专利名称：一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因，具体涉及一种靶向抗前列 腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法，属基因治疗技术领域。
背景技术：
前列腺癌是男性生殖系统最常见恶性肿瘤之一，近年来其发病率有逐年上升趋 势。大量调查资料显示，在我国前列腺癌的发病率与相关死亡人数也呈逐年上升趋势，对前 列腺癌的诊断和治疗也成了现代医学的一项重要研究内容。目前，有关前列腺癌基因治疗 的治疗策略很多。因为多数治疗方法没有较好的特异性，不能直接针对前列腺癌细胞，所以 其临床应用有限。众所周知，人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机能捕获和 消灭机体内新生的肿瘤细胞。而引起肿瘤发生的最终因素都可以归结为机体免疫效应细胞 在数量和质量上不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，从治疗上讲，有效的抗肿瘤策 略(1)增强机体抗肿瘤免疫反应，主要是提高肿瘤局部活化的免疫效应细胞的数量，其中 主要组织相容性复合物限制性的细胞毒T细胞(即杀伤性T细胞)是最重要的免疫监视和 效应细胞。(2)采取有效手段直接杀死肿瘤细胞。超抗原是一组细菌或病毒编码的蛋白质分子，可不需要抗原提呈细胞提呈作用， 以完整的蛋白质分子形式直接与抗原提呈细胞膜的主要组织相容性复合物-II类分子抗 原结合槽外侧结合并且提呈给T细胞。超抗原-主要组织相容性复合物-II类分子复合物 仅与T细胞抗原受体β链的V区相结合，由于人类V0基因有20余种，故超抗原激活的T 细胞克隆数可达普通抗原的数千倍乃至数万倍。超抗原的抗肿瘤作用主要是由SAg依赖的 细胞介导的细胞毒作用来完成，这是超抗原抗肿瘤的主要作用。再者，超抗原激活的CD4+T 细胞还可以分泌多种足量的细胞因子如肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β和肿瘤坏 死因子_ Y、白介素_2、白介素_6等，直接或间接地杀伤肿瘤细胞。超抗原作为一种新型 的抗肿瘤治疗模式，近年来研究进展很快，主要集中在超抗原直接抗肿瘤作用、超抗原靶向 抗肿瘤作用、以及超抗原的基因治疗等方面。金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphyl0CC0llal enterotoxin, SEA)是目前研究最多的超抗原。但是无论是单用超抗原进行抗肿瘤治疗还 是目前抗体靶向的超抗原抗肿瘤治疗，都还有很多需要克服的困难单用超抗原治疗的缺 陷也是非常明显的，即超抗原介导的杀伤性T细胞主要杀伤主要组织相容性复合物-II阳 性的肿瘤细胞，对主要组织相容性复合物-II阴性的肿瘤细胞杀伤作用较弱，但肿瘤细胞 主要组织相容性复合物-II阳性率一般都很低，并具有明显的异质性，因此，单纯的超抗原 抗肿瘤的效果不理想，且难以避免对机体主要组织相容性复合物-II阳性的正常细胞造成 的毒副作用。而单抗与超抗原的融合蛋白活化的T细胞是金黄色葡萄球菌肠毒素A反应 性的，并不是肿瘤特异性的T细胞。故此类超抗原-单克隆抗体的融合蛋白尚缺乏抗瘤的 广谱性和特异性，其诱导的靶向抗肿瘤免疫应答并不尽如人意。基因治疗最关键的措施是选择一个合适高效的载体将其导入靶器官内。目前在肿瘤基因治疗载体的研究中仍以病毒载体为主。溶瘤腺病毒是通过对已知腺病毒进行改造， 得到的能过对肿瘤基因表型的缺陷产生特异性杀伤作用及起到抗肿瘤药物的靶向性载体 作用的病毒。因溶瘤腺病毒对肿瘤细胞杀伤作用具有特异性和安全性，所以成为被普遍看 好的生物学治疗肿瘤的新技术。肿瘤细胞在自我扩增时会相对正常细胞会出现一些异常表 达的产物，这些产物可以刺激一些基因的表达，从而刺激细胞或者病毒的扩增。这些能够与 肿瘤表达的异常分子结合并启动下游基因表达的基因片段，称之为肿瘤特异性启动子。在 构建溶瘤腺病毒的过程中，肿瘤特异性启动子对腺病毒的基因组进行改造也是当今研究的 热点之一。通过肿瘤特异性增强子调控腺病毒复制，达到增强病毒对肿瘤细胞的感染能力。 端粒酶在大多数恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或活性很低，是 目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶是维持端粒内活性所必需的 催化亚单位，它的表达调控在转录水平上。利用端粒酶逆转录酶启动子来调控病毒复制增 殖所必需的基因，理论上可使病毒选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中增殖。如果以端粒酶 逆转录酶启动子取代ElA基因自身的启动子，就能使ElA基因的达限制在肿瘤细胞中，而在 正常细胞中不表达。近年来，前列腺癌特异性的分子标志物一前列腺特异性抗原已成为前列腺癌临床 研究中的热点之一。前列腺特异性抗原的表达与前列腺癌关系密切，在前列腺癌的早期诊 断、基因治疗、预后评估中所起的作用变得越来越重要。