专利名称：水稻的组蛋白赖氨酸甲基转移酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物组蛋白基因技术领域，具体涉及一种与水稻表观遗传学调控相关
的组蛋白赖氨酸甲基转移酶及其编码基因与应用，特别涉及该蛋白及其基因在调控植物生 长发育中的应用。
背景技术：
植物的生长发育和胁迫应答等过程都与基因的转录表达调控相关。而基因的转录 表达调控除了受遗传因素影响还受到表观遗传学(印igenetics)的调控。近几年，表观遗 传学已然成为生命科学研究的热点领域。在基因组中除了 DNA序列，还有许多调控基因的 信息，它们本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰，从而影响和调节基因的功能和 特性，并且通过细胞分裂和增殖遗传下去。组蛋白，作为染色质基本单位 一 核小体的核心 组成部分，其修饰是重要的表观遗传学修饰之一。研究组蛋白修饰以及这些修饰之间的不 同组合形成的组蛋白密码(histone code)对生命活动所有重大过程的调控机制将是表观 遗传学研究的长期任务。 组蛋白H3N末端36位赖氨酸(H3K36)的甲基化，通常被认为与基因转录激活相 关。然而其对植物生长发育的调控作用的研究近两年才刚刚开始。与真菌和动物中仅存 在一个或几个组蛋白H3K36甲基转移酶(histone lysine methyltransferase， HMTase) 不同，植物中一般存在多个H3K36甲基转移酶。根据chromDB(http:〃www. chromdb. org/) 的注释，在拟南芥基因组中有5个基因编码的蛋白质与真菌和动物中的H3K36甲基转移酶 同源，目前研究得最多的是SDG8(Zhao Z， Yu Y， Meyer D， Wu C， and Shen W_H. Prevention ofearly flowering by expression of FLOWERING LOCUS C requires methylation of histone H3K36. Nat CellBiol， 2005， 7， 1156-60.) 。 SDG8特异性地催化H3K36的双甲基 化和三甲基化，sdg8突变体由于SDG8的缺失，造成FLOWERING L0CUSC(FLC)包含重要转 录元件的启动子和第一个内含子的染色质区域的H3K36甲基化水平下降，致使FLC表达 水平下降从而最终导致植物早花。拟南芥SDG8除了影响开花时间，还被推测具有多种 生理功能。sdg8突变体除了表现出早花表型，还具有多种表型，包括植株明显变小，育性 下降等。Microarray的分析进一步显示SDG8可能在转录调节、信号转导、体内代谢等多 种生理途径具有潜在的功能O(u L, Zhao Z, Dong A, Soubigou—Taconnat L, Renou TP, Steinmetz A，and Shen WH. Di_and tri-but not monomethylation on histone H31ysine 36marksactive transcription of genes involved in flowering time regulation and other processes inArabidopsis thaliana. Mol Cell Biol，2008，28，1348-60.)。
拟南芥SDG8对生长发育的影响让我们思索水稻中它们的同源物是否具有同样重 要的功能。与双子叶植物拟南芥不同，水稻是单子叶植物的一个典型代表。双子叶和单子 叶植物，虽然可能基因间具有比较高的保守性，但它们的生长发育的调控机制可能存在很 大差异。由于水稻生命周期长等原因，相关研究相对于拟南芥来说还相当滞后，水稻中组蛋 白H3K36甲基化修饰的研究目前更是一片空白。而研究水稻的价值，不仅在于它巨大的经济价值，还在于它是研究同为单子叶禾本科植物玉米、小麦、高粱等其他作物的理想模型。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于水稻的组蛋白赖氨酸甲基转移酶及其编码基因 与应用。 本发明所提供的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，名称为SDG725，来源于水稻(0ryza sativassp. japonica)，是下述氨基酸残基序列之一
1)序列表中的SEQ ID No :1 ; 2)将序列表中的SEQ ID No :1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID No :1由2150个氨基酸残基组成。 编码本发明组蛋白赖氨酸甲基转移酶的基因(SDG725)，是下述核苷酸序列之一 1)序列表中的SEQ ID No :2的核苷酸序列； 2)编码序列表中的SEQ ID No :1蛋白质序列的DNA ; 3)与序列表中的SEQ ID No :2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相 同功能蛋白质的核苷酸序列； 4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No :2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。 上述高严谨条件为用0. 1XSSPE(或0. IXSSC)，O. 1% SDS的溶液，在65t:下杂 交并洗膜。 序列表中的SEQ ID No :2由6453个碱基组成，其编码框为自5'端第1-6450位碱 基，编码具有序列表中的SEQ ID No:l的氨基酸残基序列的蛋白质。 含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一 片段的引物对均属于本发明的保护范围。 本发明还提供上述组蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。 在实际应用中，将上述水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的反义表达载体转化水
