专利名称：一种大叶藻幼苗原生质体的制备方法
技术领域：
本发明涉及原生质体的制备方法，尤其涉及无菌大叶藻原生质体的制备方法。
背景技术：
原生质体是植物细胞除去细胞壁后裸露的球形细胞，它具有全能性，可在人工控制条件下进行大量快速繁殖，也可诱导其融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料。从海藻体分离出原生质体有机械法、微生物法、酶法等方法。一般酶法是较为理想而常用的方法。机械法获得的原生质体受到的损伤较大，不利于后续实验的进行。微生物法容易引起杂菌污染，对于后续愈伤组织形成及成苗带来污染。大叶藻(Zostera marina L.)俗称海带草，属于被子植物门(Angiospermae)，单子叶植物纲(Monocotyledoneae，或称百合纲Liliopsida)，泽泻目(Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大叶藻属(Zostera L.)，大叶藻为多年生草本植物，根状茎匍匐，节上生须根。茎疏生分枝，扁平，淡绿色。叶互生，绿色，长条形，长达50厘米以上，宽约3～5毫米，顶端圆形，全缘，有5～7脉，托叶膜质。肉穗花序初时包于佛焰苞内，长4～6厘米，花序轴扁平，边缘无苞片状附属物；花小，单性，雌、雄花沿花序轴一侧交互排成2列，无花被；子房卵状长椭圆形；柱头2，刚毛状。种子矩圆形，长约4毫米，有纵纹。大叶藻分布于我国的山东、河北、辽宁等沿海省份；以及分布于朝鲜、日本、欧洲、北美等国家和地区。无菌的大叶藻幼苗原生质体能为原生质体融合，遗传转化，植株再生，新品种培育打下基础。目前虽然有通过常规消毒方法及酶解条件获得无菌海藻原生质体的报道，如论文“带愈伤组织的高效率诱导”(刊登在《海洋与湖沼》1999年第06期第652～657页)介绍了无菌海藻原生质体多种常规消毒方法，其中一种常规消毒方法是将切好的组织块在1.5％浓度的碘化钾溶液中浸泡10分钟，用75％浓度的酒精棉球檫3次，再用高压蒸汽灭菌海水冲洗4遍，放入MS固体增富培养基中培养。论文“大型海藻的组织培养及其应用”(刊登在《植物生理学通讯》2007年第03期第605～611页)、论文“角叉菜(Chondrus ocellatusHolm)原生质体分离、培养与再生的研究”(刊登在《中国海洋大学学报(自然科学版)》1991年第01期第52～61页)、论文“条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究”(刊登在《海洋通报》2004年第05期第52～61页)介绍了无菌海藻原生质体常规酶解条件采用纤维素酶和海螺酶相结合，酶解时间2～3小时。这里的酶解时间不宜过长，否则原生质体会大量破碎，或者失去活性，所以研究者一般在酶解12小时后就会放弃后续的实验。但运用上述常规消毒方法及酶解条件在处理大叶藻时均不能得到大叶藻的原生质体。分析认为，大叶藻这种植物不属于海藻，属于一种生活在海水中的被子植物，正是由于大叶藻这个生理特点，目前还未见有关于大叶藻原生质体制备方法的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是 一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其步骤是 (1)将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养2天； (2)选取刚萌发的大叶藻幼苗； (3)将暂养后的大叶藻幼苗浸泡在75％浓度的酒精10秒； (4)将大叶藻幼苗浸泡在1％浓度的次氯酸钠溶液5分钟； (5)将大叶藻幼苗浸泡在1.5％浓度的碘化钾溶液10分钟； (6)将大叶藻幼苗用无菌海水冲洗3次，再用无菌海水浸泡10分钟，然后用无菌海水恢复浸泡20分钟； (7)将大叶藻幼苗从无菌海水捞出后用无菌棉布吸干，然后将大叶藻幼苗放入离心管中并加入酶液，酶液配方为海水1000重量份，纤维素酶470重量份，果胶酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在离心管中将大叶藻幼苗剪碎，剪碎的大叶藻幼苗在酶液中进行酶解； (8)酶解结束后，向酶液中加入等体积葡萄糖液体，静置，取上清液，然后过滤； (9)配置高渗海水，在过滤后的上清液中加入等体积高渗海水，用高渗海水洗3次在上清液中加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物； (10)第3次离心获得的沉淀物中加入培养液，摇匀后用离心机在2000r/min的转速下离心，即可收集到大叶藻幼苗原生质体。
