专利名称：：植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
：随着人类社会的进步和经济的发展，水资源短缺已经成为我国乃至全球说面临的问题，干旱等逆境是制约我国粮食生产的重要因素。当植物遭遇到逆境时，会被受体感受，引起细胞内钙信号的变化，激活蛋白激酶引起级联的磷酸化，许多转录因子被激活引起逆境胁迫应答基因表达，在植物体内产生大量的特异蛋白，协同调节植物生理生化以及代谢的变化，从而适应外部逆境，提高植物对逆境的耐性。转录因子能够调控多个基因的表达在植物的抗逆反应中发挥着重要作用，所以在植物中过表达与抗逆应答相关的转录因子便可能同时改变多个下游抗逆相关基因的表达，从而获得抗逆性改良的转基因植株。
发明内容本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的植物耐逆性相关蛋白(0sDRF2，OryzasativadroughtresponsibleERF2)，为一种转录因子，来源于粳稻品种"日本晴"(Oryzasativasubsp.japonicacv.Nipponbare)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由205个氨基酸残基组成。为了使(a)中的0sDRF2便于纯化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>上述(b)中的0sDRF2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsDRF2的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。编码上述植物耐逆性相关蛋白的基因(OsDRF2)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子(cDNA);2)序列表中序列3所示的DNA分子(基因组基因)；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中序列3所示的DNA分子由3051个核苷酸组成，自5'端1-2000位为启动子，2001-2178为第一外显子，2179-2299为内含子，2300-3051为第二外显子。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体是将所述基因插入pCAMBIA1300'的多克隆位点得到的重组质粒；所述pCAMBIA1300'是将DNA片段甲和DNA片段乙连接得到的；所述DNA片段甲为用限制性内切酶Pstl酶切pRT105，回收包含35S启动子、多克隆位点以及poly(A)的片段，将末端补平后得到的DNA片段；所述DNA片段乙为用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pCAMBIA1300，回收骨架载体，将末端补平得到的DNA片段。含有以上任一所述基因(OsDRF2)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(0sDRF2)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育耐旱转基因植物的方法，可将编码所述植物耐逆性相关蛋白的基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述耐逆性具体可为耐渗透胁迫和/或耐干旱。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐旱能力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。实验表明，将本发明的编码调控植物抗逆性的转录因子0sDRF2的DNA序列导入拟南芥过表达，能够提高转基因拟南芥对渗透胁迫和干旱胁迫的耐性。本发明的编码调控植物抗逆性的转录因子0sDRF2的基因组基因及其cDNA基因为培育其他具有经济价值的抗逆性提高的植物提供了基础。图1为转基因植株0sDRF2过表达的RT-PCR检测结果。图2为转基因植物的渗透胁迫实验中植株的表型照片。图3为转基因植物的渗透胁迫实验中植株的鲜重平均值。图4为转基因植物的干旱透胁迫实验中植株的表型照片。图5为转基因植物的干旱透胁迫实验中，复水一天后植株的鲜重平均值。图6为转基因植物的干旱透胁迫实验中，干旱处理18天后的巻叶率和复水一天后的复水成活率。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中，实验均设置三次重复，结果取平均值。pRT105:中国农业科学院生物技术研究所；Topfer，R.，Maas，C.，Horicke-Grandpierre，C.，Schell，J.，andSteinbiss，H.H.(1993).Expressionvectorsforhigh—levelgeneexpressionindicotyledonousandmonocotyledonousplants.MethodsEnzymol217,67-78。实施例1、0sDRF2的发现和克隆—、0sDRF2cDNA的克隆5取0.2g梗稻品禾中"日本晴，，(0ryzasativasubsp.j即onicacv.Nipponbare)(中国农业科学院作物科学研究所，编号WD-10576;原始来源不清)的叶片，液氮研磨，TRIzol法提取总RNA。取2g总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，以此为模板，以特异引物对甲进行PCR反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pMD19-T(宝生物工程(大连)有限公司，D102A)，进行测序。特异引物对甲如下上游引物5'-ATGGTACAGCCAAAGAAGAAG-3';下游引物5'-TCAGATGACAAAGCTACCCTC-3'。