专利名称：一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法
技术领域：
本发明属微生物细菌的分离纯化领域，特别是涉及一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法。
背景技术：
全球每年染料生产量已超过7X105t，其中偶氮染料，含有一个或多个偶氮键(-N =N-)，占大约60% 70%。偶氮染料由于其广泛的色光、牢度高、应用方便、色泽鲜艳和能 耗低而广泛的用作着色剂。然而高达50%的染料在染色工艺中流失掉。这些有色废水不仅 产生视觉不悦而且其降解所产生的芳香胺具有潜在的诱变性和致癌性。染料废水的去处方法有物理法、化学法和生物法。虽然物理法和化学法如混凝法、 沉淀法、吸附法和臭氧氧化法用于含染料废水的处理，但是具有其费用高、产生有害副产物 和能耗高等固有的缺点。因此，生物处理由于其耗能少、费用低、效率高、不易产生二次污染 的优点，使其在含染料废水处理中的应用得到了广泛关注。然而，众所周知在一定条件下微 生物可以降解甚至完全矿化许多活性染料。脱色过程产生的中间代谢产物如芳香胺能被微 生物产生的羟化酶和氧化酶降解。活性染料常常是在厌氧条件下通过生物催化脱色的，芳 香胺等中间产物在好氧或厌氧条件下通过多步生物转化而被进一步降解。虽然微生物降解染料的工作已有很多报道，但是微生物既能降解蒽醌染料又能降 解偶氮的报道还很少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，该 方法从AAO工艺厌氧池的活性污泥中提取使染料活性黑5脱色菌株，种源易得且分离纯化 方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对染料活性黑5 二十五小时的脱色率可 达90. 48 %，具有良好的应用前景。本发明的一种使染料活性黑5染料高效脱色的菌株提取方法，包括(1)定向驯化培养取活性污泥(ΑΑ0厌氧池)按5%的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式 驯化法驯化2个月；(2)菌株的厌氧富集将驯化的样品按5%的接入量接种于富集培养液，于30°C下进行厌氧培养，每5天 更换一次培养液，即取出IOml原培养液加入IOOml新鲜富集培养液中，此后每第二次更换 培养液时，富集培养液中染料的浓度要逐渐增大，染料浓度分别为0. 01,0. 03和0. 05g/L ；(3)菌株的分离和纯化将上述染料浓度为0. 05g/L培养5天的培养液进行稀释(稀释浓度为10_6)，再于 固体培养基上进行分离纯化，确保长出纯的单一菌株，加50wt%甘油储存于4°C冰箱中，备用。
所述步骤(1)中的无机盐培养基为KH2PO4L 8g/L，Na2HP04 · 12H20 3. 5g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L, FeCl3 ·6Η20 0. Olg/L,葡萄糖 5. Og/L,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6· 8 7· O。所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入活性黑5染料，使其浓度为10、30和50mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30 35°C，静置条件 下进行驯化培养。所述步骤(2)中的富集培养液为牛肉膏3.0g/L，蛋白胨2.0g/L，蒸馏水IOOOmL, pH = 7. 0 7. 2。所述步骤(3)中的分离纯化是指将稀释后的菌液在固体培养基上划线，将培养皿 倒置于30°C培养箱中培养48h，，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2 4次，确保长出纯 的单一菌株。所述的固体培养基为在富集培养液中加入18g/L的琼脂粉，活性黑5染料，加热融 化，冷却后而形成的培养基，且固体培养基中的染料浓度与接入的培养液中染料浓度相同。所述的活性黑5染料高效脱色菌经16S rDNA序列测定，基因序列如下CAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAIAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACC菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI数据库中分析比较，鉴定为肠杆菌，其鉴定结果见图2，系统进化树见图3，同源性达到100%，命名为Enterobacter sp. GY-I ；所述的肠杆菌Enterobacter sp. GY-1革兰氏染色为阴性，无芽孢，无荚膜，专性厌氧，营养要求不高，产生水溶性色素，其电镜扫描见图4 ；该菌为短杆菌，菌体长度为0. 2 0. 5um,菌落直径大小为0. 5-2. 5mm,圆形，边缘整齐，表面低凸面，有光泽，呈乳白色，半透 明；在无机盐培养基中的培养特征为乳白色悬浊；最适生长条件PH为9. O 10.0，温度为 30 35 °C，静置培养。