专利名称：一种微量核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测方法，具体是一种微量核酸检测方法。
背景技术：
近年来，DNA分析技术广泛应用于医学、法学、环境等诸多领域，成为科学研 究的一大重点。然而，用于分析的样本DNA含量可能极其有限，少有遗损就可能导致无 法成功检测或者没有足够的样本DNA来满足再次检测的需要。因此如何对获得的极其微 量的DNA样本进行准确的定量，成为目前相关学科关注的热点之一。因此开发一种经 济、简便、快速的检测手段显得十分重要与迫切。石英晶体微天平可以适时检测DNA， 操作较为简便快捷，但是缺点是检测精度不高，无法达到临床检测的要求，从而限制了 它的推广。如(l)Patolsky，F. ； Lichtenstein，A. ； Willner, LJ.Am.Chem.Soc.2001， 123，5194-5205 ； (2) Patolsky, F. ； Lichtenstein，A. ； Willner，LJ.Am.Chem.Soc.2000， 122, 418-419 ； (3) Bardea A ； Dagan A ； Ben—Dov I.A.Bardea，A.Dagan, I.Ben—Dov, B.Amitand I.Willner, Chem.Commun. (1998)，839-840，。国内学者利用多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测，陈玲，刘超，王慧 君，邱平明.Evidence Science，2008Vol.l6, No.6, 754-756。但是这种方法操作较为繁 琐，同时需要知道原始DNA样本的浓度，因此该方法在实际使用中受到了很大限制。还 有人学者，对微量DNA检测也是采用PCR方法，但是他们采用乙醇沉淀法回收PCR中 的模版从而较少了微量DNA样本的损失，该操作的缺点一是操作较为繁琐费时，另外在 PCR过程和乙醇沉淀过程中模版DNA都会有损失，因此实际应用仍然受限。基于上述不足，本发明研究了新的微量核酸定量检测方法，研究基于 UltraPowerDNA核酸染料与核酸结合荧光信号会增强800-1000倍的原理，可以方便的进 行微量DNA的检测，而且检测的DNA分子量范围宽，更具实用性。同时引入了计算机 程序分析手段，不仅提高了分辨率同时降低了误差，最低可检出12.5pg/yL核酸。
发明内容
本发明的目的在提供一种微量核酸检测方法，以解决背景技术中的不足。一种微量核酸检测方法，利用UltraPowerDNA核酸染料与核酸结合荧光信号会 增强800-1000倍的原理，采用了计算机程序进行分析最低可检出12.5pg/μ L核酸，该方 法的具体步骤为(1)仪器安装首先将UltraPower可见光凝胶透射仪置于水平桌面；使用时，直接把变压器电 源插头接变压器插口，安装完毕待用；(2)试验操作将待测样品准备好，同时准备已知浓度的标准品DNA，染料为自主研发的 UltraPower核酸染料(即用型)，具体操作步骤
A标准品的处理标准品的浓度并不十分固定，可根据需要进行调整，一般核 酸的终浓度在10-2000pg/y L的条件下，可以得到比较好的线性关系。因此可将标准品 用蒸馏水稀释至浓度为1600，800，400，200，100，50，25pg/ μ L,同时以用于稀释 标准品核酸的蒸馏水做空白对照；B在透明管内进行操作，如可以使用PCR管或八连管等。将标准品和样品与 UltraPower核酸染料(即用型)等体积混勻(如5 μ L核酸溶液与5 μ L UltraPower 核酸 染料(即用型)混勻)此时标准品核酸的终浓度为800，400，200，100，50，25，12.5， Opg/ μ L,在室温下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料与待测DNA充分反应，反 应结束后将反应管放在透射仪的蓝色显色板上，将暗箱盖好；(3) DNA 成像打开UltraPower可见光凝胶透射仪的电源，由于UltraPower核酸染料与待测 DNA反应后会发出荧光，通过暗箱上方的显色片就可以清楚的观测到发光的DNA样品， 用数码相机拍照；(4) DNA样品浓度分析拍照后，打开计算机，进入pgdetect程序，将上步中拍好的图片导入pgdetect程
序，点击检测按钮进行DNA浓度分析；
pgdetect程序界面主要有以下几个部分组成