测序结果表明，该片段的核苷酸序列如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。二、0sDRF2基因组基因的获得CTAB法提取日本晴叶片的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以特异引物对乙进行反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pMD19-T，进行测序。特异引物对乙如下上游引物5'-GACAGGGGCAACGAACTTCC-3';下游引物5'-GTAACAAAGTATGTTGATGG-3'。测序结果表明，该片段的核苷酸序列如序列表的序列3所示。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为0sDRF2，将0sDRF2的编码基因命名为0sDRF2。将序列表的序列2所示核苷酸与pMD19-T连接得到的重组质粒命名为pMD19-T-0sDRF2。实施例2、转基因植物的获得和鉴定—、pCAMBIA1300'的构建1、以Pstl酶切pRT105，回收包含35S启动子、多克隆位点以及poly(A)的片段，将末端补平。2、用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pCAMBIA1300(Cambia，GPOBox3200，Canberra,ACT2601，Australia)，回收骨架载体，将末端补平。3、将步骤1得到的片段和步骤2得到的片段连接，得到pCAMBIA1300'。二、转基因植物的获得1、用限制性内切酶BamHI和Sail双酶切实施例1的重组质粒pMD19-T-0sDRF2，回收0sDRF2cDNA片段。2、用限制性内切酶BamHI和Sail双酶切pCAMBIA1300'，回收骨架载体。3、将步骤1得到DNA片段和步骤2得到的骨架载体连接，得到重组表达载体。4、将重组表达载体导入农杆菌LBA4404(http:〃www.cbs.knaw.n1/，NCCBbacteria/plasmidsdatabase,NCCBnumber2760)。5、然后利用农杆菌介导，通过花浸泡法(Clough，S.J.，andBent，A.F.(1998).Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacteri咖—mediatedtransformationofArabidopsisthaiiana.PlantJ16,735-743.)将0sDRF2基因导入拟南芥Col-O(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,CS70000)，得至ljTl代禾中子。Tl代种子收获后在MS培养基(含有30mg/L潮霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获转基因植物的T2代种子。TRIzol(Invitrogen，Cat.No.15596-026)提取T2代植株叶片的总RNA，取2ug总RNA，以M-MLV反转录酶(Invitrogen，Cat.No.28025-013)合成cDNA第一链，然后以Actin为对照，以实施例1的特异引物对甲进行PCR扩增。如图1所示，阳性植株中确实有0sDRF2的表达，而野生型对照中没有表达，证明得到了0sDRF2转基因植株。将pCAMBIA1300'导入农杆菌LBA4404，然后转化拟南芥，步骤同上。得到转空载体对照植物的T2代种子。二、耐逆性鉴定1、对渗透胁迫的耐逆性分别取转基因植物的T2代种子(三个株系7、8和18)、转空载体对照植物的T2代种子和野生型拟南芥(WT)种子，萌发4天的幼苗在MS培养基(含200rnM甘露醇)中进行处理(每个株系100株)；以转基因植物的T2代种子(三个株系7、8和18)和野生型拟南芥种子，萌发4天的幼苗在MS培养基中进行处理(每个株系IOO株)，作为对照。处理一周时的照片见图2。处理一周时植株的鲜重平均值见图3。由图2和图3可见甘露醇处理中，与野生型WT相比，0sDRF2转基因株系7、8、18叶片生长所受抑制较小，鲜重为野生型的1.5-2倍；在对照处理中，转基因株系7、8、18与野生型WT的生长没有显著差异；转空载体植株的表型和鲜重与野生型没有显著差异。这表明过表达0sDRF2基因能够提高拟南芥对渗透胁迫的耐性。2、对干旱胁迫的耐逆性分别取转基因植物的T2代种子(三个株系7、8和18)、转空载体对照植物的T2代种子和野生型拟南芥(WT)种子，萌发2周的幼苗(每个株系100株)移栽到土壤中，干旱处理18天(不浇水)，然后复水。以转基因植物的T2代种子(三个株系7、8和18)和野生型拟南芥种子，萌发2周的幼苗移栽到土壤中，每天适量浇水，作为对照。分别在干旱处理18天后，和复水一天后拍照，见图4。复水一天后，植株的鲜重平均值见图5，干旱处理18天后的巻叶率和复水一天后的复水成活率见图6。由图4、图5和图6可见对照处理中，转基因株系7、8、18与野生型WT拟南芥幼苗生长无差异；经干旱处理18天后，野生型WT叶片85%巻縮，叶色变褐，生长停滞，而转基因株系7、8、18叶片仅有10-20%巻縮，约80%叶片颜色变深，20%叶片颜色正常；复水后一天，95%以上转基因株系7、8、18叶色恢复浅绿色，而75%野生型WT叶色没有恢复；转空载体植株的表型和各个检测指标与野生型没有显著差异。这表明过表达0sDRF2基因能够提高拟南芥对干旱胁迫的耐性。