专利名称：一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵培养基生产方法，更具体地说，涉及一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法。
背景技术：
一氧化碳营养菌(Carboxydotrophic bacteria)，一类既能利用CO作为唯一碳源和能源，又能以CO2和H2分别作为碳源和能源，通过独特的Wood-Ljungdahl途径进行自养生长代谢的细菌。当以CO2和H2作为代谢底物时，代谢过程中会形成CO中间体，因此，该类细菌统称为一氧化碳营养菌。大部分一氧化碳营养菌为严格厌氧菌，对氧气极为敏感，该类细菌以CO、CO2和H2为底物进行自养生长的同时能够生成乙酸、丁酸、乙醇、丁醇和氢气等重要的化工品和清洁能源，见反应式(1-9)；少部分一氧化碳营养菌为好氧菌或耐氧菌，对氧气不敏感，该类细菌能够利用CO和O2合成细胞，并将部分CO转化为CO2，见反应式(10)，这类细菌可用于处理汽车尾气中的CO以及其它含CO废气。因此，一氧化碳营养菌在能源和环境领域具有广阔的应用前景。
6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2(1) 2CO2+6H2→CH3CH2OH+3H2O(2) 4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2 (3) 4H2+2CO2→CH3COOH+2H2O (4) 10CO+4H2O→CH3CH2CH2COOH+6CO2 (5) 12CO+5H2O→CH3CH2CH2C H2OH+86CO2 (6) 10H2+4CO2→CH3CH2CH2COOH+6H2O (7) 12H2+4CO2→CH3CH2CH2CH2OH+7H2O(8) CO+H2O→H2+CO2(9) 2.19CO+O2→1.83CO2+0.36C细胞 (10) 然而，微生物的生长代谢，除了碳源(CO或CO2)和能源(CO或H2)外，还需要氮源、无机盐、生长因子。无机盐包括P、S、K、Na、Mg、Fe等大量元素以及Cu、Zn、Mn、Co、Ni、Se等微量元素，生长因子主要为各类维生素。由于一氧化碳营养菌的底物为无机物(CO、CO2和H2)，因此生长代谢所需的大量元素、微量元素以及各类维生素均必须额外补充。
以严格厌氧一氧化碳营养菌Clostridium ljungdahlii(菌种保藏编号为ATCC 55383或DSM 13528)为例，该菌能够利用合成气的主要成分(CO、CO2和H2)进行细胞生长并发酵产乙醇和乙酸。ATCC(美国标准菌种收藏所)提供该菌的发酵培养基配方如下NH4Cl 1g，KClO.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.8g，KH2PO4 0.1g，CaCl2·2H2O 20mg，酵母膏1g，微量元素溶液10mL，维生素溶液10mL，还原剂溶液10mL，蒸馏水980mL。
上述微量元素溶液配方为次氨基三乙酸2g，MnSO4·H2O 1g，Fe(SO4)2(NH4)2·6H2O 0.8g，CoCl2·6H2O 0.2g，ZnSO4·7H2O 0.2g，CuCl2·2H2O 20mg，NiCl2·6H2O 20mg，Na2MoO4·2H2O20mg，Na2SeO4 20mg，Na2WO4 20mg，蒸馏水1L。
上述维生素溶液配方为生物素2mg，叶酸2mg，维生素B6 10mg，维生素B1 5mg，核黄素5mg，烟酸5mg，泛酸钙5mg，维生素B12 0.1mg，氨基苯酸5mg，硫辛酸5mg，蒸馏水1L。
上述还原剂溶液配方为NaOH 0.9g，半胱氨酸·H2O 4g，NaS·9H2O 4g，蒸馏水100mL。
从上述配方可以看出，虽然用量很少，但是所需添加的营养成分较多，造成培养基配制程序较为繁杂，且某些微量元素和维生素的市场价格较为昂贵。因此，开发配制程序简单且成本低廉的一氧化碳营养菌发酵培养基，对于该类细菌在能源与环境领域的大规模工业应用，是必须解决的技术关键之一。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法，以简化培养基配制程序和降低培养基生产成本。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下两种技术方案实现。
第一种技术方案为，利用沼液生产严格厌氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，其流程如图1所示，包括以下步骤 (1)取正常运行的沼气池的沼液，经筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液，；滤液离心后获得上清液； 优选的筛网孔径小于2mm (2)根据不同的严格厌氧一氧化碳营养菌所需的pH值将上述上清液进行pH调节；表1列举了部分严格厌氧一氧化碳营养菌的最佳pH值，表1的内容为本技术领域公知技术，但一氧化碳营养菌不局限于这些细菌。
