专利名称：：一种微生物群落结构的分析方法
技术领域：
：本发明属于生物分析
技术领域：
，具体涉及是一种利用不通过PCR的rRNA测序来分析微生物群落结构的方法。
背景技术：
：微生物群落结构的分析一直是微生物生态学和环境微生物学研究的热点。因此，根据对目标样品的种群结构和多样性解析其微生物群的动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要功能微生物类群提供可靠的依据。随着分子生物学技术的发展和广泛应用，从20世纪90年代初，它也被逐步引入了微生物生态学和环境微生物学领域，为该领域的研究提供了新的方法和前所未有的推动力。分子生物学技术的优势在于它规避了环境当中绝大多数微生物在目前条件下不可纯培养这一问题的困扰。随着核糖体RNA(rRNA)基因的分子生物学基因分析技术在微生物群落分析上的应用，研究环境样品的多样性成为了可能。这些方法主要基于从环境样品中提取DNA或者RNA，使用rRNA特异性的引物对模板DNA进行扩增，或对RNA先进行反转录后进行特异性扩增。基于16S和18SrRNA扩增和克隆文库构建的测序结果为微生物的群落结构多样性分析提供了高分辨率的分类信息。基因指纹图谱技术如DGGE，TGGE，T-RFLP等技术也为监测群落中主要种群变化提供了快速、准确的信息。然而基于特异性PCR扩增方法研究微生物群落结构和多样性的各种方法有其无法避免的缺陷性1)尽管研究者设计了越来越多的含有简并碱基的引物，针对rRNA基因序列的引物并不能匹配环境样品中所有的微生物，这会导致某些微生物群落未能被检测到，而某些微生物群落的含量被高估；2)由于PCR方法是对模板进行多个循环的扩增，而模板中不同微生物的扩增效率不尽相同，最终得到的PCR产物并不能反应原始模板中不同微生物含量的比例；3)由于所使用的引物是细菌、古生菌、真菌等群落特异性的，因而不能共同分析这些微生物在群落中的多样性和相对含量。近年来，焦磷酸测序(pyrosequencing)等高通量测序技术快速地发展起来，从而使低成本得到高通量的基因序列成为可能。通过在通用引物前加样品特异性的标签后进行PCR扩增，将多个样品的扩增产物混合后测序可以得到大量的序列，再通过标签将每个样品区分开来，这一方法已经广泛运用到环境样品的微生物群落结构和多样性分析。但此方法还是依靠引物，无法避免特异性PCR扩增的缺陷。元(宏)基因组分析可以避免PCR扩增的缺陷，但是因所得的元基因组数据中只有0.2%左右的结果与16S/18SrRNA基因相关，所以元基因组分析方法并不是最适合于微生物多样性的分析方法。本发明中所使用的利用不通过PCR的rRNA测序来分析微生物群落结构的方法避免了上述基于PCR的方法的缺陷。
发明内容本发明的目的在于提供一种能准确、定量反映环境样品中微生物的群落结构和多样性的分析方法。本发明提供的关于微生物群落结构的分析方法，是对环境样品抽提RNA后，不进行特异性PCR扩增，而是在反转录后直接进行高通量测序并进行分析的方法，具体步骤如下步骤一，提取环境样品的总RNA;步骤二，从总RNA中分离小亚基(16S/18S)rRNA;步骤三，通过随机引物对小亚基rRNA进行反转录，并对反转录产物进行测序；步骤四，从测序结果中抽提出小亚基rRNA序列；步骤五，根据所得的小亚基rRNA序列，与公共数据库对比得到序列相应的分类信息作为分类单元的依据，由此获得微生物群落结构特征。所述分离小亚基rRNA，是通过电泳来分离小亚基rRNA和大亚基(23S/28S)rRNA条带，并割胶回收小亚基rRNA。所述通过随机引物的反转录和测序，是通过随机引物合成双链DNA，并随机打断和/或割胶特定长度条带来使得适合于测序；或者通过加tag的随机引物合成双链DNA，并用tag序列对应引物来扩增此双链DNA并用于测序。所述从测序结果中抽取小亚基rRNA序列，是结合所测序列与自建多个微生物的各种类型(16S/18S/23S/28S)rRNA基因序列数据库和公共核苷酸序列数据库的BLAST结果来确定所测序列是否属于小亚基rRNA序列。