专利名称：药用野生稻抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26-2和它在改良水稻抗病性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗白叶枯病主效基因Xa3/ Xa26-2的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片段能够赋予水稻抵抗由白叶枯病菌引 起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，转基因水稻可以产生由该基因介 导的对白叶枯病菌的防卫反应。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病 毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内 繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性 基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两 类(1)抗病(主效)基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。根据目前人们对抗病基因功能的认识，抗病基因的产物主要是作为受体，直接或 间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Chisholm等，2006)。抗病 基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但是农作物栽培种中抗病基因的资源有 限。从近缘物种中发掘新的抗病基因用于农作物遗传改良一直是研究者工作的一个重要目 标。水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水 稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起，是世界上对水稻危害最 大的细菌性病害之一(过崇俭，1995)。水稻栽培种(Oryza sativa L.)中抗病基因的资源 非常有限。如目前知道的抗白叶枯病基因只有大约30个(储昭晖和王石平，2007)。由于野 生稻长期处于野生状态，经受了各种不良环境和灾害的自然选择，形成了极其丰富的遗传 多样性。野生稻中蕴藏有优良抗病基因资源，是人们发掘新的优良基因的一个重要资源库。 已知的大约30个抗白叶枯病基因中就有多个基因是从野生稻中导入进栽培稻中的。如抗 白叶枯病显性基因Xa21源自西非长药野生稻(Oryza longistaminata)，对大多数白叶枯 病菌株表现高抗；但是该基因是成株期抗性，即只有在水稻成株期才对白叶枯病菌具有完 全抗性(Khush等，1990 ；Wang等，1996)。Xa21基因已经被分离克隆(Song等，1995)。一个 尚未被分离克隆的抗白叶枯病显性基因Xa23源自普通野生稻(Oryza rufipogon)，它具有 广谱抗性(章琦等，2000)。另一个已经被分离克隆的抗白叶枯病基因Xa27来自于四倍体 小粒野生稻(Orzyaminuta)，该基因抗白叶枯病菌菲律宾小种2、3、5和6 (Amante-Bordeos 等，1992 ；Gu等，2005)。此外，尚未被分离克隆的抗白叶枯病基因Xa29 (t)和Xa30 (t)是分 别从药用野生稻(Orzya officinalis)和普通野生稻中鉴定出的(谭光轩等，2004 ；王春连 等，2004)。
发明内容
本发明的目的是分离克隆药用野生稻(Oryza officinalis)中携带的抗白叶枯病 基因Xa3/Xa26-2和包含调控这个基因的启动子的DNA片段，利用这个基因改良水稻品种或 其他植物抵御病害的能力。本发明涉及分离和应用包含Xa3/Xa26-2基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列 表SEQID NO :1所示，它的编码序列如序列表SEQ ID NO :1中第3284-6191和6295-6662位 所示。该基因(片段)赋予水稻对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引 起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物 包括单子叶植物和双子叶植物。除上述所述的如SEQ ID NO :1所示的DNA片段外，本发明 所定义的基因还包括基本上相当于SEQ IDNO 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQID NO :1所示序列的亚片段。对序列表SEQ ID NO :1所示序列进行生物信息学分析表明，该DNA 序列编码一种受体蛋白激酶，它包含细胞外的富亮氨酸重复(leucine-rich repeat, LRR) 结构域和细胞内的蛋白质激酶结构域。可以采用已经克隆的Xa3/Xa26-2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本 发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因 组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的Xa3/Xa26_2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其 同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含Xa3/Xa26-2基因的序列或者包含一段 Xa3/Xa26-2基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，并表达Xa3/ Xa26-2基因，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所 不能达到的。