表1 部分一氧化碳营养菌的最佳pH值 (3)对完成pH调节的上清液进行氮气吹脱，以减少上清液中的溶解氧；将完成氮气吹脱的上清液在无氧气氛下进行分装；将完成分装的上清液灭菌，灭菌完成后取出冷却至室温； 上述无氧气氛指在100％的N2或CO2气体环境中。
(4)在无氧气氛下配制还原剂溶液，所述还原剂溶液配方为NaOH 9g，半胱氨酸·H2O40g，NaS·9H2O 40g，蒸馏水1L； (5)将还原剂溶液加入到已灭菌的上清液内，并摇匀，添加量为1L上清液添加10mL还原剂溶液； (6)至此获得成品瓶装厌氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，将其在0℃~4℃条件下冷藏备用。当使用时，可根据需要用无菌水进行稀释。
第二种技术方案为，利用沼液生产好氧或耐氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，其流程如图2所示，包括以下步骤 (1)取正常运行的沼气池的沼液，经筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液，滤液经离心获得上清液； 优选的筛网孔径小于2mm； (2)将上述上清液根据不同的一氧化碳营养菌所需的pH值进行pH调节； (3)将完成pH调节的上清液在常规条件(空气气氛下)进行分装，将分装后的瓶装上清液灭菌； (4)至此获得成品瓶装好氧或耐氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，将其在0℃~4℃条件下冷藏备用。当使用时，可根据需要用无菌水进行稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果是 (1)本发明所用的沼液来源广泛，且含有丰富的氮、磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁等氮源和大量元素，铜、锌、钴、镍、钼、锰、钨、硒等微量元素，以及各种氨基酸和维生素等生长因子，非常适合一氧化碳营养菌的生长代谢需求。采用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基，可以节省培养基配制所需的各类化学药品，降低生产成本。
(2)与传统的一氧化碳营养菌发酵培养基生产方法相比，利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基，方法简单、步骤较少、容易操作。
(3)以沼液作为生产一氧化碳营养菌的发酵培养基，能够变废为宝，提高沼液的附加值，实现物尽其用，从而使整个沼气工程系统更具经济性。
图1是本发明利用沼液生产严格厌氧型一氧化碳营养菌发酵培养基的流程图 图2是本发明利用沼液生产好氧或耐氧型一氧化碳营养菌发酵培养基的流程图
具体实施例方式 以下结合实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1 利用畜禽养殖废弃物沼气池的沼液生产严格厌氧型一氧化碳营养菌的发酵培养基，具体过程如下 (1)取正常运行的畜禽养殖废弃物厌氧消化沼气池的沼液，利用孔径为1mm的筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液； (2)将上述滤液于离心机内进行离心并获得上清液，离心机转速为5000转/分，离心时间为20分钟； (3)将上述上清液的pH调节为6.0； (4)对pH为6.0的上清液进行氮气吹脱，用100％的N2从上清液储罐底部通入并从顶部排出，氮气吹脱以减少上清液中的溶解氧； (5)经氮气吹脱后的上清液在厌氧操作箱内进行分装，上清液被分装在500mL密封瓶中，装填量为250mL，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装上清液； (6)将瓶装上清液置于高压灭菌锅内灭菌，控制灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟，灭菌完成后取出冷却至室温； (7)在厌氧操作箱内配制还原剂溶液，并利用孔径为0.45μm的无菌过滤器过滤，将过滤后的还原剂溶液装入带密封塞的1L无菌无氧瓶，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装还原剂溶液； 上述还原剂溶液配方为NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸馏水1L。
(8)利用一次性无菌注射器取2.5mL瓶装还原剂溶液加入到瓶装上清液内，并搅拌均匀，至此获得成品瓶装厌氧型培养基，并在0℃~4℃条件下冷藏备用。
利用实施例1获得的成品瓶装培养基，以CO、CO2和H2作为严格厌氧型一氧化碳营养菌(Clostridium ljungdahlii，菌种编号为ATCC 55383或DSM13528)的底物，进行细胞生长及产乙酸和乙醇发酵。