所述根据小亚基rRNA序列的确定分类信息确定，是以小亚基rRNA序列与公共数据库的相似度或同源性来确定分类信息，从而确定微生物群落结构。本发明可以同时对一个环境样品中的细菌、古生菌、真核微生物进行定量的分析，它能够克服现有的基于PCR扩增的研究微生物群落结构和多样性的分子生物学方法的缺陷，由于本发明所研究的对象为微生物的RNA，因此能准确的反应环境样品中具有活性的微生物的群落结构和多样性，具有准确，定量化等显著优点，并适合于现有的高通量测序。本发明具有以下优点(—)本发明可以分析各种不同类型的环境样品的微生物群落结构多样性。本发明中所使用的方法操作简便，成本低廉，适用于一般的分子生物学实验室操作。(二)本发明所分析的对象为微生物的rRNA，因此反应的是样品中具有活性的微生物群落结构和多样性。(三)本发明不通过PCR扩增，因此规避了PCR过程中由于引物特异性和非特异性，扩增效率以及PCR本身固有的偏向性所产生的偏差。由于本发明不需要对RNA进行扩增，因此测序结果能够定量地反应样品种各类微生物的比例。图1为提取的RNA电泳图示。具体实施例方式取自污水处理厂曝气池中的活性污泥的微生物多样性分析活性污泥样品取自上海市一家城市污水处理厂的曝气池，实验步骤如下(—)液氮研磨法和Trizol总RNA抽提试剂盒(上海生工，上海)相结合提取环境样品的总RNA。1)将泥水混合物加入的50mlRnase-free的离心管中，lOOOOrpm离心5分钟，去掉液体。将样品分成0.5g每份装入1.5mlRnase-free的离心管中，浸入液氮待冻住后于-80。C保存。2)取0.5g样品和0.5g直径为212-300ym的玻璃珠于高温灭菌后的研钵中。3)加液氮覆盖，待液氮挥发后立即用力研磨至样品变为粉末。4)重复2)—次。5)在研钵中加入1000ii1Trizol，待粉末溶解后，将浑浊液转入1.5mlRnase-free的离心管中。6)将0.5g直径为212-300iim的玻璃珠加入含有0.5g样品的1.5mlRnase-free的离心管中，加入300ii1DEPC-ddH20。7)将离心管置于振荡器(Labnet，美国)上，使用最高转速振荡10分钟。8)在离心管中加入500ii1Trizol。注步骤2)-5)可以根据不同的样品改为步骤6)-8)，步骤2)-5)适用于样品中微生物含量较多，杂质较多的样品，步骤6)-8)适用于微生物含量较少，杂质较少的样品。9)加入100ii1氯仿，剧烈振荡30秒，120000rpm室温离心5分钟10)将水相转入新的1.5mlRnase-free的离心管中，加入150ii1无水乙醇，将管子反复颠倒数次混匀后将液体移到RNA结合柱中，将RNA结合柱放置在2ml收集管上。11)室温放置2分钟，8000rpm离心1分钟。12)将收集管中的液体倒掉，加入450ii1RPE溶液，10000rpm离心30秒。13)重复步骤12)—次。14)将收集管中的液体倒掉，10000rpm离心1分钟。15)将RNA结合柱放置于新的1.5mlRnase-free的离心管上，加入50iUDEPC-ddH20，75t:放置2分钟。16)10000rpm离心1分钟。(二)从总RNA中分离小亚基rRNA。1)将上述得到的RNA进行1%的琼脂糖电泳，缓冲液1XTAE，电压100V，30分钟。2)将琼脂糖胶放入300ml2yg/ml溴乙锭的TAE溶液中浸泡10分钟。3)将胶块至于312nm紫外光下，结果如图1所示，将16S/18SrRNA位置的胶块割下。4)按照Zymoclean(美国)的RNA胶回收试剂盒(货号R1011)的说明书操作，得到RNA纯化产物。5)使用nanodrop3300(美国)对回收的RNA进行定量，染料使用Ribogreen(Sigma，美国)。(三)对RNA反转录产物随机测序。1)使用Invitrogen(美国)的双链cDNA合成试剂盒将回收的RNA合成双链DNA，合成使用随机六聚体引物。2)合成的双链DNA随机打断成400-1000bp的片段。53)对这些片段使用罗氏GS-FLX焦磷酸测序系统进行高通量测序。(四)将16S/18SrRNA序列从大量随机测序序列中抽提出。