将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗 传转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的将遗传连 锁累赘引入需改良的品种。同时，抗病基因的克隆可以克服传统育种不能在植物种间转移 抗病基因的问题。本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植 株和相应的种子，可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它的植物。本发明为增强水稻对白叶枯病的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将来源 于野生稻的Xa3/Xa26-2基因和它的调控DNA序列与遗传转化载体连接、转入感病水稻，改 良水稻对白叶枯病的抗性。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO 1.是本发明克隆的Xa3/Xa26_2基因的DNA序列。图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26-2以及验证Xa3/ Xa26-2基因功能的流程图。图2.籼稻品种明恢63中Xa3/Xa26基因和MRKa基因的结构及用于制备DNA探针 的PCR引物(箭头)位置。图3. Xa3/Xa26基因片段的DNA探针与9个BAC克隆的杂交结果。λ _ECoT14I是 DNA分子大小标准标准参照物(DNAladder ；购自大连TaKaRa公司)。图4.籼稻品种明恢63和药用野生稻中Xa3/Xa26基因家族成员的分布和序列同源性。每一个箭头代表一个Xa3/Xa26家族成员和转录方向。Xa3/Xa26和Xa3/Xa26_2基因 下游约有1. 4kb核苷酸序列同源程度达到83%。11. 9kb区段是用于遗传转化DNA片段。图5.遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。图6. T1代遗传转化植株中的报告基因GUS与抗病表型共分离。说明与GUS基因 紧密连锁的Xa3/Xa26-2基因与抗病表型共分离。对照为水稻感病品种牡丹江8 (遗传转化 的受体)。病斑面积为接种白叶枯病菌PX061两周后的数据。图7.与对照牡丹江8相比，携带Xa3/Xa26-2基因的遗传转化植株(D1010M43)对 不同白叶枯病菌的抗性都增强了。图8.Xa3/Xa26-2基因结构。箭头示用于基因结构分析的PCR引物位置和方向。 “ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每一种结构的核苷酸数目。
具体实施例方式本发明的前期研究结果显示来源于籼稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品种明恢 63的抗白叶枯病显性基因Xa3/Xa26属于多基因家族成员；这个家族的成员以串连排列的 形式位于水稻11号染色体的长臂(Yang等，2003 ；Sun等，2004，2006 ；Xiang等2006)。在 明恢63中，Xa3/Xa26家族由4个成员(Xa3/Xa26、MRKa、MRKc和MRKd)组成，它们的编码区 之间的DNA序列同源性为60%至78% (Sun等，2004)。Xa3/Xa26编码一个富亮氨酸重复 (leucine-richrepeat,LRR)蛋白激酶类蛋白(Sun等，2004)。根据本发明中的目标基因与 Xa3/Xa26基因序列同源性分析和它在药用野生稻(Oryza officinalis)的Xa3/Xa26家族 中与其他成员的相对应位置关系，确定该基因是Xa3/Xa26基因的等位基因，故命名为Xa3/ Xa26-2 基因(视 Xa3/Xa26 基因为 Xa3/Xa26_l)。以下实施例中进一步定义本发明。图1描叙了鉴定和分离克隆Xa3/Xa26-2基因 以及验证Xa3/Xa26-2基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可 以确定本发明的基本特征、并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出 各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 从药用野生稻中分离克隆Xa3/Xa26-2基因和基因结构分析1.鉴定携带Xa3/Xa26基因同源序列的大片段DNA本发明研究人员首先用Xa3/Xa26基因的特异性PCR弓丨物RKb_3，race2 (5，-TGGTCA AATACCGGAAGGAG-3，)和 RKb_2R (5，-CAGTCCACCACATGGACAAG-3，)和 Xa3/Xa26 家族成员 MRKa 基因的特异性 PCR 引物 RKa-llL(5，-TTGGCTTGAACGGCTTAACT-3，)和 RKa-IR(5，-AAGATGA AATATGCTCGGTGGT-3，)从明恢63中扩增出Xa3/Xa26基因和MRKa的DNA片段,扩增长度各 约Ikb (图2)。将这两段PCR扩增产物混合作为探针筛选药用野生稻(Oryza officinalis) 的基因组 BAC(bacterialartificial chromosome)文库(Ammiraju 等，2006)，鉴定了 9 个 阳性BAC克隆。这9个阳性BAC克隆(Ammiraju等，2006)由美国University of Arizona 大学的Rod Wing教授惠赠。将筛选到得BAC克隆扩大培养，采用标准碱裂解法分离提取 BAC质粒(Sambrook和Russell，2001)。