血清前列腺特异性抗原的测定在前 列腺癌的普查、早期诊断和病情预测中意义重大，已被广泛应用于临床，成为我国PCa诊疗 指南中首选的检测项目。前列腺特异抗原是人前列腺组织中的特异的由前列腺上皮细胞分 泌的单链蛋白，由于前列腺特异抗原几乎只在前列腺癌组织中表达，所以该基因的启动子 具有高度的组织特异性。因此，利用这种蛋白转录的调控序列来构建组织特异性载体，使治 疗基因在前列腺癌中选择性的表达，以期达到专一杀伤前列腺肿瘤细胞的目的。溶瘤腺病 毒治疗肿瘤作为一种肿瘤治疗的新方法，虽然有其内在的独特优势，但它依然存在一些有 待解决的问题，主要表现在以下几个方面首先，对肿瘤的特异性杀伤能力还有待提高。目前通过对腺病毒ElB的处理可以 对P53存在缺陷的肿瘤细胞达到靶向溶瘤的作用，研究结果表明对一部分早期肿瘤细胞， 他们相对正常细胞的异型性小，腺病毒作用很弱，对于这部分细胞的处理还只能依赖于联 合放、化疗的作用来杀伤肿瘤，所以溶瘤腺病毒对于这部分肿瘤细胞的特异性杀伤较弱。其次，由于用于溶瘤的腺病毒作为体外物质被引进体内，机体必然会产生针对病 毒的防御作用，从而出现发热、注射局部反应、流感样症状、白细胞下降、血小板下降、肝肾 功能异常、脱发、恶心呕吐等不良反应，这些不良反应的出现说明机体本身的免疫反应对病 毒产生作用，这样就会使病毒滴度有所下降，病毒对肿瘤细胞的杀伤作用自然会减弱。另外，病毒对肿瘤细胞作用的第一步是能够特异性亲嗜肿瘤细胞表面的一些免疫 分子，但肿瘤细胞有时并不表达这类分子，不能被病毒感染。在肿瘤基因治疗中的应用却受 到了 C族腺病毒天然特性的制约，部分原因是由于在恶性肿瘤中C族腺病毒受体的表达量 较低。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种靶向抗前列腺肿瘤的
4表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法，运用基因工程技术，将超抗原SEA基因 克隆入溶瘤腺病毒载体中，限制其只在前列腺肿瘤细胞内增殖、表达，达到靶向杀伤前列腺 肿瘤细胞的目的，以前列腺特异性抗原启动子和端粒酶逆转录酶启动子来调控肿瘤特异性 增殖腺病毒载体，携带超抗原SEA基因片段，并命名为SG504-SEA，其既具有在肿瘤细胞内 特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力。本发明是以如下技术方案实现的一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双 调控溶瘤腺病毒，其特征是它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分 包括溶瘤腺病毒穿梭质粒SG502与调控溶瘤腺病毒的端粒酶逆转录酶基因启动子和前列 腺特异性抗原启动子，所述的超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A基因片段。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A基因片段，且该基因片段的长度为771bp。所述的调控溶瘤腺病毒的双启动子为端粒酶逆转录酶基因启动子和前列腺特异 性抗原启动子。所述的双启动子，其中端粒酶逆转录酶基因启动子为病毒载体SG502自带，前列 腺特异性抗原启动子需从前列腺癌组织中提取，根据美国NCBI Nucleotide获得的序列 U37672. 1，设计扩增前列腺特异性抗原启动子上下游引物，扩增出522bp大小的前列腺特 异性抗原启动子片段。一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法，其特 征是按如下步骤进行(1)前列腺特异性抗原启动子的克隆；(2)溶瘤腺病毒载体的构建，将前列腺特异性抗原启动子克隆入溶瘤腺病毒穿 梭质粒SG502中，得到SG504病毒质粒，然后与携带金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的质粒 PPE3-ccdb-SEA 进行重组；(3)溶瘤腺病毒的包装、纯化、滴度测定，得到SG504-SEA。本发明的优点是该方法根据实体肿瘤的无限增殖和瘤体内缺氧的两个主要特 征，由于利用端粒酶逆转录酶启动子和前列腺特异性抗原启动子分别取代腺病毒载体复制 所必须的E1A、ElB启动子，能更加高效的控制溶瘤腺病毒载体只在前列腺肿瘤细胞内增 殖，达到靶向高效载入金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的目的；同时其携带金黄色葡萄球菌 肠毒素A基因作为治疗基因，具有肿瘤靶向性，能在肿瘤局部高效复制，激发强烈的抗肿瘤 免疫应答，可显著提高杀伤肿瘤作用，最大可能的避免超抗原全身应用的毒副作用；作为载 体的肿瘤特异性增殖腺病毒，能特异性的感染肿瘤细胞并在其中复制、增殖，裂解、杀伤肿 瘤细胞并释放出更多病毒，进而感染周围其他肿瘤细胞并进行更大范围的溶解杀伤，形成 链式反应。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明图1为本发明已构建的携带超抗原SEA基因的双调控增殖腺病毒SG504-SEA结构 示意图