上述步骤(7)的酶解优选条件为酶液PH值为4，温度保持15℃，0.6克纤维素酶浓度，酶解时间48小时。
上述步骤(8)的葡萄糖液体浓度为2摩尔/立方厘米，所述过滤的网孔径为300目。
本发明的有益技术效果由于大叶藻这种植物不属于海藻，是一种在海水中完成开花、结种和萌发的被子植物，正因为大叶藻这个生理特点，故大叶藻在成分及生理特性上介于海藻与被子植物之间，更接近于被子植物。本发明大叶藻幼苗经过酒精、次氯酸钠溶液、碘化钾溶液消毒处理后获得无菌幼苗；经过剪碎、酶解后处理得到大叶藻幼苗原生质体。由于大叶藻细胞壁的纤维含量高于其他藻类植物，因此本发明选择了纤维素酶和果胶酶相结合的酶解方法，并提高纤维素酶在酶液中的含量。在不影响大叶藻幼苗原生质体活性的前提下，延长酶解时间，酶解48小时是个突破，这么长的酶解时间，一般的海藻体会死亡，而大叶藻确不一样，酶解48小时，大叶藻幼苗原生质体达到数量高峰并具有活性。本发明方法能够克服污染，获得无菌大叶藻幼苗原生质体，为原生质体融合，遗传转化，植株再生，新品种培育等工作打下基础。另外，本发明方法也能为建立大叶藻细胞工程繁殖技术，快速繁育优良大叶藻品系，改良大叶藻遗传工程提供技术储备。
1、图1为本发明方法步骤流程图。
2、图2为本发明酶解处理48小时后获得的大叶藻幼苗原生质体照片。
3、图3为本发明酶解处理48小时后测定大叶藻幼苗原生质体直径的照片。
4、图4为本发明酶解处理48小时后中性红和甲基蓝染色光学显微镜下的大叶藻幼苗原生质体照片。
5、图5为本发明酶解处理48小时后中性红和甲基蓝染色光学相差显微镜下的大叶藻幼苗原生质体照片。
6、图6为纤维素酶浓度与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的折线统计图。
7、图7为酶解时间与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的折线统计图。
8、图8为PH值与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的折线统计图。
9、图9为温度与大叶藻幼苗原生质体释放量关系折线统计图。
具体实施例方式 下面结合附图和实施例详细说明 如图1所示，一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其具体步骤是 (1)将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养，在温度保持4摄氏度的双抗海水中暂养2天。大叶藻幼苗既可是天然生长的，也可是人工养殖或培育的，大叶藻幼苗培育方法之一见本请求人发明专利申请“一种大叶藻种子快速萌发方法”，申请号为200910223107.1。
本实施例双抗海水配方为青霉素浓度为每毫升100单位(100units/ml)，链霉素浓度为每毫升100单位(100units/ml)，即1升海水需0.48g(80万单位)的青霉素0.06克，以及需100万单位的链霉素0.1克，通过搅拌或摇匀等方法混合均匀即可。
(2)选取种子萌发一个月的大叶藻幼苗，本实施例取鲜重为0.025克大叶藻幼苗，这时大叶藻幼苗长出两片子叶，取完整的大叶藻幼苗，并去掉大叶藻幼苗胚乳部分。选取的大叶藻幼苗不宜生长时间过长，生长时间过长，大叶藻幼苗细胞纤维化成分过长，需要酶解的时间越长，这样对大叶藻原生质体的伤害会加大，不利于后期大叶藻原生质体成苗后续工作的进行。生长时间过短，大叶藻幼苗较小，未长出子叶，获得的原生质体种类不全，并且缺少叶子部分的大叶藻幼苗重量太轻，得不到理想数量的大叶藻幼苗原生质体。
(3)在无菌室超净工作台中放入75％浓度的酒精，然后将暂养后的大叶藻幼苗浸泡在75％浓度的酒精10秒。
超净工作台在使用前要进行紫外线灯照射，并开通无菌风，照射时间为30分钟，无菌操作室同时也要用紫外线灯照射30分钟，关闭紫外线灯15分钟后，人员进入无菌室进行具体操作。
(4)在无菌室超净工作台中放入1％浓度的次氯酸钠(NaCIO)溶液，然后将浸泡酒精后的大叶藻幼苗浸泡在1％浓度的次氯酸钠溶液5分钟。
(5)在无菌室超净工作台中放入1.5％浓度的碘化钾(KI)溶液，然后将浸泡次氯酸钠溶液后的大叶藻幼苗浸泡在1.5％浓度的碘化钾(KI)溶液10分钟。