将所得BAC质粒用Hind III完全酶切、电泳、转移 至尼龙膜；然后用上述Xa3/Xa26基因片段探针和MRKa基因片段探针分别与载有BAC质粒 的尼龙膜杂交(Sambrook和Russell，2001)。用Xa3/Xa26基因片段作探针的杂交结果显示 BAC克隆00Ba0120J21具有最多杂交带(图3)，推测该BAC克隆可能覆盖Xa3/Xa26基因家族区段。决定对00Ba0120J21克隆进行测序。2. BAC克隆的shotgun文库的构建本发明研究人员首先构建了用于测序的00Ba0120J21克隆的shotgun文库。采用 超声波法构建shotgun文库(Sambrook和Russell，2001)。用超声波处理00Ba0120J21克 隆的环形质粒1. 6秒(超声破碎仪Sonipr印150为SANYO公司产品，具体操作参考该仪 器的使用说明书)。通过琼脂糖凝胶电泳分离大约2. 0-3. 5kb的DNA片段，用UNIQ-IO 柱式DNA胶回收试剂盒(购自中国上海生工生物工程有限公司)从电泳凝胶中纯化DNA。 纯化后的DNA用T4 DNA聚合酶补平末端，与限制性内切酶SmaI酶切的去磷酸化的pUC19 载体(购自美国Amersham Bioscience公司)平端连接，电转化大肠杆菌DHlOB(购自美 国Invitrogen公司)(电转化仪为印pendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体 操作参考该仪器的使用说明书)。挑克隆检测插入片段大小提取阳性克隆质粒，并用空 PUC19质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用EcoRI和HindIII双酶切重 组质粒，检测插入片段大小，筛选插入片段大小合适的克隆作为shotgun文库用于测序。3. Shotgun文库的测序采用Ml 3-F (5 ‘ - G T A A A A C G A C G G C CA G T - 3 ‘)禾口 M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ‘)通用引物(购自中国上海生工生物工程有限公司)、美国 Perkin Elmer公司的测序试剂盒(BigDye Kit)，根据试剂盒说明书以双脱氧核苷酸末端终 止法分别从shotgun文库中随机挑选的克隆两端测序。4.原始序列的拼接使用Squencer 4. 5 软件(美国 Gene Codes Corporation)拼接序列。用 Squencer4. 5软件自动去除末端测序较差的序列和pUC19载体序列；软件没有去除干净的 序列则用手工删除。BAC载体的碎片序列和污染的细菌DNA序列通过和BAC序列进行比较 或BLAST分析的方法(Altschul等，1997)加以去除。用Squencer 4. 5软件对两条序列进 行拼接的参数是重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重叠序列的一致 性(Mini Match)大于85%。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个shotgun片 段序列。对于由一个shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确 性。5. DNA序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997)分析所得序列。然后采 用 Fgenesh(http//www. softberry.ru/berry.phtml) (Salamov 禾口 Solovyev, 2000) 禾口 GeneMark. hmm (http//exon.gatech. edu/GeneMark/eukhmm. cgi) (Besemer 禾口 Borodovsky, 2005)软件分析预测基因结构，分析结果进一步用Blastp方法(Altschul等， 1997)进行确定。两条或多条核苷酸或氨基酸序列的比较分析使用BLAST2 sequence方法 (Tatusova 等，1999)和 Clustalff 方法(http //www. ebi. ac. uk)。对BAC克隆00Ba0120J21测序和序列拼接形成三个大的序列片段，其长度分别为 84. Ikb, 25. 8kb和3. 3kb。序列分析发现在84. Ikb的片段上有4个基因编码LRR-蛋白激 酶类蛋白，与水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26编码的产物有不同程度的同源性，它们被命名 为 OoRKa、OoRKb 1、OoRKb 和 OoRKf (图 4)。用 Fgenesh,GeneMark. hmm 和 Blastx 分析表明， OoRKa, OoRKb和OoRKf是3个完整的基因，OoRKbl是一个不完整基因(图4)。OoRKa和OoRKb的转录方向相同，而OoRKf的转录方向与OoRKa和OoRKb相反(图4)。将该区段与水稻明恢63中Xa3/Xa26基因家族区段进行比较分析。发现药用野生 稻中的OORKa基因和明恢63中的MRKa基因的同源程度达到80 %，药用野生稻中的OoRKb 基因和和明恢63中的Xa3/Xa26 (又称为MRKb)基因同源程度高达95 % ；并且OoRKb和MRKb 基因下游约有1. 4kb区段同源程度达到83%，所以OoRKb为Xa3/Xa26的等位基因，我们命 名该基因为Xa3/Xa26-2 (图4)。实施例2 :Xa3/Xa26-2基因的功能验证1.遗传转化载体的构建本发明所用载体是pCAMBIA1301 (图5)，它是常用的水稻遗传转化载体(Sim等， 2004)。用限制性内切酶EcoRV从BAC克隆00Ba0120J21上酶切后回收11.9kb包含Xa3/ Xa26-2基因的编码区、启动子以及尾部序列的片段(图4)。