在无菌厌氧操作箱内，采用一次性无菌注射器将5mL的Clostridium ljungdahlii菌种液接种到具体实施例1获得的成品瓶装培养基中，摇匀后取2mL液样进行细菌浓度和乙酸、乙醇浓度检测。接种后充入混合气(10％N2+90％(CO+CO2+H2))，并在37℃的恒温摇床培养箱中培养15天，取气样和液样检测气体成分及液体中的细菌浓度和乙酸、乙醇浓度。培养前后的细菌浓度、气体成分比例及乙酸和乙醇浓度见表2。
表2 Clostridium ljungdahlii培养前后的细菌浓度、气体成分比例及乙酸和乙醇浓度 实施例2 利用城市生活有机垃圾厌氧消化沼气池的沼液生产严格厌氧型一氧化碳营养菌的发酵培养基，具体过程如下 (1)取正常运行的城市生活有机垃圾厌氧消化沼气池的沼液，利用孔径为1.5mm的筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液； (2)将上述滤液于离心机内进行离心并获得上清液，离心机转速为6000转/分，离心时间为15分钟； (3)将上述上清液的pH调节为6.2； (4)对pH为6.2的上清液进行氮气吹脱，用100％的N2从上清液储罐底部通入并从顶部排出，氮气吹脱以减少上清液中的溶解氧； (5)经氮气吹脱后的上清液在厌氧操作箱(上海新苗医疗器械制造有限公司生产)内进行分装，上清液被分装在500mL密封瓶中，装填量为200mL，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装上清液； (6)将瓶装上清液置于高压灭菌锅内灭菌，控制灭菌温度为115℃，灭菌时间为20分钟，灭菌完成后取出冷却至室温； (7)在厌氧操作箱内配制还原剂溶液，并利用孔径为0.45μm的无菌过滤器过滤，将过滤后的还原剂溶液装入带密封塞的1L无菌无氧瓶，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装还原剂溶液； 上述还原剂溶液配方为NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸馏水1L。
(8)利用一次性无菌注射器取2mL瓶装还原剂溶液加入到瓶装上清液内，并搅拌均匀，至此获得成品瓶装厌氧型培养基，并在0℃~4℃条件下冷藏备用。
利用实施例2获得的成品瓶装培养基，以CO、CO2和H2作为严格厌氧型一氧化碳营养菌(Clostridium carboxidivorans，菌种编号为ATCC BAA-624或DSM 15243)的底物，进行细胞生长及产乙酸、乙醇、丁酸和丁醇发酵。
在无菌厌氧操作箱内，采用一次性无菌注射器将4mL的Clostridium carboxidivorans菌种液接种到实施例2获得的成品瓶装培养基中，摇匀后取2mL液样进行细菌浓度和乙酸、乙醇、丁酸、丁醇浓度检测。接种后充入混合气(10％N2+90％(CO+CO2+H2))，并在38℃的恒温摇床培养箱中培养20天，取气样和液样检测气体成分及液体中的细菌浓度和乙酸、乙醇、丁酸、丁醇浓度。培养前后的细菌浓度、气体成分比例、乙酸、乙醇、丁酸、丁醇浓度见表3。
表3 Clostridium carboxidivorans培养前后的 细菌浓度、气体成分比例、乙酸、乙醇、丁酸、丁醇浓度 实施例3 利用来源于市政污水污泥厌氧消化沼气池的沼液生产严格厌氧型一氧化碳营养菌的发酵培养基，具体过程如下 (1)取正常运行的市政污水污泥厌氧消化沼气池的沼液，利用孔径为1mm的筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液； (2)将上述滤液于离心机内进行离心并获得上清液，离心机转速为8000转/分，离心时间为15分钟； (3)将上述上清液的pH调节为6.8~7.0； (4)对pH为6.8~7.0的上清液进行氮气吹脱，用100％的N2从上清液储罐底部通入并从顶部排出，氮气吹脱以减少上清液中的溶解氧； (5)经氮气吹脱后的上清液在100％的N2气氛下进行分装，上清液被分装在500mL密封瓶中，装填量为250mL，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装上清液； (6)将瓶装上清液置于高压灭菌锅内灭菌，控制灭菌温度为121℃，灭菌时间为20分钟，灭菌完成后取出冷却至室温； (7)在100％的N2气氛下配制还原剂溶液，并利用孔径为0.45μm的无菌过滤器过滤，将过滤后的还原剂溶液装入带密封塞的1L无菌无氧瓶，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装还原剂溶液； 上述还原剂溶液配方为NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸馏水1L。
(8)利用一次性无菌注射器取2.5mL瓶装还原剂溶液加入到瓶装上清液内，并搅拌均匀，至此获得成品瓶装厌氧型培养基，并在0℃~4℃条件下冷藏备用。
利用实施例3获得的成品瓶装培养基，以CO作为严格厌氧型一氧化碳营养菌(Carboxydothermus hydrogenoformans，菌种编号为ATCC BAA-161或DSM 6008)的底物，进行细胞生长及一氧化碳产氢发酵。
