮受体O3R ；NR3C3,PGR)(性激素孕酮)、雄激素受体(AR ；NR3C4, AR)(性激素睾酮)、神经生长因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受体相关1 (NURR1 ；NR4A2)、神经元衍生的孤儿受体1 (N0R1 ；NR4A3)、类固醇生成因子1 (SFl ； NR5A1)、肝受体同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、精细胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (剂量敏感性性反转，肾上腺发育不全关键区，在X染色体上，基因I(NROBl))、小异二聚体伴侣(SHP ； NR0B2)或具有两个DNA结合结构域的核受体QDBD-NR)。 第39项.根据前述任意一项的方法，其中所述核受体选自维生素D受体、肝X受体、视黄酸受体、类视黄醇X受体、混杂孕烷X受体和过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)，包括 PPAR a、PPAR β / δ、PPAR γ。第40 项根据前述任意一项的方法，其中所述核受体选自PPAR。第41 项根据前述任意一项的方法，其中所述核受体是PPARS。第42 项根据前述任意一项的方法，其中所述核受体是混杂孕烷X受体。第43 项 根据前述任意一项的方法，其中所述DNA结合结构域选自GAL4DNA结合
结构域和LexA DNA结合结构域。第44项.根据前述任意一项的方法，其中所述施用包括经口，包括颊和舌下、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内施用或通过吸入或吹入施用。第45项根据前述任意一项的方法，其中所述施用是局部施用。第46项根据前述任意一项的方法，其中所述施用是肺施用。 第47项根据前述任意一项的方法，其中所述表达产物包含RNA和/或多肽。第48项.根据前述任意一项的方法，其中所述转录产物和/或翻译产物的评价在
活动物中开展。第49项.根据前述任意一项的方法，其中所述转录产物和/或翻译产物的评价在无需从活动物中取出组织的情况下开展。第50项.根据前述任意一项的方法，其中所述转录产物和/或翻译产物的评价在从动物取出的样品上开展。第51项.根据第50项的方法，其中所述样品选自皮肤组织包括表皮和真皮组织、 乳腺组织、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和/或汗液。第52项.根据前述任意一项的方法，还包括向组织重复施用试剂。第53项.根据前述任意一项的方法，还包括至少一个另外的评价步骤。第讨项.根据第53项的方法，其中评价步骤分开至少1、2、3、4、5、10、20、30、60、 180,365 或 700 天。第55项.用于测试化合物改变试剂在动物组织内影响的能力的方法，包括a.向包含至少一种核酸序列的转基因动物施用所述化合物，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物，b.向所述转基因动物施用所述试剂，和c.评价编码报告多肽的核酸序列的转录表达产物和/或翻译表达产物，其中在所述化合物存在和缺乏下所述表达产物量的差异表明所述化合物能够改变所述试剂在所述组织内的影响。第56项.根据第55项的方法，如第2项至第M项中任意一项所定义。第57项.根据第55项和第56项中任意一项的方法，其中所述化合物是任何物理或化学试剂。第58项.根据第57项的方法，其中所述化合物是药物组合物、化妆品、药物、异生素化合物、食物成分、糖、脂质、膳食补充剂、辐射或电刺激。第59项.根据第57项和第58项中任意一项的方法，其中所述化合物是溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒、纳米颗粒形式。第60项.根据第55项和第59项中任意一项的方法，其中所述化合物是防晒洗剂。第61项.根据第55项至第60项的方法，其中所述试剂是辐射。第62项.根据第61项的方法，其中所述试剂是UV-辐射。第63项.包含至少一种核酸序列的转基因动物，其中i.所述至少一种核酸序列编码报告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列编码融合多肽，融合多肽包含偶联至DNA结合结构域的核受体或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。第64项.根据第63项的转基因动物，用于评价试剂对组织的影响。第65项.根据第63项的转基因动物，其中所述动物选自猪、小鼠、大鼠、啮齿类动物、狗、猴、豚鼠、迷你猪和微型猪。第66项.根据第63项的转基因动物，其中所述动物是猪。第67项.根据第63项的转基因动物，其中所述动物是小鼠。第68项.根据第63项至第67项任意一项的转基因动物，其中所述报告多肽选自 β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed 单体、ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、SEAP、EGFP、EBFP, EYFP、d2EGFP和GFPuv、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白和/或其片段、修饰物或功能变体。第69项.根据第63项至第68项任意一项的转基因动物，其中所述报告多肽是 β-半乳糖苷酶或其片段或功能变体。第70项.根据第63项至第69项任意一项的转基因动物，其中所述核受体选自维生素D受体、肝X受体、混杂孕烷X受体和PPAR，或其片段。第71项.根据第63项至第70项任意一项的转基因动物，其中所述DNA结合结构域选自GAL4 DNA结合结构域和LexA DNA结合结构域。第72项.根据第66项的转基因猪，包含至少一种核酸序列，其中a.所述至少一种核酸序列编码β -半乳糖苷酶或其部分，和/或b.另外的核酸序列编码融合多肽，包含偶联至酵母GAL4 DNA结合结构域的 PPAR δ或其部分，或所述另外核酸序列的转录或翻译产物。第73项.根据第63项至第72项任意一项的转基因动物，用于体内测定因内源激动剂的产生所引起的核受体活化。第74项.根据第73项的转基因动物，其中所述激动剂在皮肤正常发育过程中产生。第75项.根据第73项的转基因动物，其中所述内源激动剂在疾病，例如银屑病、 不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病发展过程中产生。第76项.根据第75项的转基因动物，其中所述疾病是银屑病。第77项.根据第63项至第76项任意一项的转基因动物，用于测定试剂在组织内的原位穿透性和/或核受体被第2项至第4项中任意一项所定义试剂的活化。第78项.从根据第63项至第77项任意一项的转基因动物衍生的细胞系。
