专利名称：Lrrc55基因甲基化定量检测方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体地讲，涉及一种核酸的检测方法，尤其涉及到 LRRC55基因甲基化检测的方法。
背景技术：
恶性肿瘤的发生发展是多个基因相互作用，相互影响的过程，CpG岛甲基化异常是 这一渐成过程发生发展的重要机制，它包括高甲基化和甲基化不足两种类型。前期我们研 究发现，LRRC55 (leucine rich repeat containing 55，GeneID 219527)在胰腺癌中存在 高甲基化，且该基因在癌组织甲基化率明显高于癌旁组织，鉴于LRRC55的高甲基化于胰腺 癌的密切关系，促使我们建立一种新的LRRC55甲基化程度的定量检测方法，此方法可有助 于深入研究胰腺癌的发病机制和诊断治疗。目前DNA的检测方法很多，其中甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐处理 后PCR扩增产物克隆测序检测(BSP)和重亚硫酸盐处理后甲基化特异性PCR检测(MSP)是 应用最普遍的方法中的三种。甲基化敏感性限制性内切酶法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内 切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的胞 嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的限制性内切酶就会遇到问题。这种 方法所使用的两个经典酶对是HPaII-Msp I (CCGG)和Sma I-Xma I (CCCGGG)。由于第二对 限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用HPa II-Msp I (CCGG)。两个酶都识别CCGG序列， 而当其中的胞嘧啶甲基化时，HPaII不能够将其切开，利用Hpa II-Msp I的这种属性处理 DNA,这就使得HPa II-Msp I能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或PCR 扩增分离产物，明确甲基化状态。该方法存在下列缺点(1)由于CG不仅仅限于CCGG序列 中，因此非该序列中的CG将被忽略；(2)只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态 时，该检测方法的结果才有意义；(3)相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；(5)不适用于混合样本。重亚硫酸盐处理后PCR扩增产物克隆测序检测(BSP法)，是根据重亚硫酸盐使 DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。 基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物并扩增目的的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化 成胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行测序就可判断CpG位点是否发生甲基化。该方法的优 点是可靠性及精确度都很高，能检测到目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，缺点是 需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也比较高。重亚硫酸盐处理后甲基化特异性PCR检测(MSP法)，亚硫酸氢盐可以氧化去除基 因组DNA中胞嘧啶的氨基，在此反应中除m5C外其余胞嘧啶均可被转变为尿嘧啶。然后将 这些靶序列用特异引物进行扩增，经过扩增的DNA，所有尿嘧啶均转化为可检测的胸腺嘧 啶，只有m5C以胞嘧啶形式被扩增。这种方法是目前所使用的在给定基因组靶序列中分析 m5C最常用的方法。可以检测到每个CpG位点的甲基化情况。基于此原理，发展出亚硫酸