1)将所有的序列运行NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行本地BLAST。2)分别选取多种细菌，古生菌，真菌，原生动物的16S，23S，或18S，28SrRNA基因的全长序列自建数据库，与所测序列进行BLAST。3)结合1)和2)得到的结果，将所有序列分为16S，18S，23S，28SrRNA基因和其他。不好区分类型手工进行分析。(五)对大量随机测序的16S/18SrRNA序列使用序列对应的分类信息作为分类单元确定的依据。1)对于16SrRNA序列，使用RDP数据库的Classifier工具(httD:〃rdo.cme.msu.edu/classifier/classifier.isp)进行分类。2)对于18SrRNA序歹lj，运行NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)本地BLAST,数据库日期为最新，使用MEGAN软件(http:〃www_ab.informatik.uni-tuebingen.de/software/megan)对BLAST结果进行分析和查看。通过上述实验步骤共得到原始序列33017条，其中大于400bp的序列20783条，16S，18SrRNA序列所占的比例分别为32.3%(6721条)和25.8%(5361条)。18SrRNA序列可以分为11个真核生物的门，主要为叶足门，纤毛门，轮虫门，脊椎动物门，环节动物门，顶复门等。16SrRNA序列主要为细菌和少量的古生菌，细菌可以分为19个门，主要为变形菌门，放线菌门，拟杆菌门，疣微菌门，绿弯菌门，厚壁菌门，浮霉菌门等，有34条序列为古生菌16SrRNA的序列，主要为甲烷微菌纲。除此之外，还有大量的可以确定为16S或者18SrRNA的序列在现有的公共数据库中没有对应的分类信息，这是由于现有的PCR引物是不能匹配所有的微生物的，而本发明避开了特异性PCR扩增的步骤，避免了引物的偏向性和局限性，因而可以得到更多的，以往没有发现过的微生物的序列信息。为了验证与本发明的结果对比，对该样品同样使用基于PCR的高通量测序方法进行分析，具体步骤如下(—)对样品提取RNA、16SrRNA割胶回收步骤与本发明所述相同。(二)对于(一)中得到的16SrRNA进行引物特异性的反转录并得到16SrRNAV3(细菌16SrRNA基因上的高变区域，通常用来分析细菌群落结构和多样性)区域PCR扩增产物。1)使用Invitrogen(美国)的双链cDNA合成试剂盒将回收的RNA合成单链DNA，使用的引物为519R(5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3')。2)将1)中得到的cDNA作为模板，使用Tiangen(北京)的MasterMixPCR试剂盒进行扩增，使用的引物为338F(5'-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3')和519R，反应条件为95。C预变性5分钟，94°C30秒，53°C30秒，72°C45秒，30个循环，最后72。C延伸7分钟。3)将PCR产物跑1%琼脂糖电泳，将相应的条带(约200bp)割下。4)使用Axygen(美国)DNA胶回收试剂盒进行纯化。(三)对16SrRNAV3区域PCR扩增产物使用罗氏GS-FLX焦磷酸测序系统进行高通量测序。对本发明中不通过PCR扩增所得到的16SrRNA序列中含有V3区域的序列进行筛选，得到含有完整的V3区的2428条序列。将这组序列与通过PCR扩增所得到的序列进行比较发现(如表l所示)1)两组序列所得到的分类信息的结果大致是相似的。2)两组序列所得到的分类信息中优势菌差异不大，但是含量较少的疣微菌门、绿弯菌门和浮霉菌门则有较大的差异。为了进一步分析这一差异产生的原因，将两组序列的引物与本发明得到的序列进行了对比分析(参见表1)，在这3个门的序列中，现有引物与本发明得到的序列不匹配的比例较高，这也正解释了通过PCR方法得到的序列中这3个门的序列较少的理由。