序列表〈110〉中国农业科学院生物技术研究所〈120〉植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用〈130〉CGGNARY102028〈160>3〈210>1〈211>205〈212>PRT0085]〈213>日本晴水稻(Oryzasativasubsp.j即onicacv.Nipponbare)0086]〈400>10087]MetValGinProLysLysLysPheArgGlyValArgGinArgHisTrp0088]1510150089]GlySerTrpValSerGlulieArgHisProLeuLeuLysArgArgVal0090]2025300091]TrpLeuGlyThrPheGluThrAlaGluGluAlaAlaArgAlaTyrAsp0092]3540450093]GluAlaAlaValLeuMetSerGlyArgAsnAlaLysThrAsnPhePro0094]5055600095]ValGinArgAsnSerThrGlyAspLeuAlaThrAlaAlaAspGinAsp0096]657075800097]AlaArgSerAsnGlyGlySerArgAsnSerSerAlaGlyAsnLeuSer0098]8590950099]GinlieLeuSerAlaLysLeuArgLysCysCysLysAlaProSerPro0100]1001051100101]SerLeuThrCysLeuArgLeuAspProGluLysSerHislieGlyVal0102]1151201250103]TrpGinLysArgAlaGlyAlaArgAlaAspSerAsnTrpValMetThr0104]1301351400105]ValGluLeuAsnLysGluValGluProThrGluProAlaAlaGinPro0106]1451501551600107]ThrSerThrAlaThrAlaSerGinValThrMetAspAspGluGluLys0108]1651701750109]lieAlaLeuGinMetlieGluGluLeuLeuSerArgSerSerProAla0110]1801851900111]SerProSerHisGlyGluGlyGluGlySerPheVallie0112]1952002050113]〈210>20114]〈211>6180115]〈212>DNA0116]〈213>日本晴水稻(Oryzasativasubsp.j即onicacv.Nipponbare)0117]〈400>20118]atggtecagccaaagaagaagtttcgtggagtcaggcagcggcactggggctcctgggtc600119]tctgagatcagacaccccctcctteaaaggagggtgtggctgggcacctttgagacggcc1200120]gaggaggctgcgcgagcctecgatgaggctgctgtgctgatgagtggccgcaacgccaag1800121]accaacttccccgtgcagaggaactccaccggtgatctcgccacggccgc3g3CC3gg3C2400122]gcccgtegcaatggcggtegcaggaactcctccgcgggcaacctgtcacagattctcagt3000123]gcteagctccgcaagtgctgcaaggcgccatctccgtcctteacctgcctccgcctcgac360CCCg3g朋gtcccacattggcgtgtggc皿皿gcgcgcaggggcccgtgctgactccaac420tgggtgatgacggtggagctc皿c皿3g3ggteg皿cc皿ctg皿cctgcagctcagccc■3C3tC朋C3gcaacagcttcgC皿gtg3C3atggatgatg3gg皿皿g3ttgcgctgcaa540EltgEltCgElggagttgctgagC3gg3gC3gtccagcttcacCCtC3C3tgg3g3ggg3g3g600ggtegctttgtcatctga618〈210>3〈211>3051〈212>DNA〈213>日本晴水禾舀(0ryzasativasubsp.j即onicacv.Nipponbare)〈400>3g織ggggC3acgaacttccatcaatctgaatcacttttectgtegcagc603朋gg3C3gttgattegtga皿tetgacgagccgccaattgactgttcag120atecttcaatgttgatecggtgtecg皿gtactcttgccatg腿tgggactgcaagcct180gte朋tegatC3朋ggtC3t3gtC3gg皿Cacctcatetccgtega皿teC3g皿tCC3g240gctggatcatgtccattecategaattttcggacttecat3皿gg3gtga300catgcatecagagagcateattcctcaaatgtgcga卿gg皿3C3g3CC360cttettecagtttetecgttttcaatggca皿c皿gatgc420gtga朋c朋catgtegctgc3ggteac皿3tetgttgggategcc3ca皿■朋ggtg朋cttgcagactet3Cg皿gC3C3tetttgatca540ateggcac朋卿gt卿gtgttectctttgctcctecttcatcttcctgatgtctgcte600cttctgaatetcatgttctgcacccagteaggagttecttcteactgtet660tete皿cgtgteaatgattc3ccagcteag720agcgtcgagcaacactcagccaccatcatcateacc3ggctgtgtecatg780gagcteccttagac皿gcttcaactccaagcagtcccaga840C3tg3C朋Cgcaagtcttea■tcteaatttecte皿ggc皿cacattcttecacatttcaa960actccagttctetegcgc皿gagtgttg皿agtttcccaa1020teagacgagacacgtcatca3cgagatettCCC朋3CgC31080gtttgcagcateagtcttgccatetg3gacgcctegtteag皿c皿cgtccatgcatcca1140ctggcactcactggaccatetCC3C3CCCCaccategctgtgg朋g皿tt1200atggccatggagttgatctgacaattgctttgcag皿c皿ctegcctegc1260