权利要求
1.转基因动物，包含1.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和 .至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点，和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。
2.根据权利要求1的转基因动物，其中所述非人转基因动物是猪。
3.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述非人转基因动物选自猪、迷你猪、 微型猪、小鼠、大鼠、非人灵长类动物和啮齿类动物。
4.根据任一项前述权利要求的转基因动物，包含a.至少一种编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含偶联至酵母GAL4DNA结合结构域的PPAR δ或其部分，和/或b.至少一种编码半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。
5.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述核受体或其部分包含核受体的配体结合结构域或其片段。
6.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述核受体是甲状腺激素受体-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲状腺激素受体-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、视黄酸受体-a (RARa ；NR1B1, RARA)、视黄酸受体-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、视黄酸受体-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)、过氧化物酶体增殖物激活受体_ a (PPAR α ；NRlCl， PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体-β / δ (PPARβ / δ ；NR1C2, PPARD)、过氧化物酶体增殖物激活受体-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA a (Rev-ErbA α ；NR1D1)、 Rev-ErbAβ (Rev-ErbAβ ；NR1D2)、RAR-相关孤儿受体-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相关孤儿受体-β (R0Rβ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受体-a (LXRa ；NR1H3)、肝 X 受体-β (LXRβ ； NR1H2)、法尼醇X受体(FXR ；NR1H4)、维生素D受体(VDR ；NRlIl, VDR)(维生素D)、孕烷X 受体(PXR;NR1U)、组成型雄烷受体(CAR;NR1I3)、肝细胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝细胞核因子-4-γ (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G)、类视黄醇 X 受体-a (RXRa ；NR2B1, RXRA)、类视黄醇 X 受体-β (RXR β ；NR2B2，RXRB)、类视黄醇 X 受体-Y (RXR Y ；NR2B3， RXRG)、睾丸受体2 (TR2 ；NR2C1)、睾丸受体4 (TR4 ；NR2C2)、果蝇tai 1 less基因的人同系物(TLX;NR2E1)、感光细胞-特异核受体(PNR ；NR2E3)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)、6 V-erbA-相关(EAR-2 ;NR2F6)、雌激素受体-a (ERa ；NR3A1，ESR1)、雌激素受体-β (ERβ ； NR3A2，ESR2)、雌激素相关受体-a (ERRa ； NR3B1, ESRRA)、雌激素相关受体-β (ERR β ； NR3B2, ESRRB)、雌激素相关受体-γ (ERRy ； NR3B3, ESRRG)、糖皮质激素受体(GR ；NR3C1) (皮质醇)、盐皮质激素受体(MR ；NR3C2)(醛固酮)、孕酮受体(PR ；NR3C3，PGR)(性激素孕酮)、雄激素受体(AR ；NR3C4, AR)(性激素睾酮)、神经生长因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受体相关1 (NURR1 ；NR4A2)、神经元衍生的孤儿受体1 (N0R1 ；NR4A3)、类固醇生成因子1 (SFl ； NR5A1)、肝受体同系物-1(LRH-1 ；NR5A》、精细胞核因子(GCNF ;NR6A1)、DAXl (剂量敏感性性反转，肾上腺发育不全关键区，在X染色体上，基因I(NROBl))、小异二聚体伴侣(SHP ； NR0B2)或具有两个DNA结合结构域的核受体QDBD-NR)。