3氢盐去氨基反应后，结合PCR扩增的快速方法来检测m5C，称为甲基化特异PCR(MSP)，这种 MSP方法运用，特别设计的针对甲基化的和非甲基化序列的引物，从而得到特异扩增的甲基 化或非甲基化靶序列。目前已经被广泛应用到CpG岛甲基化检测。此方法适用范围很广， 可以检测包括已知的、接近PCR引物的及限制性酶切范围的CpG双核昔酸序列的甲基化状 况。MSP是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法，可检出比例为千分之一的甲基化片 段。可靠的MSP，关键在于引物，其引物设计需两个已知的、包含多个完全甲基化或非甲基化 CpG位点的区域，但具有上述特征的CpG岛不多，限制了 MSP的使用。该方法存在下列缺点 (1)这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方 法进行进一步检测；(2)若要区分甲基化引物与非甲基化引物扩增产物量的不同，需要严 格控制PCR反应的条件及循环数。目前尚无LRRC55基因甲基化相关的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于为克服上述各种方法的缺点，从而提供一种针对LRRC55基因 甲基化程度的操作简便、敏感性高的定量检测方法。为达到上述目的，本发明基于定量PCR基本检测方法，采用如下技术方案实施 LRRC55基因甲基化定量检测，包括如下步骤①选定LRRC55基因甲基化检测的靶序列。 选取-1417bp到-1161bp(以转录起始位点计为0)为检测靶序列，如图1所示，设计扩增 LRRC55甲基化序列的BSP、MSP及taqman-MGB检测探针。同时，选定参照基因ACTB检测靶 序列并设计相应的扩增引物和taqman-MGB检测探针。②制备标准品。采用人工合成或基 因重组生物合成方法获得代表LRRC55基因甲基化靶序列的重亚硫酸盐处理后的标准品序 列(即LRRC55甲基化标准品)，同时，获得参照基因ACTB检测靶序列重亚硫酸盐处理后的 标准品序列(即参照基因ACTB标准品)。③设计定量检测反应对待检样品DNA进行重亚 硫酸盐处理(采用QIAGEN EpiTect Bisufite kit试剂盒)，处理产物取出两等份一份进 行LRRC55甲基化的MSP扩增和taqman-MGB探针检测，同时检测不同梯度浓度的LRRC55甲 基化标准品，依据标准曲线，对LRRC55甲基化序列的拷贝数进行绝对定量；另一份进行参 照基因ACTB的PCR扩增和taqman-MGB探针检测，同时检测不同梯度浓度的ACTB甲基化标 准品，依据标准曲线，对ACTB的拷贝数进行绝对定量，ACTB的拷贝数相当于投入检测的总 基因组拷贝数。上述获得的LRRC55甲基化序列拷贝数除以ACTB的拷贝数，此比率为某一 检测样品DNA中LRRC55基因甲基化程度的定量值，即甲基化指数。本发明中，待测DNA取自个体样本，所述样本可选自手术组织、活检组织，穿刺液 积细胞、尿液、粪便、外周全血、外周血清/浆、胰液等。本发明的技术方案操作简便，敏感性高，准确性强，可以定量测定LRRC55基因的 异常甲基化程度。
图1 :LRRC55基因甲基化检测中引物和探针设计方案示意图其中弯折箭头表明LRRC55基因转录起始位点(以此计为Obp)，黑格表示LRRC55 基因的2个外显子。-1417bp -Iieibp为BSP扩增片段。图2是BSP克隆菌液测序曲线
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其中A为参照基因ACTB标准品序列；B为LRRC55甲基化标准品序列。图3是标准品定量PCR检测扩增曲线其中A图为不同浓度梯度ACTB标准品扩增曲线；B图为不同浓度梯度ACTB标准 品扩增Ct值-拷贝数的标准曲线；C图为不同浓度梯度LRRC55标准品扩增曲线；D图为不 同浓度梯度LRRC55标准品扩增Ct值-拷贝数的标准曲线。图4是组织HE染色显微照片其中A是胰腺癌组织HE染色；B是癌旁组织HE染色。图5是胰腺癌组织与癌旁组织甲基化定量PCR检测扩增曲线其中A为ACTB的扩增曲线；B为LRRC55基因的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的保护范围。实施例1 定量检测LRRC55基因(GeneID =219527)在患者临床样品中的甲基化程
度主要试剂及仪器来源QIAGENEpiTect Bisufite KitTM 试剂盒，pMD18_T Vector、EX-taq酶购买于宝生物工程(大连)有限公司，ABI TaqmanGene Expression Master Mix购买于美国应用生物系统公司，ABI 7500RealTime PCR仪购买于美国应用生物 系统公司，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。操作步骤一、利用基因扩增和生物工程方法制备标准品1.基因组DNA提取按常规酚/氯仿法抽提DNA。(1)取50mg胰腺组织放入5ml离心管中，加入700ul裂解缓冲液制成勻浆。(2)加入蛋白酶K至终浓度100ug/ml，55°C过夜，至溶液清亮为止。(3)加入 RNase 至终浓度 20ug/ml，37°C温育 30min。(4)加入等体积饱和酚，轻缓倒转混勻lOmin，室温下13000rpm离心lOmin，吸上清 入另一干净1.5ml离心管中。(5)重复步骤(4)，直至吸出上清清亮。(6)在上清中加入等体积酚氯仿，轻缓倒转混勻lOmin，室温下13000rpm离心 lOmin，吸上清入另一干净1. 5ml离心管中。(7)在上清中加入等体积氯仿，轻缓倒转混勻lOmin，室温下13000rpm离心lOmin， 吸上清入另一干净1. 5ml离心管中。(8)在上清中加入等体积异丙醇，轻缓倒转混勻后置于-20°C冰箱中沉淀 20-30min。然后13000rpm低温离心lOmin，去上清。(9)加入lml70%乙醇，13000rpm低温离心lOmin，去上清。(10)自然干燥后用去离子水150-200ul溶解沉淀，-20°C储存备用。2. DNA浓度测定应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度。