(6)将浸泡碘化钾溶液后的大叶藻幼苗用无菌海水冲洗3次，即将大叶藻幼苗放入装有无菌海水的培养皿中，用镊子夹住幼苗，在水中涮洗，依次涮洗3次。再用无菌海水浸泡10分钟，目的是去除残留的碘化钾、酒精、次氯酸钠和生海水的残留；然后用无菌海水恢复浸泡20分钟，目的是让大叶藻幼苗的细胞能从刺激的环境中恢复过来，使细胞处于一种良好的状态，为下一步酶解作准备。无菌海水浸泡和恢复大叶藻幼苗要在不同的培养皿中进行。
无菌海水的制备方法是取生海水(该生海水系冷却到室温的煮沸过的海水)，在超净工作台中，经过121℃、1030帕斯卡(N/m2)高压灭菌后的不锈钢滤器进行抽滤，该不锈钢滤器与无油膈膜真空泵配套使用进行抽滤，抽滤滤膜孔径为0.22微米，通过抽滤获得无菌海水。
(7)将大叶藻幼苗从无菌海水捞出后用无菌棉布吸干，然后将大叶藻幼苗放入离心管(EP管)中并加入酶液1.25毫升，再用剪刀(本实施例采用长10厘米的医用手术剪刀)，离心管倾斜45度角，离酒精灯5～10厘米，在离心管中将大叶藻幼苗剪碎，一般剪碎时间在15～20分钟之间，剪到大叶藻幼苗组织块1立方毫米为宜。然后将装有剪碎的大叶藻幼苗和酶液的离心管置于15℃温度下酶解48小时。
无菌棉布剪成5×5厘米大小的正方形。在本实施例中，无菌棉布及需要无菌的器具都要用高压灭菌锅在121℃、1030帕斯卡(N/m2)高压下灭菌25分钟。
酶液配方为海水1000重量份，纤维素470重量份，果胶酶5重量份，山梨醇90重量份，本实施例以配置1.25毫升酶液为例，需1.25毫升海水(即1.275克海水，海水的密度按1.02克/厘米3计算)，纤维素酶0.6克，果胶酶0.0062克，山梨醇0.115克，用移液枪取1.25毫升海水加入到试管中，然后分别加入纤维素酶0.6克，果胶酶0.0062克，山梨醇0.115克。摇匀后，用离心机在500r/min转速下离心10分钟，去沉淀，将已去沉淀的上清液倒到新的离心管中，该上清液即为酶液。然后用浓度为1摩尔/升(即1N HCL)的盐酸将酶液调成pH值为4，配制好的酶液通过针头滤器，在操作净工作台抽滤，制成无菌酶液，针头滤器滤膜孔径为0.22微米。酶液保存温度不要超过20℃，避免酶液失活。本实施例采用将制备好的酶液暂放到4℃冰箱冷藏保存，使用时从冰箱拿出，在无菌室内恢复到常温使用，酶液最好是当天配当天用。
(8)酶解结束后，向酶液中加入与含有剪碎的大叶藻幼苗组织的酶液相同体积，浓度为2摩尔/立方厘米(2mol/dm3)的葡萄糖液体，使大叶藻幼苗原生质体漂浮在液体表面，加入葡萄糖液体后盖好离心管的盖子，然后缓慢摇匀，摇匀时间为1分钟，摇匀后树立静置20分钟，等单个的游离大叶藻幼苗原生质体细胞漂浮在液体上层，大的组织块沉在底部。通过移液枪取1.5毫升上清液，这时上清液有些浑浊，用300目的尼龙材质过滤网过滤上清液以去除沉淀杂物，该沉淀杂物主要成分为未酶解的组织块、细胞碎片。过滤后的上清液主要成分为大叶藻幼苗原生质体。
(9)配置高渗海水，在过滤后的上清液中加入与上清液等体积高渗海水，用高渗海水洗3次在上清液中加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速(即每分钟2000转)下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入同样体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入同样体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物。这时沉淀物的主要成分就是大叶藻幼苗原生质体。加高渗海水的目的是洗去多余的酶液、葡萄糖等杂质，同时高渗海水对原生质体是一种保护，使原生质体处于一种脱水状态，这样可以减少离心对原生质体的机械损伤。最后一次获得的沉淀物中加入1毫升的MS液体培养液悬浮原生质体，利用血球计数板进行血球计数，计数结果为19.5×105个/毫升，400×镜下每个视野大叶藻原生质体数在40个左右，单个大叶藻幼苗原生质体直径为12～15微米，如图3所示。通过甲基蓝和中性红检测活性，大叶藻幼苗原生质体存活率为80～90％，如图4和图5所示。
本实施例高渗海水配制比例为消毒海水100毫升，氯化钠(Nacl)1.5克，氯化钙(CaCl2)0.11克，氯化钠、氯化钙全部溶解在消毒海水后，通过不锈钢滤器在超净工作台进行抽滤，不锈钢滤器滤膜孔径为0.22微米。这里的消毒海水为煮沸过的海水，消毒海水煮沸时间为10分钟。