A添加控制点首先点击添加控制点，对标准品进行设定，鼠标点击对应的标 在pgdetect的界面右上角的表格中的序号一列中会自动出现控制点序号即1，2， 5等，双击序号在浓度一栏中输入相应的浓度； B删除选中控制点对控制点进行删除，首先选中要删除的控制点，点击此按
对控制点信息进行保存。点击此按钮，即可保存当前界面 点击此按钮，即可利用已经保存的控制点信息，对当前的 点击此按钮后，鼠标点击样品点处，在程序左下角即会出
准品， 3，4，
钮即可，C保存控制点信息. 的控制点信息。D读取控制点信息 未知样品进行定量检测。E计算当前点浓度 现未知样品浓度值。在本发明中，检测的核酸碱基数大于几十bp，所用的检测器为UltraPower可见
光凝胶透射仪。在本发明中，所述的成像系统主要由发射光源、滤光片和暗箱三部分组成，其 中光源由顺序排列的多个发光二极管构成，滤光片由塑料材质的亚克力板构成，暗箱是 由特质材料制备的箱体和长波滤光片两部分构成。在本发明中，所用的检测染料为的UltraPower核酸染料。在本发明中，待测核酸的终浓度在10_2000pg/yL范围内效果较好。在本发明中，核酸与UltraPower核酸染料的反应容器为透明的PCR管、八连管 等质地均勻的透明薄壁管。在本发明中，用于分析DNA浓度的计算机程序为pgdetect程序。本发明中，首先选择一种DNA染料，该染料可需具备以下几个特点，第一染料能和核酸样品结合并发出荧光，第二该染料灵敏度必须非常高，即有微量的DNA与之结 合便可以发出能被有效检测，第三染料最好对不同大小的DNA分子都有较好的结合效 果，然后必须找到一台对应的仪器可以准确的检测到DNA与核酸染料结合后发出的荧 光，并进行记录。最后为了克服人眼的主观性，保证检测数据有更高的可信度，应该有 一套计算程序用于对DNA与核酸染料结合后发出的荧光信号进行分析。有益效果本发明极大的避免外部因素如盐离子浓度、pH、DNA提取试剂残留(如乙醇， 苯酚，氯仿等)的影响，尤其适用于对微量DNA的定量。
图1 标准品 DNA 样品的测定。I8OOpg/ μ 1，2 400pg/ μ 1，3 200pg lOOpg/μΙ, 5 50pg/yl, 6 25pg/yl, 7 12.5pg/yl, 8 空白对照。图2未知浓度的DNA样品的测定。1原液，2稀释2倍，3稀释4倍， 倍，5稀释16倍，6稀释32倍，7稀释64倍，8空白对照。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明所涉及纳米焦磷酸氧钛新型光催化材料的制备及其光 催化降解应用作进一步说明。实施例1 标准品DNA样品的测定将10ug/ul的DNA标准品进行梯度稀释，稀释至浓度为1600，800，400， 200，100，50，25pg/yL。(1)取上述不同浓度的标准品DNA5ul于八连管中，每管中加入5ulUltraPower
核酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)将反应好的八连管放置于UltraPower可见光凝胶透射仪表面上，盖好透射仪 的盖子，打开电源进行观察，用数码相机进行拍照。(3)打开计算机，进入pgdetect程序，将照片输入计算机进行数据处理，用于未 知浓度的DNA样品浓度的分析。实施例2未知微量DNA浓度的检测取一根正常人的头发，从毛囊部分提取的DNA样本，将样品分别稀释O、2、 4、8、16、32、64 倍。(1)取上述不同浓度的标准品DNA5ul于八连管中，每管中加入5ul UltraPower核
酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)将反应好的八连管放置于UltraPower可见光凝胶透射仪表面上，盖好透射仪 的盖子，打开电源进行观察，用数码相机进行拍照。(3)打开计算机，进入pgdetect程序，将照片输入计算机进行数据处理，根据标 准品DNA的浓度分析未知浓度的DNA样品浓度。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的