图2为细胞培养示意图 图3为病毒的扩增示意图图4为50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度示意图
具体实施例方式实施例、1、实验所需试剂病毒载体pSG502、HEK293细胞均购自上海肝胆外科医院病; 带SEA基因的病毒骨架质粒PPE3-ccdb-SEA由本室保存。
〖与基因治疗中心。携PUC57克隆载体 Sangon公司 Taq酶 申能博彩公司 DNA 连接酶 SolutionI TakaRa公司 蛋白酶K、RNA酶 PR0MEGA 公司 胎牛血清、小牛血清、DMEM GIBCO BRL 公司 琼脂糖、溴化乙锭 GENE公司琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物UNIPATH公司胶回收试剂盒 QIAGEN公司 PCR产物回收试剂盒 QIAGEN公司 质粒DNA制备试剂盒 QIAGEN公司 病毒DNA提取试剂盒 QIAGEN公司 LipofectAmine2000 试剂盒 GIBCO BRL 公司2、前列腺特异性启动子的克隆 上游5根据美国NCBI Nucleotide获得的序列(U37672. 1)，设计扩增PSA启动子引物P -atat_gcggccgctttatgatgacagtag-3‘禾P P :5’ -RtRtactaRtccaRRaRccctataa a_3’，分别引入NotI和SpeI酶切位点。从前列腺癌组织中提取基因组DNA，并以此为模板 行PCR扩增出522bp大小PSA启动子片段。循环参数为94°C预变性4min，94°C变性30s， 56°C退火lmin，72°C延伸Imin，进行35个循环，最后72°C延伸7min，扩增产物经1 %琼脂糖 凝胶电泳鉴定。用EcoRV酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物 进行连接，16°C反应过夜。转化JM109感受态细胞，涂氨苄抗性平板，37°C过夜培养，筛选 克隆，提取质粒并测序确认插入产物。将鉴定正确的质粒命名为pUC57-PSAp。
3、携带超抗原SEA基因的hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA的构 建、重组3. 1、酶切回收
PUC57-PSAp10. OulSG5022.OulSpe I3. OulSpe I3.OulNot I3. OulNot I3.OulNEB 210. OulNEB 28.Oul10*BSA10.Oul10*BSA8.OulH2O64. OulH2O56.Oul总体系100.Oul总体系80. Oul37℃水浴6h后，1. 2 %琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(Q1AquickGelExtraction)回收 PUC57_PSAp 522bp, SG502 回收 10087bp。3. 2、连接PUC57-PSAp/Spe I+Not I 8ul12°C连接12h，将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP) 后，37°C生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，在含AMP的LB溶液中，37°C 摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为SG504。3. 3重组及鉴定将质粒PPE3-ccdb-SEA 与 SG504 用 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞。共转染 后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，应用QIAGEN DNA BloodMini Kit(QIAGEN 公司)提取腺病毒DNA，应用PCR进行鉴定。经鉴定正确的腺病毒命名为SG504-SEA，即携 带SEA基因调控的肿瘤特异性增殖型腺病毒(见图2)。3. 31 293细胞培养(如图2所示)3. 32、病毒的扩增(如图3所示)3. 33、50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度(如图4所示)
SG502/Spe I+Not ISolution I_
2ul IOul 总体系
20.Oul
7