稻，得到植株生长矮小的水稻，植物的生长发育得到调控。 上述重组表达载体均可按照常规方法构建。 本发明的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的反义转基因植株株系生长矮小。本 发明为植物品种的改良提供了一个优质基因，同时也对深入理解组蛋白赖氨酸甲基转移酶 的生物学功能和生物学过程，进一步破译组蛋白密码和理解组蛋白密码在高等植物生长发 育、遗传变异中的作用具有非常重要的意义。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实 际应用价值，应用前景广阔。
图1为水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因SDG725的蛋白活性测定结果。
图2为野生型水稻(WT)和T2代转反义SDG725基因水稻(sdg725)的表型图。
图3为野生型水稻(WT)和转反义SDG725基因水稻(sdg725)中SDG725基因表达 的荧光定量PCR检测结果。
具体实施例方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物由英骏生物技术有
限公司完成，测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。 实施例1.水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因SDG725的获得 对GenBank中公布的拟南芥的SDG8的基因序列(GenBank号NM_106379)通过同
源序列比较，从水稻基因组中获得同源序列，并根据该同源序列的5'和3'末端序列设计一
对引物，引物序列分别为5' -ATGGAGGAGCCTGACGGGGA-3'，和5' -TCAAAATCTTTGATTATTGTTA
GGA-3，。 提取水稻黄化苗总RNA(Promega， SVtotal RNAisolation system)，以水稻的总 RNA为模板，用AMV反转录酶(TaKaRa)合成cDNA(依据Plant RT-PCR Kit 2. Ol(TaKaRa) 的用户手册进行)。以cDNA为模板，PCR扩增水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因SDG725的 全长cDNA序列。50ul PCR反应体系包含模板2ul，高保真酶KOD plus (T0Y0B0) lul， 10X 缓冲液5ul，2. 5uM dNTP 8ul，20uM的5'和3'引物各lul，水32ul。反应条件为94。C预 变性2分钟；94。C变性30秒，55。C退火1分钟，68。C延伸6分30秒，共30个循环。反应结 束后，将PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约6500bp的扩增片段，将其 克隆到载体pUC19(TaKaRa)中，得到含有回收片段的重组质粒，经测序表明水稻组蛋白赖 氨酸甲基转移酶基因SDG725全长cDNA具有序列表中的SEQ IDNo :2的核苷酸序列，序列表 中的SEQ ID No :2由6453个碱基组成，其编码框为自5'端第1-6450位碱基，编码具有序 列表中的SEQ ID No :1的氨基酸残基序列的蛋白质，编码蛋白命名为SDG725。
实施例2.水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因SDG725的蛋白活性测定
以实施例l得到的pUC19-SDG725为模板，PCR扩增SDG725自5'端第3646-4656位 的核苷酸序列(包含组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性中心——SET结构域)，5'和3'引物分 别为5， -acggatccATGAATAAACAGAGTGATCTTATTC-3，，和5， -actcgagTCAACCACCGATGTAACCC CGG-3'。在50ii 1 PCR扩增体系中包含模版pUC 19-SDG725200ng， 5'和3'引物各20pmol， 10Xbuffer 5 ii 1， dNTP各20 ii M，高保真KOD plus (T0Y0B0) lul 。按以下条件进行扩增94。C 预变性2分钟；94。C变性30秒、55。C退火30秒、68。C延伸1分钟，共30个循环。PCR产物 经BamH I和Xhol酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4Tl (GE life sciences)，测序 验证其正确后得到大肠杆菌表达质粒pGEX-4Tl-SDG725set。 