专利名称：一种猪产仔数性状的分子标记方法
技术领域：
本发明属于动物的基因多态性技术领域，具体涉及猪的性激素结合球蛋白(SHBG)基因多态性。
背景技术：
性激素结合球蛋白(Sex Hormone-Binding Globulin，SHBG)，又称睾酮-雌二醇结合球蛋白，SHBG是一运输性激素的载体，动物性激素到达靶组织是由血液中的SHBG来调控的，SHBG是在肝细胞中表达的一种糖蛋白质，这种蛋白质特异性地与性激素相结合并参与其转运，调控血液中生物活性的性激素浓度。生理情况下，性激素结合球蛋白(SHBG)复合物的快速解离与游离性激素和SHBG相结合之间存在着动态平衡，性激素由于与SHBG结合而得到保护，从而避免了血管的吸附、生物和化学的破坏以及快速降解，只有游离的性激素才具有生物活性。性激素变化可引起性功能异常，但是，由于SHBG对游离性激素水平有调节作用，甚至即使血浆中性激素总体水平正常.而游离的性激素却可能异常。SHBG基因主要在肝脏、卵巢(或睾丸)内表达，虽然组织来源不同，但结构基因是相同的，由于SHBG基因发生单核苷酸突变造成SHBG分子一级结构的改变，改变了SHBG与性激素结合和运输的效率，从而使性激素(雌二醇、睾酮等)不能作用于靶组织，造成母猪的卵巢机能紊乱，使母猪出现乏情。因此，研究猪的SHBG基因多态性与母猪繁殖性能的关系，将对提高母猪繁殖性能提供又一分子遗传基础。
猪的SHBG基因至今尚未见研究报道。但人的SHBG相关研究较多，为研究猪的SHBG基因提供了宝贵的可借鉴的资源，人的SHBG基因位于17号染色体上的p12→p13，基因全长4kb，它是在激素和代谢调节因子的调控下由肝细胞进行表达合成。目前较多的研究主要在于人的SHBG基因多态性对性激素的调控水平上，以期能在遗传疾病方面获得进展。在人类SHBG基因上的研究表明，在患有高雄激素症，尤其是患有多囊卵巢综合症(Papillary SerousOvarian Carcinoma PSOC)和一些患有高度危险性的糖尿病和心脏病的人的血清中SHBG水平含量很低，说明SHBG与人的卵巢功能、血液中性激素及其他疾病有关。SHBG基因变异，尤其是在5’端座位上距翻译起始位点第8个碱基的A→G，极显著地影响血清中SHBG水平，Dunning等研究发现，该位点AA基因型个体比GG型个体的血液中SHBG含量高28％，Eriksson等也发现该位点AA基因型比AG和GG型个体分别高22％和26％。在内含子1中有一突变位点C→T，该突变位点也与SHBG含量存在着相关。在第8外显子存在一个A→G突变位点，该突变位点可导致SHBG蛋白的Asn氨基酸突变为ASP氨基酸，使SHBG含量改变，但比其他位点突变所改变的程度小，但Asn突变为Asp影响了一个潜在的糖基化位点，增大了少量等位基因编码蛋白的半衰期。含有6个单核苷酸的重复序列个体明显比不携带此重复序列的SHBG水平低。家兔SHBG的单体比人的短6个氨基酸残基，两个N-寡糖链连结于Asn345和Asn361上，没有O-寡糖链，也没有明确的内部重复序列。
目前，由于猪的SHBG基因尚无研究报道，于是安徽省农业科学院立项研究猪的SHBG基因结构及多态性分析，成功分离出了猪SHBG基因第4外显子至第6外显子的序列，建立了第6外显子突变体的检测方法，并分析了其多态性与产仔数之间的相关性。
发明内容
为了实现猪性激素结合球蛋白基因第6外显子突变体的检测，本发明提供一种猪产仔数性状的分子标记方法。
本发明方法包括猪基因组DNA的提取、性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子引物设计、体外扩增和基因型检测。
具体的操作方法如下 一种猪产仔数性状的分子标记方法，其特征在于包括以下操作步骤 (1)采集耳组织样 在仔猪出生当天，采取猪的耳缘组织； (2)基因组DNA提取 从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA； (3)引物设计 在猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子两端设计1对引物，即上游引物和下游引物，其序列如下 上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC长度bp217退火温度63℃， 下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT长度bp217退火温度63℃； (4)聚合酶链式反应 A、配制聚合酶链式反应体系 由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、浓度为50ng/ul猪的DNA基因组溶液2ul、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5ul，加水17.1ul至终体积25ul；并混合均匀，制得25ul聚合酶链式反应体系； B、聚合酶链式反应条件 将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下 ①94℃预变性4分钟， ②94℃变性30秒， ③退火温度63℃30秒， ④72℃延伸30秒， ⑤重复第②～④步骤35个循环， ⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物； (5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 由于猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子第17位碱基由A突变为G，导致了一个Aval限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是取猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物10ul于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入10U/ul Aval限制性内切酶1ul，Aval限制性内切酶缓冲液2ul，加水7ul，混匀，温度37℃反应3小时，得到酶切产物； 将酶切产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时，电泳条件常温，电压120V，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，GG型个体为产仔数性状优良基因类型，选择其中条带为GG型的个体留种，可提高选留群体的产仔数。