4、携带超抗原SEA基因的hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA的扩增和滴度测定20ml 10% FBS/DMEM 培养 75cm2 培养瓶中长至 80% 90% 293 细胞，换成 15ml 2% FBS/DMEM，取0. 5ul首次扩增的病毒保存液(病毒空斑感染24孔获得)，小心加入病毒 混合液，十字形慢慢晃动3次，370C 5% C02孵箱中培养48小时后收集病毒上清或细胞沉 淀，沉淀细胞加AD buffer保存液，-80°C至37°C冻融3次，600g离心20分钟后去沉淀取上 清，收上清和细胞的混合液，-80°C至37°C冻融3次，600Xg离心20分钟去除细胞碎片，收 集上清。反复扩增至需要病毒量，50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度。tttatgatgacagtagcaatgtatctgtggagctggattctgggttgggagtgcaaggaaaagaatgtactaaatgccaagacatctatttcaggagcatgaggaataaaagttctagtttctggtctcagagtggtgcagggatcagggagtctcacaatctcctgagtgctggtgtcttagggcacactgggtcttggagtgcaaaggatctaggcacgtgaggctttgtatgaagaatcggggatcgtacccaccccctgtttctgtttcatcctgggcatgtctcctctgcctttgtcccctagatgaagtctccatgagctacaagggcctggtgcatccagggtgatctagtaattgcagaacagcaagtgctagctctccctccccttccacagctctgggtgtgggagggggttgtccagcctccagcagcatggggagggccttggtcagcctctgggtgccagcagggcaggggcggagtcctggggaatgaaggttttatagggctcctgg
权利要求
一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒，其特征是它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分包括溶瘤腺病毒穿梭质粒SG502与调控溶瘤腺病毒的端粒酶逆转录酶基因启动子和前列腺特异性抗原启动子，所述的超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A基因片段。
2.根据权利要求1所述的一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺 病毒，其特征是所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A基因片段，且该基因片段的长度为771bp。
3.根据权利要求1所述的一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺 病毒，其特征是所述的调控溶瘤腺病毒的双启动子为端粒酶逆转录酶基因启动子和前列 腺特异性抗原启动子。
4.根据权利要求3所述的一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺 病毒，其特征是所述的双启动子，其中端粒酶逆转录酶基因启动子为病毒载体SG502自 带，前列腺特异性抗原启动子需从前列腺癌组织中提取，根据美国NCBI Nucleotide获得的 序列U37672. 1，设计扩增前列腺特异性抗原启动子上下游引物，扩增出522bp大小的前列 腺特异性抗原启动子片段。
5.一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法，其特征 是按如下步骤进行(1)前列腺特异性抗原启动子的克隆；(2)溶瘤腺病毒载体的构建，将前列腺特异性抗原启动子克隆入溶瘤腺病毒穿梭 质粒SG502中，得到SG504病毒质粒，然后与携带金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的质粒 PPE3-ccdb-SEA 进行重组；(3)溶瘤腺病毒的包装、纯化、滴度测定，得到SG504-SEA。
全文摘要
本发明涉及一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因，具体涉及一种靶向抗前列腺肿瘤的表达超抗原基因的双调控溶瘤腺病毒的制备方法，属基因治疗技术领域。该制备方法运用基因工程技术，将金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆入溶瘤腺病毒载体中，限制其只在前列腺肿瘤细胞内增殖、表达，达到靶向杀伤前列腺肿瘤细胞的目的，以前列腺特异性抗原启动子和端粒酶逆转录酶启动子来调控肿瘤特异性增殖腺病毒载体，携带金黄色葡萄球菌肠毒素A基因片段，并命名为SG504-SEA，其既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力。
文档编号C12N7/01GK101899420SQ20101001814
公开日2010年12月1日 申请日期2010年1月16日 优先权日2010年1月16日
发明者韩从辉 申请人:韩从辉