该肠杆菌Enterobacter sp. GY-I质粒检测结果表明该菌不携带质粒，因此脱色基 因编码于染色体上，这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移的过程中，避免了质粒的 不相容性，是构建具备多种脱色能力的基因工程菌的良好材料，且对一般抗生素均无抗性， 且易于灭活，保证了使用的生态安全性。本发明的肠杆菌Enterobacteria sp. GY-I不仅可以利用使双偶氮活性染料活性 黑5脱色，而且可使其它活性染料如活性红180、分散染料如分散黄163、酸性染料如酸性黑 IOB和蒽醌染料如活性蓝49等染料脱色；它对活性黑5的去除主要生物脱色而不是吸附作 用，从而对活性黑5达到很高的去除率(90%以上)，同时适量的外加碳源不但不会影响本 发明的菌株对活性黑5脱色作用，而且对其脱色具有促进作用。在肠杆菌Enterobacteria sp. GY-I对活性黑5的脱色过程通过紫外分光光度计 测定，检测结果见图6，结果表明活性黑5经该菌作用后，最大波长597nm处的特征吸收峰显 著降低，25小时活性黑5的脱色率达90. 48%，该菌对活性黑5的脱色作用较为彻底。取本发明分离得到的活性黑5高效脱色菌的单一菌落于各自的富集培养基中，各 富集培养基中均含有50mg/L的活性黑5，在30°C、250mL锥形瓶中装填量IOOmL的条件下进 行培养，培养时间为25h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中活性黑 5的剩余浓度。有益效果(1)本发明从实验室AAO厌氧池的活性污泥中提取活性黑5脱色菌株，种源易得且 分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；(2)提取的肠杆菌Enterobacter sp. GY-I可以有效地脱色活性黑5，25小时对活 性黑5的脱色率可达90%以上；该菌株是废水处理系统中的优势菌株，因此该菌株能适应 复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔；(3)提取的肠杆菌Enterobacter sp. GY-I不仅能有效的使活性染料脱色，而且对 蒽醌、偶氮等其它染料也具有较好的降解作用，对实际染料废水的处理具有很好的应用价值。
图1为活性黑5的分子结构式；图 2 为 Enterobacter sp. GY-I 的扫描电镜；图 3 为 Enterobacter sp. GY-I 的系统进化树；图4为缺氧和好氧条件下菌株对染料的脱色效果图；图5为菌株对其它染料脱色效果图；图6为活性黑5代谢中间产物的紫外可见光谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1(1)取自实验室AAO的活性污泥5ml接种于IOOmL无机盐培养基中，其中无机培养 基为 KH2PO4L 8g/L, Na2HPO4 · 12H20 3. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, FeCl3 · 6H20 0. 01g/L，葡 萄糖5. Og/L，蒸馏水1000mL，pH = 6. 8 7. 0。以梯度压力式驯化法驯化，分别依次加入活 性黑5染料，使其浓度为10、30和50mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30°C静置条件下 驯化培养2个月；(2)吸取5ml污泥加入含有富集培养液IOOml的250ml的三角瓶中，在30°C的生 化培养箱中厌氧培养，每5天更换一次培养液，即取出IOml原培养液加入IOOml新鲜培养 液中，此后每第二次更换培养液时，富集培养液中染料的浓度要逐渐增大，染料浓度分别为 0. 01,0. 03和0. 05g/L ；其中富集培养液为牛肉膏3. Og/L，蛋白胨2. Og/L，蒸馏水IOOOmL, ρΗ = 7. 0 7. 2。(3)将上述染料浓度为0. 05g/L培养5天的培养液适当稀释(稀释倍数10_6)，在 含有相同染料浓度的固体平板上多次分离划线后，获得纯菌种，加50%甘油储存于4°C冰 箱中待后续进行脱色试验。其中，固体培养基为在富集培养液中加入18g/L的琼脂粉，活性黑5染料，加热融 化，冷却后而形成的培养基，且固体培养基中的染料浓度与接入的培养液中染料浓度相同。实施例2(1)取ImL实施例1提取到的菌液加入到IOOmL的富集培养液(同上)中，30°C、 静置培养12小时。在两个含100mL(活性黑5浓度为50mg/L)富集培养液的250mL锥形瓶 中分别加入5mL的富集菌液，分别静置于30°C的恒温培养箱中和30°C、150r/min摇床中，培 养时间为35小时，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中活性黑5的剩 余浓度，从而确定出对活性黑5具有高效脱色作用的菌株。(2)取ImL实施例1提取到的菌液加入到IOOmL的富集培养液(同上)中，30°C、 静置培养12小时。在含100mL(活性黑5浓度为50mg/L)富集培养液的250mL锥形瓶中加 入5mL的富集菌液，静置于30°C的恒温培养箱中，培养时间为25小时，培养后通过电子显微 镜观察细菌生长情况以及测定溶液中活性黑5的剩余浓度，从而确定出对活性黑5具有高 效脱色作用的菌株。本发明所提供的一株活性黑5高效脱色菌，在初始ρΗ值为7. 0左右，温度为30°C， 250mL锥形瓶的装液量为IOOmL富集培养液的条件下，菌株接种量为8mL，活性黑5初始 浓度为50mg/L，培养时间25h，然后利用紫外分光光计进行测定，活性黑5的脱色率高达 90. 48%。