MS液体培养液配制比例为100毫升海水需0.48g(80万单位)青霉素0.006克，100万单位的链霉素0.01克，MS培养基3.474克，浓度为2毫克/升的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.25毫升。用量筒量取100毫升海水，依次添加MS培养基、青霉素、链霉素、2，4-二氯苯氧乙酸，摇均或搅拌均匀即可得到MS液体培养液。
(10)将溶解大叶藻幼苗原生质体物的MS液体培养液用离心机在2000r/min的转速下，离心5分钟即可收集到大叶藻幼苗原生质体，此时的大叶藻幼苗原生质体为略微发白的沉淀物。
本实施例重量通过电子天平称得。
图2为本发明在PH4、15℃、0.6克纤维素酶浓度条件下处理48小时后400×镜下视野的照片，图2中的椭圆球为大叶藻幼苗原生质体，近似透明的不规则体是死掉的原生质体进水后膨胀留下的残骸，即细胞碎片。每个视野下大叶藻幼苗原生质体个体数目为40个左右，本发明大叶藻幼苗原生质体个体数量是通过血球计数板计数，在纤维素酶浓度、酶解时间、PH值、温度上分别作了梯度实验，纤维素酶浓度、酶解时间、PH值、温度与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的实验结果折线统计图分别见图6、图7、图8、图9。
图3是本发明酶解处理48小时后测定大叶藻幼苗原生质体直径的照片。本发明大叶藻幼苗原生质体直径是通过倒置摄像显微镜上配置测量细胞大小的计算机利用软件进行测量。图3中的蓝线是电脑测定原生质体直径的线段，蓝线上面有显示原生质体直径的数字，图3右下角有红色标尺，红色标尺长度为100微米。通过计算机测量，单个大叶藻幼苗原生质体直径为12～15微米。
图4是大叶藻幼苗原生质体在PH4、15℃、0.6克纤维素酶浓度条件下，酶解48小时后通过中性红和甲基蓝混合染色后，普通显微镜视野下拍照的照片，图4照片中粉红色的物质为有活性的大叶藻幼苗原生质体，深蓝色的物质为没有活性的大叶藻幼苗原生质体，其它的东西为杂质。
图5是大叶藻幼苗原生质体在PH4、15℃、0.6克纤维素酶浓度条件下，酶解48小时后通过中性红和甲基蓝混合染色后，在相差显微镜下拍照的照片。图4照片中黑色物质为没有活性的大叶藻幼苗原生质体，粉红色物质为有活性的大叶藻幼苗原生质体，白色外壳的长条物和小灰黑点物质为杂质和死掉的原生质体分解后的残骸，即细胞碎片。
本发明通过中性红和甲基蓝染色后，随机照取100张照片，按照公式存活率＝活细胞数/总细胞数算出大叶藻幼苗原生质体存活率平均值。通过中性红和甲基蓝混合染色后，有活性的原生质体浅染，在显微镜下为粉红色；失活的原声质体深染，在显微镜下为深蓝色。通过活性检测，大叶藻幼苗原生质体存活率为80～90％。
本发明所述PH4表示酶液的酸碱值，即PH值为4；所述15℃表示酶液保持的温度；0.6克纤维素酶浓度表示0.6克纤维素酶溶于1.25毫升海水中纤维素酶的浓度，1.0克纤维素酶浓度表示1.0克纤维素酶溶于1.25毫升海水中纤维素酶的浓度，其它纤维素酶浓度的含义依次类推。
图6为纤维素酶浓度与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的实验结果折线统计图。通过图6可以看到，在0.075克～1.0克纤维素酶浓度范围内，随着纤维素酶浓度的升高获得大叶藻幼苗原生质体的数量逐渐提高。大叶藻幼苗原生质体数量与纤维素酶浓度呈正相关。在0.6克至1.0克纤维素酶浓度下，得到较高数量的大叶藻幼苗原生质体。由于海水量是固定的，随着纤维素酶浓度的增加，酶液逐渐趋于粘稠状，在1.0克纤维素酶浓度下大部分纤维素酶都没有溶解，并且得到的大叶藻幼苗原生质体数量与0.6克纤维素酶浓度相差不多。所以本发明选0.6克的纤维素酶浓度为最佳酶解浓度。此外，随着纤维素酶浓度的升高，酶液中所含对原生质体具有毒性的物质增多，导致原生质体破裂，也是影响大叶藻幼苗原生质体数量的一个因素。
图7为酶解时间与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的实验结果折线统计图。通过图7可知，在0～80小时的时间范围内，大叶藻幼苗原生质体产量开始随酶解时间的延长而增加，当达到48小时，产量达到最大值，为3.9×106个/毫升，随后，大叶藻幼苗原生质体产量随酶解时间的延长而开始下降，当酶解超过60小时后，原生质体数量趋于平稳。因此，酶解48小时是最佳酶解时间。