同时，用限制性内切酶SmaI酶 切遗传转化载体PCAMBIA1301 ；酶切完毕，用SAP(虾碱性磷酸酶)去磷酸化；用氯仿异戊 醇(体积比24 1)抽提、纯化酶切产物。用包含Xa3/Xa26-2基因的酶切回收片段和纯化 好的载体做连接反应。通过酶切验证阳性克隆，获得的重组质粒被命名为D1010。2.遗传转化和Ttl代遗传转化植株分析采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将DlOlO导入水稻感病品 种牡丹江8(0ryza sativa ssp. japonica)。获得的遗传转化植株被命名为DlOlOM (该命名 的前面部分即DlOlO为遗传转化载体名称，M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转 化植株33株。对其中一半转化植株接种白叶枯病菌株PX061，另一半转化植株接种白叶枯 病菌株PX0341。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sim等，2004)。白 叶枯病菌株PX061和PX0341由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。白 叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sim等，2004)。接种14天后调查病斑面积(病 斑长度/病叶长度X % )。与对照牡丹江8及遗传转化阴性植株相比，绝大部分的阳性遗 传转化植株的抗性显著增强(表1)。表1. T0代遗传转化植株(DlOlOM)接种白叶枯病菌株PX061和PX0341的表型
7 (1)每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据 来自多个叶片的平均值士标准差。(2)阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。3.遗传转化植株的共分离分析为了验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与Xa3/Xa26-2基因转入相关，对在Ttl 代抗性增强的3株遗传转化植株(D1010M1、D1010M14、D1010M43)的T1代家系进行基因型和 抗性共分离分析。在孕穗期时接种白叶枯病菌PX061，接种14天后调查病斑面积。同时取样 抽取DNA，采用遗传转化载体所携带的报告基因GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)的PCR引物Gus2F (5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’)和 Gus2R(5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACCG-3 ’) 扩增检测阳性遗传转化植株。分析发现遗传转化植株的抗性增强和GUS基因共分离(图 6)。说明遗传转化植株的抗性增强是因为Xa3/Xa26-2基因的存在，Xa3/Xa26-2是一个抗 白叶枯病基因。4.遗传转化植株的抗谱分析对T1代遗传转化家系D1010M43及对照牡丹江8在孕穗期接种不同白叶枯病菌 株，分析遗传转化植株的抗谱。接种采用上述剪叶法。菲律宾白叶枯病菌株PX061、PX071、 PX0112、PX0341由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。中国白叶枯病 菌株是常用菌株(Sun等，2004 ;Li等，2009)。日本菌株T7174也是常用白叶枯病菌株(Cao 等，2007)。与遗传转化受体水稻品种牡丹江8相比，携带Xa3/Xa26-2基因的遗传转化植株 显著增强(P < 0. 01) 了对不同白叶枯病菌株的抗性(图7)。遗传转化植株的病斑面积只 是对照牡丹江8的12%至75%。这些结果说明Xa3/Xa26-2基因对白叶枯病菌具有广谱抗 性。5. Xa3/Xa26-2基因结构和编码产物分析本发明研究人员利用转基因植株(D1010M)分析了 Xa3/Xa26-2基因的结构。转基 因植株的总RNA的抽提采用TRIzol Reagent (美国Invitrogen公司)，操作方法按公司提 供的说明书进行。先将用于反转录的总RNA用无RNA酶活性的DNA酶I (美国Invitrogen公司)处 理，室温放置15分钟，去除总RNA中可能存在的DNA污染；再将总RNA在65°C处理10分 钟，灭活DNA酶I。用superscript III反转录酶(美国Invitrogen公司)，按其提供的说 明书进行反转录。采用跨越预测内含子位置的PCR引物RKb3F和RKb2R(表2)扩增基因组 DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物比基因组扩增产物小，说明该区段确实存在一个内含子 (图8)。采用Xa3/Xa26-2基因区段的其它引物(表2)进行反转录(RT)-PCR分析，没有再 发现其它内含子的存在。基因末端序列分析采用Clontech 公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒，根据试剂盒说明书，通过RACE (rapid amplification of cDNA end)分析方法，确 定Xa3/Xa26-2基因的5，和3，末端序列。