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4稀释8技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是 说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改 进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权 利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.一种微量核酸检测方法，其特征在于该方法的步骤为(1)仪器安装首先将UltraP0wer可见光凝胶透射仪置于水平桌面；使用时，直接把 变压器电源插头接变压器插口，安装完毕待用；(2)试验操作将待测样品准备好，同时准备已知浓度的标准品DNA，染料为自主 研发的UltraPower核酸染料(即用型)，具体操作步骤A标准品的处理标准品的浓度并不十分固定，可根据需要进行调整，一般核酸的 终浓度在10-2000pg/yL的条件下，可以得到比较好的线性关系，将标准品用蒸馏水稀 释至浓度为1600，800，400，200，100，50，25pg/L，同时以用于稀释标准品核酸的 蒸馏水做空白对照；B在透明管内进行操作，如可以使用PCR管或八连管，将标准品和样品与UltraPower 核酸染料(即用型)等体积混勻(如5 μ L核酸溶液与5 μ LUltraPower 核酸染料(即用 型)混勻)此时标准品核酸的终浓度为800，400，200，100，50，25，12.5，Opg/ μ L, 在室温下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料与待测DNA充分反应，反应结束后 将反应管放在透射仪的蓝色显色板上，将暗箱盖好；(3)DNA 成像打开UltraPower可见光凝胶透射仪的电源，由于UltraPower核酸染料与待测DNA反应后会发出荧光，通过暗箱上方的显色片就可以清楚的观测到发光的DNA样品，用数码 相机拍照；(4)DNA样品浓度分析拍照后，打开计算机，进入pgdetect程序，将上步中拍好的 图片导入pgdetect程序，点击检测按钮进行DNA浓度分析；Pgdetect程序界面主要有以下几个部分组成A添加控制点首先点击添加控制点，对标准品进行设定，鼠标点击对应的标准 品，在pgdetect的界面右上角的表格中的序号一列中会自动出现控制点序号即1，2，3， 4，5等，双击序号在浓度一栏中输入相应的浓度；B删除选中控制点对控制点进行删除，首先选中要删除的控制点，点击此按钮即可，C保存控制点信息对控制点信息进行保存。点击此按钮，即可保存当前界面的控 制点信息；D读取控制点信息点击此按钮，即可利用已经保存的控制点信息，对当前的未知 样品进行定量检测；E计算当前点浓度点击此按钮后，鼠标点击样品点处，在程序左下角即会出现未 知样品浓度值。
2.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于可以检测的核酸 碱基数大于十bp。
3.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于所用的检测器为 UltraPower可见光凝胶透射仪。
4.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于所述成像系统主 要由发射光源、滤光片和暗箱三部分组成，其中光源由顺序排列的多个发光二极管构 成，滤光片由塑料材质的亚克力板构成，所述暗箱是由特质材料制备的箱体和长波滤光片两部分构成。
5.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于所用的检测染料 为的UltraPower核酸染料。
6.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于待测核酸的终浓 度在10-2000pg/yL范围内效果较好。
7.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于核酸与UltraPower 核酸染料的反应容器为透明的PCR管、八连管等质地均勻的透明薄壁管。
8.根据权利要求书1所述的一种微量核酸检测方法，其特征在于用于分析DNA浓 度的计算机程序为pgdetect程序。
全文摘要
一种微量核酸检测方法，本方法利用UltraPower DNA核酸染料与核酸结合荧光信号会增强800-1000倍的原理，采用了计算机程序进行分析最低可检出12.5pg/μL核酸。本发明极大的避免外部因素如盐离子浓度、pH、DNA提取试剂残留(如乙醇，苯酚，氯仿等)的影响，尤其适用于对微量DNA的定量。
文档编号C12Q1/68GK102010893SQ20101011472
公开日2011年4月13日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者万俊松, 周志图, 胡胜标 申请人:万俊松