在无菌厌氧操作箱内，采用一次性无菌注射器将5mL的Carboxydothermushydrogenoformans菌种液接种到具体实施例3获得的成品瓶装培养基中，并取2mL液样进行细菌浓度检测。接种后充入混合气(10％N2+90％CO)，并在70℃的恒温摇床培养箱中培养10天，取气样和液样检测气体成分及液体中的细菌浓度。培养前后的细菌浓度和气体成分比例见表4。
表4 Carboxydothermus hydrogenoformans培养前后的细菌浓度和气体成分比例 实施例4 利用城市生活有机垃圾厌氧消化沼气池的沼液生产好氧型一氧化碳营养菌的发酵培养基，具体过程如下 (1)取正常运行的城市生活有机垃圾厌氧消化沼气池的沼液，利用孔径为1.5mm的筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液； (2)将上述滤液于离心机内进行离心并获得上清液，离心机转速为6000转/分，离心时间为15分钟； (3)将上述上清液的pH调节为7.0； (4)将pH为7.0的上清液在常规条件(空气气氛下)进行分装，上清液被分装在500mL密封瓶中，装填量为250mL，并用丁基橡胶塞塞住瓶口，再用铝封盖或螺旋盖封住瓶口，得到瓶装上清液； (5)将分装后的瓶装上清液置于灭菌锅内灭菌，控制灭菌温度为120℃，灭菌时间为15分钟； (6)灭菌完成后取出冷却至室温，至此获得成品瓶装好氧型培养基，并在0℃~4℃条件下冷藏备用； 利用实施例4获得的成品瓶装培养基，以CO为好氧型一氧化碳营养菌(Oligotrophacarboxidovorans，菌种编号为ATCC 49405或DSM 1227)的底物，进行细胞生长及CO转变为CO2的生化反应。
在无菌超净工作台内，采用一次性无菌注射器将5mL的Oligotropha carboxidovorans菌种液接种到具体实施例4获得的成品瓶装培养基中，摇匀后取2mL液样进行细菌浓度检测。接种后充入混合气(10％N2+70％CO+20％O2)，并在30℃的恒温摇床培养箱中培养25天，取气样和液样检测气体成分及液体中的细菌浓度。培养前后的细菌浓度和气体成分比例见表5。
表5 Oligotropha carboxidovorans培养前后的细菌浓度和气体成分比例 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法，其特征在于包括如下步骤
(1)取正常运行的沼气池的沼液，经筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液；滤液离心后获得上清液；
(2)根据不同的严格厌氧一氧化碳营养菌调节所需的pH值将上述上清液进行pH调节；
(3)对完成pH调节的上清液进行氮气吹脱，以减少上清液中的溶解氧；将完成氮气吹脱的上清液灭菌，灭菌完成后取出冷却至室温；将完成氮气吹脱的上清液在无氧气氛下进行分装；
(4)在无氧气氛下配制还原剂溶液；
(5)将还原剂溶液加入到已灭菌的上清液内，并摇匀，添加量为1L上清液添加10mL还原剂溶液；
(6)至此获得成品瓶装厌氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，将其在0℃~4℃条件下冷藏备用。
2.如权利要求1所述的利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法，其特征在于，所述还原剂溶液配方为NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸馏水1L。
3.一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法，其特征在于包括如下步骤
(1)取正常运行的沼气池的沼液，经筛网过滤去除大颗粒固体杂质，获得滤液；滤液经离心获得上清液；
(2)将上述上清液根据不同的一氧化碳营养菌调节所需的pH值进行pH调节；
(3)将完成pH调节的上清液在常规条件(空气气氛下)进行分装，将分装后的瓶装上清液灭菌；
(4)至此获得成品瓶装好氧或耐氧型一氧化碳营养菌发酵培养基，将其在0℃~4℃条件下冷藏备用。
全文摘要
本发明提供了一种利用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基的方法，以简化培养基配制程序和降低培养基生产成本。取正常运行的沼气池的沼液，经过滤、离心后获得上清液，根据不同的一氧化碳营养菌所需的pH值进行pH调节，然后分别在无氧或有氧气氛下加入还原剂，分别得到厌氧型或耐氧型一氧化碳营养菌发酵培养基。本发明采用沼液生产一氧化碳营养菌发酵培养基，可以节省培养基配制所需的各类化学药品，降低生产成本。方法简单、步骤较少、容易操作，能够变废为宝，提高沼液的附加值，实现物尽其用，从而使整个沼气工程系统更具经济性。
文档编号C12N1/20GK101768563SQ20101010947
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者李 东, 孙永明, 袁振宏, 孔晓英, 李连华 申请人:中国科学院广州能源研究所