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3.亚硫酸盐转化参照QIAGEN EptiTect Bisulfite Kit 说明书，将抽提的DNA进行亚硫酸盐处
理。
(1)在0.2ml EP管中配制85ul Bisulfite Mix、35ul DNA Protect Buffer,500ng DNA、补水至140ul体系(2)在PCR仪上采用如下程序反应99°C变性5min、60°C孵育25min、99°C变性 5min、60°C孵育 85min、99°C变性 5min、60°C孵育 175min。(3)反应结束0. 2ml EP管取出，将反应液转移至1. 5ml EP管中(4)加入560ul新鲜配制的BL缓冲液，漩涡振荡(5)将混合液加入离心吸附柱中，套上收集管、最大转速离心lmin，弃收集管中液 体(6)加入500ulBW洗脱液于离心吸附柱中，最大转速离心lmin，弃收集管中液体(7)加入500ul BD缓冲液于离心吸附柱中，室温静置15min(8)重复步骤(6)两次(9)最大转速离心lmin，弃收集管中液体(10)将离心吸附柱放置于新收集管内，最大转速空甩Imin(11)将离心吸附柱放置于干净1.5ml EP管，加入20ul去离子水至柱基质中， 12000rpm/min 洗脱 DNA，_20°C保存4. BSP扩增和检测4. 1 BSP 反应(1)设计ACTB-BSP引物及探针ACTB BF :5，TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3，(SEQ ID NO 1)ACTB BR :5，AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3，(SEQ ID NO 2)ACTB-probe FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB(FAM-SEQ ID NO :3_MGB)扩增片段长度133bp，扩增后序列如GeneID 60所示(2)设计 LRRC55-BSP 引物LRRC55BF 5' GGTTTAGAAAAATGAGTTTG 3，(SEQ ID NO 4)LRRC55BR 5' CCTTCATCCCAACATCCCTT 3，(SEQ ID NO 5)扩增片段长度256bp，扩增后序列如SEQ ID NO :6所示反应体系为25 μ 1，反应条 件为:95°C预变性IOmin ；95°C变性30s. 53. 3°C退火30s. 72°C延伸30s，共40个循环。2. 0% 琼脂糖凝胶电泳确定了产物正确性。扩增序列如下GGC T T AG AAAA ATGAGT CT GCAT GAAGGGGAGCT GGGG TGAT T T CC AGGT G GGCGGGATTGAGGCTTGAAGCG .GTAGQAAMMfiGCAGCfiQCAGGiGlGG AGGGTGAGGGGAGGACCGAGG ACAGCAGGTGGGCAAGGG AGAAGCGAGAGGGCGCGGGGCGCGAGGGCT GAGGCTCTGGG.Cfil.G.GjCAIQV.GICIG&GICg.GICTGCTGGGGGCGGCGAGGAGAGTGCAGTGTGTGGM AGGGATGCTGGGATGAAGG(SEQ ID NO 6)上述区段也为标准品序列，单下划线表示设计BSP扩增引物的序列。此扩增片段中点状下划线标示的序列为设计MSP扩增引物的序列，双下划线标示的序列为MGB探针检 测的靶序列。4. 2T载体连接及转化将PCR产物纯化后，按pMDIS-T Vector的说明书进行连接，然后用电击法(分子 克隆实验指南第三版Page 1296)转化至E.coli DH5 α。4. 3菌液测序DNA测序由invitrogen公司承接完成。预期碱基序列为原序列中CpG位点均发生甲基化，其经亚硫酸盐处理后保持不 变，而单独的C均转化为T，克隆测序结果显示，其与预期碱基序列一致，依此分别挑选出 LRRC55和ACTIN的标准品克隆，如图2所示。5.标准品的制备用Axygen普通质粒小提试剂盒(离心柱型)对挑选出的标准品克隆进行质粒抽 提。