GST融合的SDG725set重组蛋白在大肠杆菌中的表达纯化依据Glutathione S印harose 4Fast Flow(GE life sciences)的用户手册进行。 组蛋白甲基转移酶的体外活性测定按Rea等(Nature, 2000， 406 :593-599)的方 法进行在30ii 1 MAB测活缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8. 5) ， 20mM KCl，10mM MgC12，250mM Sucrose, 100 ii M ZnC12， 10mM P -mercaptoethanol)中，力口入的酶(GST-SDG725set)，底 物(核心组蛋白H2A、 H2B、 H3和H4，购自Millipore)和250nCimethyl-14C-SAM(GE life sciences)，混合均匀，37t:反应1小时。反应产物经15% SDS-PAGE分离并染色脱色，凝胶 于7(TC真空干燥2hrs后放射自显影。 图1中上部为SDS-PAGE电泳结果，下部为放射自显影结果，GST蛋白作为阴性对 照，正对照为一已知的组蛋白H3的甲基转移酶。结果显示GST-SDG725set具有组蛋白H3
5的甲基转移酶活性。 实施例3.检测SDG725对水稻生长发育的调控作用
—、 SDG725反义表达载体的构建 利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，以SDG725基因为耙基因，构建 RNA干扰载体。以实施例1得到的pUC19-SDG725为模板，分别以两对不同的引物PCR扩增 SDG725自5'端第3639-3745位的核苷酸序列，作为发夹结构的互补DNA双链。所用的引物 对1为5，-aaggatccACCTCGCATGAATAAACAGAG-3，和5，-aaaagcttCAGTTTTGCAAGCAACAACTG -3'，所得PCR产物为fSDG725i (forward)。引物对2为5'-aagaattcCAGTTTTGCAAGCAACAAC TG-3，和5， -aaactagtACCTCGCATGAATAAACAGAG-3，，所得PCR产物为rSDG725i (reversed)。 为了便于后续的载体构建，在fSDG725i的5'和3'端分别添加了 BamH I和HindIII的限 制性酶切位点，在rSDG725i的5'和3'端分别引入了 EcoR I和Spel的限制性酶切位点。
为了便于RNAi载体的构建，在连接正反两条DNA分子的PDK内含子(由法国植物 分子生物学研究所提供)两端通过PCR方法分别引入了 Hindi 11和EcoR I的限制性酶切 位点，所用引物为5， -aaaagcttCCAATTTGGTAAGGAAATAATT-3，和5， -aagaattcTTTCGAACCCA GCTTCCC-3，。 将fSDG725i经BamH I和HindIII双酶切，PDK内含子经HindIII和EcoR I双 酶切，rSDG725i经EcoR I和Spel，连接入经BamH I和Xbal双酶切的pHB载体(由中 科院上海植物生理研究所林鸿宣课题组赠送)中，即得RNA干扰载体pHB-fSDG725i-PDK intron-rSDG725i 。 二、 SDG725反义表达载体转化水稻植株 参照Hiei等(Plant Mol Biol， 1997， 35 :205-218)的方法转化水稻。将质粒 pHB-fSDG725i-PDK intron-rSDG725i通过电激法转入根瘤农杆菌EH105中，经筛选获得阳 性克隆。将携带质粒pHB-fSDG725i-PDK intron-rSDG725i的农杆菌EH105接种到5ml含 100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中2『C摇菌培养至对数生长期晚期，再1 : 100扩大 培养到0D600为0.5左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水 稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗 性的阳性苗。待小苗长至10cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。
为了进一步确定该转基因性状的稳定遗传，将后来得到得T2代种子在室外网室 种植，结果如图2所示，转RNA干扰载体的水稻表现出明显的生长矮小。
三、荧光定量PCR检测转反义SDG725基因水稻中SDG725的表达
在相同条件下对转反义SDG725基因水稻和野生型水稻进行培育。按实施 例1中相同方法提取水稻总RNA并且反转录合成cDNA。然后用荧光定量PCR检测转 反义SDG725基因水稻和野生型水稻中SDG725的表达情况。检测SDG725所用引物为 5' -CTTCTGCCATACATGATGTTG-3' ， 5' -AGAGCAATTGGCAAATGTCT-3'。结果如图3所示，相对于 野生型水稻，SDG725的表达在转反义SDG725基因水稻中呈现明显的下降，进一步证明转反 义SDG725基因水稻的表型缺陷是由于SDG725的表达下降而引起的。
序列表
〈160>2
〈210>1