图8为PH值与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的实验结果折线统计图。从图8可知，随pH值增加，大叶藻幼苗原生质体释放量也逐步增加，在pH值为3～4时，适合大叶藻幼苗原生质体的产生。当pH值为4.0时，大叶藻幼苗原生质体产量最高，为1.3×106个/毫升，当pH值大于4，大叶藻幼苗原生质体释放量大幅度降低。
图9为温度与大叶藻幼苗原生质体释放量关系的实验结果折线统计图。从图9可知，酶解温度15～20℃时，适合大叶藻幼苗原生质体的产生。在15℃时，大叶藻幼苗原生质体产量最高，达4.4×106个/毫升，酶解温度低于或者高于15℃时，大叶藻幼苗原生质体产量均下降。可见，15℃是酶解的最适温度。低于或高于此温度，大叶藻幼苗原生质体产量均受影响。本发明选用15℃，该温度低于大叶藻的生活温度，从而不影响后续大叶藻幼苗原生质体的再生。
本实施例所用仪器均可在市场上购买，其来源及规格型号见下表 本实施例所用试剂均可在市场上购买，所用原料来源及规格见下表
权利要求
1.一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其特征在于，其步骤是
(1)将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养2天；
(2)选取刚萌发的大叶藻幼苗；
(3)将暂养后的大叶藻幼苗浸泡在75％浓度的酒精10秒；
(4)将大叶藻幼苗浸泡在1％浓度的次氯酸钠溶液5分钟；
(5)将大叶藻幼苗浸泡在1.5％浓度的碘化钾溶液10分钟；
(6)将大叶藻幼苗用无菌海水冲洗3次，再用无菌海水浸泡10分钟，然后用无菌海水恢复浸泡20分钟；
(7)将大叶藻幼苗从无菌海水捞出后用无菌棉布吸干，然后将大叶藻幼苗放入离心管中并加入酶液，酶液配方为海水1000重量份，纤维素酶470重量份，果胶酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在离心管中将大叶藻幼苗剪碎，剪碎的大叶藻幼苗在酶液中进行酶解；
(8)酶解结束后，向酶液中加入等体积葡萄糖液体，静置，取上清液，然后过滤；
(9)配置高渗海水，在过滤后的上清液中加入等体积高渗海水，用高渗海水洗3次在上清液中加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；
(10)第3次离心获得的沉淀物中加入培养液，摇匀后用离心机在2000r/min的转速下离心，即可收集到大叶藻幼苗原生质体。
2.根据权利要求1所述一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其特征在于步骤(7)的酶解条件为酶液PH值为4，温度保持15℃，0.6克纤维素酶浓度，酶解时间48小时。
3.根据权利要求1或2所述一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其特征在于步骤(8)所述葡萄糖液体浓度为2摩尔/立方厘米，所述过滤的网孔径为300目。
全文摘要
本发明公开了一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其具体步骤是将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养2天；选取刚萌发的大叶藻幼苗；依次通过75％浓度的酒精、1％浓度的次氯酸钠溶液、1.5％浓度的碘化钾溶液消毒；用无菌海水冲洗、浸泡和恢复；大叶藻幼苗在离心管中加入酶液并剪碎，然后进行酶解；酶解结束后加入葡萄糖液体并过滤；用高渗海水洗3次并离心获得沉淀物；沉淀物中加入培养液离心获得原生质体。本发明能够克服污染，获得无菌大叶藻幼苗原生质体，为原生质体融合，遗传转化，植株再生，新品种培育等工作打下基础，另外，本发明也能为建立大叶藻细胞工程繁殖技术，快速繁育优良大叶藻品系，改良大叶藻遗传工程提供技术储备。
文档编号C12N5/04GK101768568SQ20101013259
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月28日 优先权日2010年2月28日
发明者钱冠兰, 李晓捷, 罗世菊, 张壮志, 刘延岭, 王宏梅, 李志凌, 赵楠, 赛珊, 宋少峰 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司