通过实验，对瘦肉型淮猪品系一世代猪群性激素结合球蛋白基因多态性与产仔数的相关性分析如下 224头淮猪新品系II系一世代母猪群性激素结合球蛋白(SHBG)基因多态性检测结果，见表3。A等位基因频率为0.487，G等位基因频率为0.513，该猪群在该位点存在着丰富的多态性，经卡方(x2)检验，在A17G位点上处于哈德-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡状态。
表3淮猪新品系一世代猪群SHBG基因多态位点遗传参数
性激素结合球蛋白(SHBG)基因多态性与产仔数的关联分析 利用SPSS13.0软件的一般线性模型(GLM)程序对224头的初产仔数进行最小二乘分析，并对基因效应进行了分析，结果见表4。GG型个体平均总产仔数最高为11.62头，显著高于AA型和AG型个体；GG型个体平均活产仔数为11.28头，极显著高于AA型和AG型个体，因此突变型(GG型)个体为该位点产仔数性状的优良基因型。从基因效应分析看，显性效应均为不完全显性，SHBG基因对总产仔数和产活仔数均表现出负的加性效应；A等位基因的平均效应值(总产仔数和产活仔数)分别为-0.549和-0.593，G等位基因的平均效应值(总产仔数和产活仔数)分别为0.522和0.563；G等位基因替代A等位基因的平均效应值分别为1.071和1.156。
表4SHBG基因多态性与初产仔数相关性及基因效应分析(均数±标准误)
注同一行肩标*与**(或**与***)表示差异显著(P＜0.05)；标有*与***表示差异极显著(P＜0.01)。
结论 在世代选育过程中未打破该位点的平衡状态。并分析了该突变与猪产仔数的关系，发现该位点与产仔数性状呈显著相关，GG型个体总产仔数比AA型个体高2.12头，活产仔数高2.28头，该群体中突变型个体(GG型)在产仔数性状上表现出较强的优势，是产仔数性状的优势基因型。G等位基因替代A等位基因的平均效应值为正效应，表明G等位基因为该群体的优良基因，增加G等位基因的频率可增加该群体的产仔数。
本发明的有益技术效果体现在以下方面 1、首次发现猪性激素结合球蛋白基因，并建立了检测第6外显子突变位点的检测方法。
2、首次发现第6位点多态性与猪产仔数存在着显著相关。
3、可以用于猪的育种中产仔数性状的辅助选择，可实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，运用该基因聚合方法可以经过一个世代就可以将性激素结合球蛋白基因的优良基因型稳定下来，即经一个世代的选育即将该品系的生长性状的优良基因达到纯合，而常规育种方法要经过大量的生产性能测定和后裔测定，并且要继代选育5个世代以上才能达到需要的效果，大大缩短了世代间隔，加快选择进程。
4、该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短(217bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。
图1为本发明性激素结合球蛋白(SHBG)基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图， 图2为性激素结合球蛋白(SHBG)基因SSCP非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图， 图3为性激素结合球蛋白(SHBG)基因部分序列比对分析图， 图4为性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子限制性内切酶(Aval)酶切图。
具体实施例方式 下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。
实施例 一种猪产仔数性状的分子标记方法的具体操作方法如下 (1)采集耳组织样 在仔猪出生当天，用猪耳号钳采取猪的耳缘组织0.2克左右，放入1.5ml的离心管中，倒入75％的酒精1ml左右，然后放入-20℃冰箱保存待用。
(2)基因组DNA提取 从冰箱中取出耳缘组织，用剪刀将其剪碎，倒入DAN组织提取液600ul，其DNA组织提取液配方见表1，提取液现用现配。然后放入55℃温浴12小时，然后加入Tris饱和酚600ul，上下摇动混匀15分钟，用低温高速离心机离心10分钟，离心机转速要求12000转/分钟；用1ml移液器取出上清液至已灭菌的1.5ml离心管中，再加入等体积的Tris饱和酚，再上下摇动混匀15分钟，再离心10分钟(12000转/分钟)；取上清液，加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入2倍体积的冰乙醇(约1ml)，再加1/10体积的约60μl的NaAc(醋酸钠)水平摇动，可见絮状、白色DNA样品出现。将样品置于-20℃冷冻30分钟，取出或挑出DNA或离心(12000转/分钟)10分钟，DNA沉于管底。用75％乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心5-10(12000转/分钟)。弃去75％的乙醇，自然干燥后，加入适量(约50μl)TE溶解，放-20℃冰箱中保存。
表1DNA组织提取液配方(总体积200ml) (3)引物设计 用Primer 5.0软件对猪的SHBG基因第6外显子两端设计1对引物，引物序列见表2。
表2SHBG基因第6外显子引物序列
(4)聚合酶链式反应(PCR) 25ul聚合酶链式反应体系，由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/ul Taq聚合酶0.4ul、浓度为50ng/ul的DNA基因组模板溶液2ul、含20mmol/l MgCl2的10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5ul，加水17.1ul至终体积25ul；并混合均匀。
聚合酶链式反应仪器的反应条件 ①94℃预变性4分钟； ②94℃变性30秒； ③退火温度63℃30秒； ④72℃延伸30秒； ⑤重复第②～④步骤35个循环； ⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存。
经以上反应得到SHBG基因的体外扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测。SHBG基因扩增片段长度为217bp；见图1。由图1看出没有非特异性扩增产物，可以进行下一步分析。