7.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述核受体选自维生素D受体、肝X受体、视黄酸受体、类视黄醇X受体、混杂孕烷X受体和过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)，包括 PPAR α、PPAR β / δ、PPAR γ。
8.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述DNA结合结构域是GAL4DNA-结合结构域、LexA DNA-结合结构域和/或其部分。
9.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分从诱导型和/或组织-特异性启动子表达。
10.根据权利要求9的转基因动物，其中所述组织-特异性启动子对选自皮肤、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和/或肿瘤的组织具有特异性。
11.根据权利要求9的转基因动物，其中所述启动子是角蛋白14增强子/启动子。
12.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分物理性或化学性偶联。
13.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列还包含至少一种酵母上游活化序列(UASgal)、细菌 LexA结合位点和/或其部分。
14.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中编码可检测报告转录物或报告多肽的所述核酸序列从异源性启动子和/或诱导型启动子表达。
15.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中在对所述核受体特异的配体存在下所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的表达促进所述报告多肽的表达。
16.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述报告转录物、多肽或其片段包括可视觉检测、光学检测或放射自显影检测的产物。
17.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述报告多肽选自半乳糖苷酶、 HcRed, DsRed, DsRed 单体、ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、萤火虫萤光素酶、lac Z、海肾萤光素酶、SEAP、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增强蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强黄色荧光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增强青色荧光蛋白(eCFP)、青色、绿黄、红色和远红色礁珊瑚荧光蛋白、人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修饰物或功能变体。
18.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述报告多肽是半乳糖苷酶。
19.根据任一项前述权利要求的转基因动物，其中所述报告转录物或报告多肽的所述表达可通过选自酶测定或光谱测定、共聚焦或多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、 酶联免疫吸附测定(ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、引物延伸和DNA阵列技术的任何技术检测。
20.一种评价试剂对非人动物组织内核受体活性的影响的方法，所述方法包括a.提供如前述权利要求1至19中任一项所述的非人转基因动物，b.向所述转基因动物施用试剂，和c.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达表示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。
21.用于检测化合物改变试剂对非人动物组织内核受体活性的影响的能力的方法，包括a.提供如前述权利要求1至19中任一项所述的非人转基因动物，b.向所述转基因动物施用所述化合物，c.向所述转基因动物施用所述试剂，和d.检测编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的所述核酸序列在所述动物中的表达，其中在施用所述试剂后所述表达表示所述试剂对所述组织内核受体活性的影响。
22.根据前述权利要求20至21任一项的方法，其中编码报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列的表达在所述试剂和/或化合物存在和缺乏下检测。
23.根据前述权利要求20至22任一项的方法，其中在所述试剂存在下与在缺乏所述试剂下相比a.所述报告转录物或报告多肽表达升高表示所述试剂对所述核受体的活性具有刺激性影响，b.所述报告转录物或报告多肽表达降低表示所述试剂对所述核受体的活性具有抑制性影响，和c.所述报告转录物或报告多肽表达未改变表示所述试剂对所述核受体的活性不具有或者具有很小的影响。
24.根据前述权利要求20至23任一项的方法，其中在所述化合物存在下与在所述化合物缺乏下相比a.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响升高表示所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响具有刺激性影响，b.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响降低表示所述化合物对所述试剂对核受体活性的影响具有抑制性影响，和c.所述试剂对所述报告转录物或报告多肽表达的影响很小或未改变表示所述化合物对所述试剂对所述核受体活性的影响不具有或者具有很小的影响。
25.根据权利要求20至M任一项的方法，其中所述核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的表达促进所述报告多肽的表达。