权利要求
一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，包括(1)定向驯化培养取厌氧-缺氧-好氧系统中厌氧池活性污泥按5％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；(2)菌株的厌氧富集将驯化的样品按5％的接入量接种于富集培养液，于30℃下进行厌氧培养，每5天更换一次培养液，即取出10ml原培养液加入100ml新鲜富集培养液中，此后每第二次更换培养液时，富集培养液中染料的浓度要逐渐增大，染料浓度分别为0.01、0.03和0.05g/L；(3)菌株的分离和纯化将上述染料浓度为0.05g/L培养5天的培养液进行稀释，稀释浓度为10-6，再于固体培养基上进行分离纯化，确保长出纯的单一菌株，加50wt％甘油储存于4℃冰箱中，备用。
2.根据权利要1所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于所述 步骤(1)中的无机盐培养基为 KH2PO4 1. 8g/L，Na2HPO4 · 12H20 3. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/ L, FeCl3 · 6H20 0. Olg/L,葡萄糖 5. Og/L,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。
3.根据权利要1所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于所述 步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入活性黑5染料，使其浓 度为10、30和50mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30 35°C，静置条件下进行驯化培 养。
4.根据权利要1所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于所 述步骤(2)中的富集培养液为无机盐培养基中牛肉膏3.(^/1，蛋白胨2.(^/1，调制？!1为 7. 0 7. 2。
5.根据权利要1所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于所述 步骤(3)中的分离纯化是指将稀释后的菌液在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培 养箱中培养48h，，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2 4次，确保长出纯的单一菌株。
6.根据权利要1或5所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于 所述的固体培养基为在富集培养液中加入18g/L的琼脂粉，活性黑5染料，加热融化，冷却 后而形成的培养基，且固体培养基中的染料浓度与接入的培养液中染料浓度相同。
7.根据权利要1所述的一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，其特征在于所述 的活性黑5高效脱色菌经16S rDNA序列测定和分析比较，鉴定该菌株为变形假单胞菌，命 名为Enterobacter sp. GY，菌体长度为0. 2 0. 5um，菌落直径大小为0. 5-2. 5mm,圆形，边 缘整齐，表面低凸面，有光泽，呈乳白色，半透明，无芽孢，无荚膜，专性厌氧，营养要求不高， 产生水溶性色素，革兰氏染色为阴性；最适生长条件PH为8 10，温度为30 35°C，静置。
全文摘要
本发明涉及一种活性黑5染料高效脱色菌的提取方法，包括(1)取活性污泥接种于无机盐培养基中进行梯度压力式驯化2个月；然后接入量接种于富集培养液，于30℃下进行厌氧培养，同时增加培养液中的染料浓度；最后于固体培养基上进行分离纯化，确保长出纯的单一菌株，加50wt％甘油储存于4℃冰箱中，备用。该方法从AAO系统厌氧活性污泥中提取活性黑5脱色菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对活性黑5的脱色率可达90.48％，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK101845411SQ20101013258
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者刘鑫, 李俊生, 陈东辉, 陈亮, 陈刚, 陈晔, 韩晓芳, 黄满红 申请人:东华大学