(1)取Iml在LB培养基中培养过夜的菌液12000 Xg离心lmin，弃尽上清。(2)加入250ul含有RNaseA的BufferSl悬浮细菌沉淀，悬浮需均勻，不留有小的 菌块。(3)加入250ul BufferS2，温和并充分上下翻转4_6次混合均勻时菌体充分裂解， 直至形成透亮的溶液。(4)加入350ul BufferS3，温和并充分上下翻转混合6-8次，12000Xg离心lOmin。(5)吸取步骤⑷中的离心上清并转移到制备管中(试剂盒提供)，12000 Xg离心 lmin。弃滤液。(6)将制备管置回离心管，加入500ul Bufferffl, 12000Xg离心lmin。弃滤液。(7)将制备管置回离心管，加入700ul BufferW2，12000Xg离心lmin。弃滤液；以 同样的方法再用700ul BufferW2洗涤一次，弃滤液。(8)将制备管置回2ml离心管中，12000 X g离心lmin。(9)将制备管移入新的1. 5ml离心管中，在制备管膜中央加入60_80ul去离子水， 室温静置lmin, 12000Xg离心lmin, _20°C保存。标准品拷贝数换算拷贝数=(质量/分子量)X 6. 02 X IO23
标准品质粒分子量Ing质粒拷贝数
pMD18-LRRC552948bp X 660 (道尔顿 /bp) 3. 09 X IO8
pMD 18-ACTIN2825bpX660(道尔顿 /bp) 3. 23X108将标准品依次稀释成5 X IO7拷贝/ μ 1，5 X IO6拷贝/ μ 1，5 X IO5拷贝/ μ 1，5 X IO4 拷贝 / μ 1，5Χ103 拷贝 / μ 1，5Χ102 拷贝 / μ Ι,δΧΙΟ1 拷贝 / μ 1。二、对LRRC55标准品进行甲基化定量检测1.引物设计
在BSP扩增片段内设计MSP引物及探针LRRC55MF :5，GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC 3，(SEQID NO 7)LRRC55MR :5，AAAAAAACCGAAAATAATACCACG 3，(SEQID NO 8)LRRC55-probe FAM-ATAGTAGGTGGGTAAGGG-MGB (FAM-SEQ IDNO :9_MGB)
扩增片段长度130bp，扩增后序列为SEQ ID NO 6中所示序列的第74bp_203bp。2.实时定量PCR反应分别取各浓度梯度的标准品2μ1(即形成拷贝数梯度108，107，106，105，104， IO3, IO2, IO1jO)，运用MGB探针法进行定量扩增，反应体系25 μ 1，反应条件为95°C预变性 IOmin ;95°C变性15s. 60°C退火IOmin.共50个循环。其扩增曲线和标准曲线如图3所示。三、对ACTB标准品进行定量检测1.引物设计ACTB BF :5，TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3，(SEQ ID NO 1)ACTB BR :5，AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3，(SEQ ID NO 2)ACTB-probe FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB(FAM-SEQ ID NO :3_MGB)扩增片段长度133bp，扩增后序列如GeneID 60所示。2.实时定量PCR反应分别取各浓度梯度的标准品2μ1(即形成拷贝数梯度108，107，106，105，104， IO3, IO2, IO1jO)，运用MGB探针法进行定量扩增，反应体系25 μ 1，反应条件为95°C预变性 IOmin ；95°C变性15s. 60°C退火lOmin.共50个循环。其扩增曲线和标准曲线如图3所示。四、对患者临床样品进行LRRC55基因甲基化定量检测1.样品收集1. 1胰腺癌细胞株胰腺癌细胞株PaTu8988和ASPC购自中国科学院上海细胞所。1.2胰腺癌组织及癌旁组织取自2009年4月第二军医大学附属长海医院胰腺外 科手术切除标本2例，在手术切除病灶后用锋利刀片迅速切取原发肿瘤和切缘癌旁正常组 织各1块，立即冷冻于液氮中保存，取材时间不超过lOmin。所有胰腺癌经H-E染色病理学 证实均为导管源性，代表性切片HE染色如图4所示，并用冰冻切片进行粗分离。1. 3正常人白细胞取自2009年4月第二军医大学附属长海医院消化内科新入院 病人，空腹抽取外周静脉血1. 5ml，保存于EDTA抗凝管中_40°C冰箱冻存。1.4正常胰腺组织取自第二军医大学附属长海医院消化内科实验室冻存的尸检 标本中正常胰腺组织。2.样品基因组DNA提取、DNA浓度测定和重亚硫酸盐转化，方法同前。3.LRRC55基因甲基化定量检测从重亚硫酸盐处理后产物中取出两等份一份进行LRRC55甲基化的MSP扩增和 taqman-MGB探针检测，同时检测不同梯度浓度的LRRC55甲基化标准品，依据标准曲线， 对LRRC55甲基化序列的拷贝数进行绝对定量；另一份进行参照基因ACTB的PCR扩增和 taqman-MGB探针检测，同时检测不同梯度浓度的ACTB甲基化标准品，依据标准曲线，对 ACTB的拷贝数进行绝对定量，ACTB的拷贝数相当于投入检测的总基因组拷贝数。上述获得 的LRRC55甲基化序列拷贝数除以ACTB的拷贝数，此比率为某一检测样品DNA中LRRC55基因甲基化程度的定量值，即甲基化指数。引物、反应体系和反应条件同标准品检测。部分样 品检测的扩增曲线和所用的标准曲线如图5所示。定量检测结果如表2所示。表格1 LRRC55基因甲基化程度在不同样品中检测的定量值(即甲基化指数MI)