26.根据权利要求20至25任一项的方法，其中编码报告多肽的核酸序列的表达通过检测编码报告多肽的核酸序列的转录和/或翻译表达产物检测。
27.根据权利要求20至沈任一项的方法，其中所述报告转录物或报告多肽表达的检测包括通过选自酶测定或光谱测定、共聚焦或多光子荧光显微镜、western印迹、免疫染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及核酸检测技术例如northern印迹、southern印迹、聚合酶链式反应、引物延伸和DNA阵列技术的任何技术检测。
28.根据前述权利要求20至27任一项的方法，其中所述试剂或化合物是任何物理或化学试剂。
29.根据前述权利要求20至观任一项的方法，其中所述试剂或化合物是药物组合物、 化妆品、药物、异生素化合物、食物成分、糖、脂质、蛋白质、膳食补充剂、辐射和/或电刺激。
30.根据前述权利要求20至四任一项的方法，其中所述化合物是防晒洗剂和/或所述试剂是UV-辐射。
31.根据前述权利要求20至30任一项的方法，其中所述试剂或化合物是溶液、霜剂、洗剂、凝胶、微粒和/或纳米颗粒形式。
32.根据前述权利要求20至31任一项的方法，其中所述试剂或化合物通过口服包括颊和舌下、直肠、鼻、局部、肺、阴道或肠胃外包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内施用或通过吸入或吹入施用。
33.根据前述权利要求20至32任一项的方法，其中所述试剂或化合物通过局部和/或肺施用进行施用。
34.根据前述权利要求20至33任一项的方法，其中所述转录和/或翻译产物的检测在活动物中开展。
35.根据前述权利要求20至34任一项的方法，其中所述转录和/或翻译产物的检测在无需从活动物中取出组织的情况下开展。
36.根据前述权利要求20至35任一项的方法，其中所述对转录和/或翻译报告产物的检测在从动物中取出的组织样品上开展。
37.根据前述权利要求20至36任一项的方法，其中所述组织选自皮肤、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、肠、小肠、大肠、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝脏、肺、脑、角膜和肿瘤、卵巢组织、子宫组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织、肾脏组织、胸腺组织、睾丸组织、造血组织、骨髓、泌尿生殖组织、呼出气、干细胞包括癌干细胞、和体液例如痰、尿、血液和/或汗液。
38.根据前述权利要求20至37任一项的方法，其中所述组织是皮肤、表皮和/或真皮。
39.从根据权利要求1至19任一项的转基因动物衍生的细胞系。
40.从如在权利要求1至19任一项所定义的转基因非人动物衍生的转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，和/或转基因非人卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核，其中转基因基因组包含i.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和 .至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点，和/或iii.任何所述核酸序列的转录或翻译产物。
41.产生根据前述权利要求1至19、39和40任一项的转基因非人动物、卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核的方法，包括步骤i.提供供体细胞，ii.通过插入下列对i)的供体细胞进行基因修饰a.至少一种编码核受体或其部分和DNA结合结构域或其部分的核酸序列，和b.至少一种编码可检测报告核酸转录物和/或报告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸还包含至少一个包含DNA结合结构域的多肽的结合位点，和/或c.任何所述核酸序列的转录或翻译产物，iii.将在ii)中得到的供体细胞的修饰的基因组转移进入宿主细胞，IV.得到形成胚胎的重构胚胎V.培养所述胚胎；和Vi.转移所述培养的胚胎至宿主哺乳动物使得胚胎发育成基因修饰的胎儿，其中所述基因修饰的胚胎通过包括步骤i)至V)的核转移产生，其中所述基因修饰的胚泡通过包括步骤i)至vi)的核转移产生， 其中所述基因修饰的胎儿通过包括步骤i)至vi)的核转移产生。
42.在权利要求1至19任一项所定义的转基因动物，在权利要求39中所定义的细胞系，和/或在权利要求40中所定义的卵母细胞、精细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核用于评价核受体活性的用途。
43.根据权利要求42的用途，用于评价试剂对核受体活性的影响。
44.根据权利要求42至43任一项的用途，用于评价体内因内源激动剂而引起的核受体活性。
45.根据权利要求44的用途，其中所述激动剂在皮肤的正常发育过程中产生。
46.根据权利要求44的用途，其中所述内源激动剂在疾病，例如银屑病、不同的癌症类型和/或其它高增生性疾病发展过程中产生。
47.根据权利要求42至46任一项的用途，其中所述核受体、评价、试剂和/或组织如前述权利要求任一项中所定义。
全文摘要
提供用于检测动物组织内特异核受体活化的传感器系统。核受体传感器系统包括包含偶联至DNA-结合结构域的核受体或其部分的传感器组件，和包含报告基因的报告器组件。提供了转基因动物，例如转基因猪，其在其基因组中包含核受体传感器系统的组件。还提供了产生转基因动物的方法以及转基因动物用于体内评价核受体活性的用途。
文档编号C12N15/63GK102203259SQ200980144264
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月5日
发明者L·A·伯朗德, 卡斯滕·克里斯蒂安森, 尼克拉斯·海涅·斯塔斯特普, 雅各布·齐姆·米克尔森 申请人:南丹麦大学, 奥胡斯大学