ttatectaatgctcteggagcteatgtgct皿cccggggttgccccacaa1320ttaatgtggctaccatgggcgteggtg卿gtgttaatteccaatgtcct3gC3g3g皿g1380gtggttetgctaatecccgcacagttcaccgacagcccccactgcgggccttgtggactg1440gaccaccttcaccttcagttgcccctcccctgaattctctcttcacctctactecctctg1500tcccgaaateactttetttttcacctatcccgtecatecc1560ataatgtcttctetttteacgcaatttteccccactttea1620tgcatttgtctcccacttccategattc皿teteatgatttecttea皿gate朋agtte1680ttttgagaca朋teagatggagttettttgggat卿gggaagtatctcc1740agtcctgccttacttttetcccttggcacacacctgctegttgctectgcttgtgaaccc1800agcccttggtgatgttcagtg皿皿cteggtctctttgattctctctttc1860tetctctgtetctctgatecgtectetttgaccacctetecgtctcaccacattteacgc1920ggractgtegacgc皿gtecaggccgcagcagtttatettagtgctttcc1980tcctcccccacacctcctccgttcagttcagaggcgcctegc皿tegcagctcattgcct2040catctctgcctcccctgtccttctgggggcagag朋tctctccactgctg21003C3gCC朋3ggtggagtraggC3gCggC3Ctggggctcctgggtctctga2160cccctcctgtaagctcttctatcaacatccctctaattttctgcteatea2220tgttetgttttgatgtgtcttcteateagtaateagtctc皿tgcatetg2280gtgtttgcaacteatgcagttgtggctgggcacctttgag3CggCCg郷2340aggctgcgcgagcctecgatgaggctgctgtgctgatgagtggccgcaacgcc朋gacca2400acttccccgtgcagagg^ctccaccggtgatctcgccacggccgcagaccaggacgccc2460gteg咖tggcggtegc郷aactcctccgcgggcaacctgtcacagattctcagtgcta2520agctccgcaagtgctg咖ggcgccatctccgtcctteacctgcctccgcctcgaccccg25803g皿gtCCC3cattggcgtgtggc皿皿gcgcgc郷ggcccgtgctgactccaactggg2640tgatgacggtggagctc皿c朋agaggteg皿cc朋ctgaacctgcagctcagcccacat2700c朋cagc皿cagcttcgcaagtg織atgg2760tcg郷賜ttgctgagc郷3gC3gtCC3gcttcaccctcgg卿gggte2820gctttgtcatctga皿ggcttggatga皿cg3cggcateacgaagtcaccactctegacc2880atggttccagaatttcctgctggtecac3gttecttcagt2940atatctettecttcagacaagteac朋gacgcaactetgtgtegctetet3000gtgtttetga朋agctetetatecgcagtctccatcaacatectttgttec305110权利要求一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求l所述蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；4)与l)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入pCAMBIA1300'的多克隆位点得到的重组质粒；所述pCAMBIA1300'是将DNA片段甲和DNA片段乙连接得到的；所述DNA片段甲为用限制性内切酶Pstl酶切pRT105，回收包含35S启动子、多克隆位点以及poly(A)的片段，将末端补平后得到的DNA片段；所述DNA片段乙为用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pCAMBIA1300，回收骨架载体，将末端补平得到的DNA片段。6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。7.—种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐渗透胁迫和/或耐干旱。10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为拟南芥、烟草、百脉根、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿、大豆或棉花。全文摘要本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。实验表明，将本发明的编码调控植物抗逆性的转录因子0sDRF2的DNA序列导入拟南芥过表达，能够提高转基因拟南芥对渗透胁迫和干旱胁迫的耐性。本发明的编码调控植物抗逆性的转录因子0sDRF2的基因组基因及其cDNA基因为培育其他具有经济价值的抗逆性提高的植物提供了基础。文档编号C12N15/63GK101775070SQ20101003421公开日2010年7月14日申请日期2010年1月14日优先权日2010年1月14日发明者张执金,张海文,权瑞党,王友华,黄荣峰申请人:中国农业科学院生物技术研究所