(5)单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析 取4ulPCR产物与变性缓冲液(1ml变性缓冲液中含去离子甲酰胺980uL、0.5M的EDTA20uL，溴酚蓝25mg)混匀置于聚合酶链式反应(PCR)管中，在98℃下变性10分钟，立即放冰浴5分钟，取出后立即上样于12％非变性聚丙烯酰胺凝胶孔中，室温下电压120V电泳13小时，银染显色，利用凝胶成像系统进行带型分析。见图2，由图2可知该位点存在3种基因型，即AA型、GG型和AG型。
(6)扩增产物的测序 对第(5)步的单链构象多态性检测(SSCP)分型后的两种纯合基因型，即AA型和GG型个体的PCR扩增产物进行回收纯化，并进行克隆，进行正反向测序，进一步验证电泳分型结果。然后将测得含突变位点的序列与GenBank中12号染色体和GQ478019序列进行同源性比对分析，分析发现外显子6的第17位发生了一个碱基A→G的突变，该突变导致了一个谷氨酰胺(Gln)被精氨酸(Arg)替换，即产生了错义突变，使野生型性激素结合球蛋白该位点的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，造成性激素结合球蛋白的一级结构的改变，变为突变体。如图3，左端第1个碱基为外显子6第1碱基。
(7)多态位点的限制性片段酶切多态性(RLFP)检测方法的建立 由于第6外显子第17位碱基的突变(A突变为G)导致了一个限制性内切酶Aval的酶切多态性位点，具体酶切步骤是取该基因的扩增产物10ul于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入浓度为10U/ul的AvaI限制性内切酶1ul，Aval限制性内切酶缓冲液2ul，加水7ul，混匀后入于37℃环境下反应3小时，后用12％聚丙烯酰胺凝胶，常温，120V电压电泳2小时，将凝胶置于凝胶成像系统下观测，其Aval限制性内切酶酶切结果，见图4，猪的性激素结合球蛋白SHBG基因第6外显子Aval限制性内切酶酶切图其中第5泳道条带为AA型，第8泳道条带为GG型，第1、2、3、4、6、7、9、10、11、12泳道条带为AG型。
权利要求
1.一种猪产仔数性状的分子标记方法，其特征在于包括以下操作步骤
(1)采集耳组织样
在仔猪出生当天，采取猪的耳缘组织；
(2)基因组DNA提取
从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA；
(3)引物设计
在猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子两端设计1对引物，即上游引物和下游引物，其序列如下
上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC，
下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT；
(4)聚合酶链式反应
A、配制聚合酶链式反应体系
由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、浓度为50ng/ul猪的DNA基因组溶液2ul、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5ul，加水17.1ul至终体积25ul；并混合均匀，制得25ul聚合酶链式反应体系；
B、聚合酶链式反应条件
将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下
①94℃预变性4分钟，
②94℃变性30秒，
③退火温度63℃30秒，
④72℃延伸30秒，
⑤重复第②～④步骤35个循环，
⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物；
(5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测
由于猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子第17位碱基由A突变为G，导致了一个Aval限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是取猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物10ul于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入10U/ul Aval限制性内切酶1ul，Aval限制性内切酶缓冲液2ul，加水7ul，混匀，温度37℃反应3小时，得到酶切产物；
将酶切产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时，电泳条件常温，电压120V，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，GG型个体为产仔数性状优良基因类型，选择其中条带为GG型的个体留种，可提高选留群体的产仔数。
全文摘要
本发明涉及一种猪产仔数性状的分子标记方法。本发明方法包括猪基因组DNA的提取、性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子引物设计、体外扩增和基因型检测。本发明首次发现猪性激素结合球蛋白基因，发现第6外显子的多态性与猪产仔数存在着显著相关；并建立了检测第6外显子突变位点的限制性片段酶切多态性检测方法。本发明方法可以用于猪的育种中产仔数性状的辅助选择，可实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，大大缩短了世代间隔，加快选择进程；该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短(217bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。
文档编号C12Q1/68GK101768642SQ20101011724
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者李庆岗, 陶立, 刘林清 申请人:安徽省农业科学院畜牧兽医研究所