表2.用于RT-PCR和RACE分析的基因特异性引物 采用上述DNA测序方法，对RT-PCR产物进行测序。比较分析Xa3/Xa26-2基因的 cDNA序列和基因组序列，确定该基因由3600个核苷酸组成，包含两个外显子和一个内含子 (图8)。第一个外显子由2954个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO 1的3238-619Ibp 处)，其中包含由46个核苷酸组成的5，端非翻译区(untranslated region，UTR)(位 于序列表SEQ ID NO 1的3238-3283bp处)和2908个核苷酸组成的编码区(位于序列 表SEQ ID N0:1的3284-6191bp处)；内含子由103个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO :1的6192-6294bp处)；第二个外显子由543个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO 1的6295-6837bp处)，其中包含由368个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO 1的6295-6662bp处)和由175个核苷酸组成的3，端UTR(位于序列表SEQ ID NO 1的 6663-6837bp 处)。Xa3/Xa26_2基因编码一个由1092氨基酸组成的LRR受体激酶类蛋白质。XA3/ XA26-2蛋白与XA3/XA26蛋白的氨基酸一致性为92%，氨基酸的同源性为95%。参考文献储昭晖，王石平，(2007)，抗性基因分离克隆、结构与功能和分子进化，见章琦主 编，水稻白叶枯病抗性的遗传及改良。北京科学出版社，pp. 349-377。过崇俭(1995)中国农作物病虫害。中国农业科学院植物保护研究所主编，中国农 业出版社，PP. 14-24。谭光轩，任翔，翁清妹，时振英，祝莉莉，何光存，药用野生稻转育后代一个抗白叶 枯病新基因的定位，遗传学报，(2004)31 :724-729。王春连，赵炳宇，章琦，赵开军，邢全党，水稻白叶枯病新抗源Y238的鉴定及其近 等基因系培育，植物遗传资源学报，(2004)5 :26-30。章琦，赵炳宇，赵开军，普通野生稻的抗水稻白叶枯病新基因Xa23的鉴定和分子 标记定位，作物学报，(2000)26 :536-542。
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z， Miller W， Lipman DJ (1997)GappedBLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. NucleicAcids Res. 25 :3389_3402.Amante-Bordeos A， Sitch LA, Nelson R， Dalmacio RD, Oliva NP, Aswidinnoor H， Leung H(1992)Transfer of bacterial blight and blast resistance from the tetraploid wild rice Oryza minuta tocultivated rice，Oryza sativa. Theor. Appl. Genet. 84 :345_354.Ammiraju JS,Luo M，Goicoechea JL,Wang W,Kudrna D，Mueller C，Talag J,Kim H，SisnerosNB，Blackmon BiFang E,Tomkins JBiBrar DiMacKill D,McCouch SiKurata N， Lambert G，Galbraith DW,Arumuganathan K，Rao K,Walling JG,Gill N，Yu Y，SanMiguel P，SoderlundC，Jackson S, Wing RA(2006)The Oryza bacterial artificial chromosome library resource :construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the IOgenome types of the genus Oryza. Genome Res. 16 :140-147.Besemer J, Borodovsky M(2005)GeneMark :web software for gene finding in prokaryotes, eukaryotes and viruses. Nucleic Acids Res. 33 :451-454.Cao Y，Ding X，Cai M，Zhao J，Lin Y，Li X，Xu C，Wang S (2007)The expression pattern of a ricedisease resistance gene Xa3/Xa26 is differentially regulated by the genetic backgrounds anddevelopmental stages that influence its function. Genetics 177 :523_533.Chisholm ST, Coaker G，Day B，Staskawicz BJ (2006) Host-microbe interactions :shaping theevolution of the plant immune response. Cell 124 803-814.Gu K，Yang B，Tian D，Wu L，Wang D，Sreekala C，Yang F，Chu Z，Wang GL， White FFiYin Z. (2005)R gene expression induced by a type-Ill effector triggers disease resistance in rice. Nature 435:1122—1125·Li G， Song CF, Pang XM，Yang Y， Wang JS(2009)Analysis of pathotypic and genotypic diversityof Xanthomonas oryzae pv. oryzae in China. J. Photopathol. 