〈211>6453〈212>DNA〈213>稻属水稻(Oryzasativa ssp〈400>13tgg￡lgg￡lgCctgacgggga賜cgcgtggggg郷卿ggagggtgctgttggcggcggtggCggtgElgCtcggtgatggtggg皿ggtcg郷3卿tggagtccgagagtgaatgtttcteccccttttg皿gg皿ggEltgCElggElggggtctetg皿ratggcgggagctgaacccagcaatttgcagacgtgtcatttatttgctcccttcagcgaagttttctccg3C3朋gCg3c卿ggggagcatttgtgagttgggtggcgc皿cggacgtccacattgtgategcg郷gtttgtcggatgtggttgatggggtgggatttecgate皿gttg皿gctgaagtctcteggtctggtggtettgatgattctttecgcaagatggggatgtctcatetggcc皿tggtgatagtg皿ggatgccagtccaaggatgctcgac郷gg賜tc朋tgcgggcagggtgatttggt卿tgtegagatgattte皿c皿gggctttccatatttgtcatetgttCg皿g3C3g3tccteaccat3ctegaggagagttctctegttctetccattctgttgattttecttttgatggcaatgctgc皿tcatgggcatggttcaaggtctttea3gg3gtctcatgc卿tgagtgtga卿gggcttecagac郷tc朋gtgagtetggcaccgacatatteactggtgcteaccatgagctggt腿ggattcctgtccagtggatg郷catcgattcccttetec朋ag tggtgagttggctcatgatttgctcggag皿gttetggcttctggagacacttctgggtttgtg皿g3ggcacteg3tttccactcc朋ca皿gtcgctgactegttcgtcccateaccteccttgtacacccgccttctgccteggccatcaagat
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权利要求
一种水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶，其特征在于具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)SEQ ID No1所示的氨基酸残基序列；2)SEQ ID No1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
2. —种如权利要求1所述的组蛋白赖氨酸甲基转移酶的基因，其特征在于所述基因 是下述核苷酸序列之一1) SEQ ID No :2所示的的核苷酸序列；2) 编码的SEQ ID No :1蛋白质序列的DNA ;3) 与SEQ ID No :2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的 核苷酸序列；4) 在高严谨条件下可与SEQ ID No :2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3. 含有权利要求2所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的表达载体。
4. 含有权利要求2所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的转基因细胞系。
5. 含有权利要求2所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因的工程菌。
6. 扩增权利要求2所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因中任一片段的引物对。
7. 权力要求3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因在植物生长发育中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于将所述水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基 因的反义表达载体转化水稻，得到植株生长矮小的水稻。
全文摘要
本发明属于生物组蛋白基因技术领域，具体公开了一个水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶及其编码基因与应用。该酶是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID No1；2)将序列表中的SEQ ID No1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。该水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶的编码基因的反义转基因株系生长矮小。本发明为植物品种改良提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
文档编号C12N15/54GK101792748SQ201010132109
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者俞瑜, 叶盛, 朱炎, 沈文辉, 董爱武, 金菁, 隋鹏飞, 高娟 申请人:复旦大学