其它门中也有一定比例的序列与现有引物是不能匹配的，这也说明了本发明的方法避免了使用PCR，避免了引物的干扰，可以得到更广泛的微生物群落多样性。表1本发明所得V3区域序列与基于PCR扩增得到的V3序列所对应的细菌多样性比较以及对PCR扩增中用到的通用引物序列的分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>对本发明序列中V3序列和基于PCR扩增得到的V3序列的多样性进行统计学分析，两种方法得到的序列中随机选取400条序列，采用0.03到0.3的序列差异来人为对序列分为可操作分类单元(0TU)时，rarefaction,ACE，Chaol等统计学的结果如表2所示。本发明所体现的细菌群落多样性都远远大于基于PCR扩增所得到序列。这再一次说明本发明方法应用于微生物多样性分析中的优点。表2本发明序列中V3序列和基于PCR扩增得到的V3序列统计学分析序RarefactionACEChaol列本发明序基于PCR扩本发明序基于PCR扩本发明序基于PCR扩差列中V3序增得到的V3列中V3序增得到的V3列中V3序增得到的V3异列序列列序列列序列0.03299(1187)12382712(5703)7871261(3422)5170.0274(963)2071789(3105)527911(2084)3780.1212(571)148709(1151)301470(968)2520.2103(177)54167(197)61152(198)640.332(41)1439(41)2339(41)17括号中的值为本发明序列V3序列数目为2428条时的0TU数目。权利要求微生物群落结构的分析方法，其特征在于具体步骤如下步骤一，快速提取样品的总RNA；步骤二，从总RNA中分离小亚基(16S/18S)rRNA；步骤三，通过随机引物对小亚基rRNA进行反转录，并对反转录产物进行测序；步骤四，从测序结果中抽提出小亚基rRNA序列；步骤五，根据所得的小亚基rRNA序列确定分类信息，并获得微生物群落结构特征。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离小亚基rRNA，是通过电泳来分离小亚基rRNA和大亚基(23S/28S)rRNA条带，并割胶回收小亚基rRNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述通过随机引物的反转录和测序，是通过随机引物合成双链DNA，并随机打断和/或割胶特定长度条带来使得适合于测序；或者通过加tag的随机引物合成双链DNA，并用tag序列对应引物来扩增此双链DNA并用于测序。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述从测序结果中抽取小亚基rRNA序列，是结合所测序列与自建多个微生物的各种类型rRNA基因序列数据库和公共核苷酸序列数据库的BLAST结果来确定所测序列是否属于小亚基rRNA序列。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述根据小亚基rRNA序列的确定分类信息，是以小亚基rRNA序列与公共数据库的相似度或同源性来确定分类信息，从而确定微生物群落结构。全文摘要本发明属于生物分析
技术领域：
，具体为一种分析微生物群落结构的分析方法，该方法包括如下步骤提取环境样品中的总RNA；从总RNA中分离小亚基rRNA；通过随机引物对小亚基rRNA进行反转录，进行测序；从测序结果中抽提出小亚基rRNA序列；根据所得的小亚基rRNA序列确定分类信息并获得微生物群落结构特征。本发明不使用特异性PCR扩增，避免了PCR过程中产生的诸多偏差，同时分析细菌、古生菌、真核微生物的群落结构，从而真实、全面地反映环境样品中微生物群落结构的特征。文档编号C12Q1/02GK101792807SQ20101013209公开日2010年8月4日申请日期2010年3月25日优先权日2010年3月25日发明者全哲学,李晓然申请人:复旦大学