157 208-218.Lin YJ, Zhang Q(2005)Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformationof indica rice. Plant Cell Rep. 23 :540-547.Khush GS, Bacalangco E，Ogawa T (1990) A new gene for resistance to bacterial blight from 0. longistaminate. Rice Genet. Newslett. 7 :121~122.Salamov A,Solovyev V(2000)Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res.，10 :516_522.Sambrook J，Russell D(2001)Molecular cloning :A laboratory manual. Cold Spring Harbor，NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press.Song WY, Wang GL，Chen LL，Kim HSiPi LY，Holsten T. Gardner J，Wang B，Zhai WX, Zhu LH,
Fauquet C，Ronald P(1995)A receptor kinase-like protein encoded by the rice diseaseresistance gene，Xa2L Science 279 1804-1806.Sun XiCao YiYang Z，Xu C,Li XiWang SiZhang Q(2004)Xa26，a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv. Oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant J. 37 :517-527.Sun X, Cao Y，Wang S (2006)Point mutations with positive selection were a major force during theevolution ofa receptor-kinase resistance gene family of rice.Plant Physiol. 140 :998_1008.Tatusova TA, Madden TL(1999)BLAST2 Sequences，a new tool for comparing protein andnucleotide sequences. FEMS Microbiol. Lett. 174 :247_250.Wang GL, Song WY, Ruan DL, Sideris S， Ronald PC(1996)The cloned gene, Xa21，confersresistance to multiple Xanthomonas oryzae pv. oryzae isolates in transgenic plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 9 850~855.Wu X，Li X，Xu C，Wang S (2008) Fine genetic mapping of xa24，a recessive gene for resistanceagainst Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice. Theor. App1. Genet. 118 :185_191.Xiang Y，Cao Y，Xu C，Li X，Wang S(2006)Xa3，conferring resistance for rice bacterial blight andencoding a receptor kinase-like protein, is the same as Xa26. Theor. App 1. Genet. 113 :1347_1355.Yang Z,Sun X,Wang S，Zhang Q (2003)Genetic and physical mapping of a new gene for bacterialblight resistance in rice. Theor. Appl. Genet. 106 1467-1472.
权利要求
一种分离的对白叶枯病产生抗性的基因Xa3/Xa26 2，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2.一种分离的对白叶枯病产生抗性的基因Xa3/Xa26-2，它的编码序列如序列表SEQ IDNO 1 中第 3284-6191 和 6295-6662 位所示。
3.权利要求1或2所述的基因在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含药用野生稻抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26-2的DNA片段的分离克隆和功能验证。Xa3/Xa26-2基因编码富亮氨酸蛋白激酶类蛋白质。它能够赋予水稻抵抗由细菌性病原菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的病害。将该片段与其自身调控序列直接转入水稻，携带Xa3/Xa26-2的转基因水稻对白叶枯病的抵抗能力显著增强。
文档编号C12N15/29GK101892244SQ20101012593
公开日2010年11月24日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者李弘婧, 王石平 申请人:华中农业大学