权利要求
一种LRRC55基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤A、待检样本处理用QIAGEN EpiTect Bisufite KitTM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；B、分别制备ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品设计并合成ACTB参照基因的BSP引物ACTB BF5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′ACTB BR5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′设计并合成LRRC55靶基因的MSP引物LRRC 55BF5′GGTTTAGAAAAATGAGTTTG′3′LRRC55BR5′CCTTCATCCCAACATCCCTT 3′ACTB参照基因进行BSP反应的条件95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；LRRC55靶基因进行BSP反应的条件95℃预变性10min；95℃变性30s.57.75℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；PCR产物进行纯化，连接入pMD18 T Vector，然后电击法转化至E.coliDH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品；C、在BSP扩增片段内设计MSP引物及探针LRRC 55MF5’GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC 3’LRRC55MR5’AAAAAAACCGAAAATAATACCACG 3’D、LRRC55基因甲基化的定量检测设计并合成ACTB的探针和LRRC55的探针ACTB探针FAM TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG MGBLRRC55探针FAM ATAGTAGGTGGGTAAGGG MGB对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和LRRC55基因的拷贝数；待检样本DNA中LRRC55基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中LRRC55基因甲基化程度的定量值。
2.根据权利要求1所述的一种LRRC55基因甲基化定量检测方法，其特征在于其中的待 检样本包括活检组织、穿刺液积细胞、尿液、粪便、外周全血、外周血清/浆、胰液。
全文摘要
本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的LRRC55基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织，提取DNA制备ACTB的标准曲线样品，利用全甲基化模板，制备LRRC55的标准曲线样品；提取待测组织DNA，并进行化学修饰，针对人LRRC55基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针，针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针，采用Taqman-MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，计算出LRRC55基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK101967514SQ20101012565
公开日2011年2月9日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者吕顺莉, 李兆申, 杜奕奇, 王小玮, 高军, 黄浩杰, 龚燕芳 申请人:中国人民解放军第二军医大学