专利名称：Egfr基因突变的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的 EGFR基因突变的快速检测。
背景技术：
EGFR是原癌基因c-erbBl的表达产物，是表皮生长因子受体家族(HER)中的4 个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用，该家族包括HERl (erbBl, EGFR)、HER2(erbB2, NEU)、HER3 (erbB3)及 HER4(erbB4)。其分子量为 170k D 的跨膜糖蛋 白，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。其氮末端胞外区又可分成4个亚区，是EGFR与 配体(转化生长因子-α、表皮生长因子、双调节素等)结合的部位；跨膜区由一个亲脂性 多肽螺旋构成；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。EGFR在非活性状态下是单体， 当受体与配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生自我磷酸化并启始一系列 胞内信号级联。与之相关的信号途径和信号传递蛋白有磷酯酶C-Y 1、磷酯酰肌醇3激酶、 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶等。最终激活相关核蛋白，促进细胞从G期过渡到S期。EGFR对细 胞衍生起重要作用，相关研究证明，EGFR在癌症发展过程中如血管生成及肿瘤细胞转移、粘 附和凋亡抑制等过程中起重要作用。转化生长因子-α和EGFR在实体瘤中过表达，往往标 志着病情进一步发展和不良预后(Yarden Y.Nat Rev Mol Ce U Biol，2001，2 (2) 127-137)。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表 面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪 氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、 糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR存在于大多数细胞中，在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、 前列腺癌和非小细胞肺癌等，其中在结直肠癌的阳性表达率为25% % (Mendelsohn J, . J Clin Oncol，2003，21 (14) :2787_99)，在胃癌的阳性表达率为 38% 51. 5% .这种 异常表达与肿瘤细胞的增殖、新生血管形成、侵袭、转移及抗凋亡等有关，过度表达的EGFR 常常预示着无病生存期和总生存期下降、复发及远处转移的风险增加(Opdwyer PJ, Semin Oncol，2002，29)。同时表达EGFR及其配体TGF-α的胃癌预后差，5年生存率只有12%，而 EGFR及TGF- α表达水平正常或者只有某一过度表达的胃癌，5年生存率则有45%和36% (Shah MA,. Proc Am Soc Clin Oncol, 2005, 24 :abstr 4025)。Radinsky 等检测了大肠癌手 术后标本的EGFR表达情况，发现晚期大肠癌(Dukes’D期、肝转移)的EGFR mRNA的水平是 早期病变的10 20倍。约40% 80%的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer. NSCLC)上调表达表皮生长因子受体(印idermal growth factor receptor, EGFR), EGFR ff 号系统参与肿瘤侵袭、血管生成、凋亡障碍和化放疗抗拒，是NSCLC治疗重要靶点之一。吉 非替尼是EGFR酪氨酸激酶(TK)的抑制剂，II期临床试验表明，对部分NSCLC具有较好的 疗效，二线治疗的缓解率为10% 19%。癌组织中EGFR的表达水平与吉非替尼疗效无关。 研究报道，吉非替尼的疗效与EGFR受体基因第18、19、20和21外显子突变有关，对吉非替尼反应患者多伴有EGFR基因的突变。因此，建立快速检测NSCLC瘤组织EGFR基因突变的 方法，有助于筛选患者进行治疗。以易瑞沙(Iressa)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI) 能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传 导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。易瑞沙 是一种口服的分子靶向治疗药物，是表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸酶抑制剂(TKI)，由 于EGFR-TK及其信号通路在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的发生、 发展中起着重要的作用，所以通过阻断它来治疗肿瘤是一热点。易瑞沙于2005年在中国上 市，是目前唯一拥有与标准二线化疗对照的临床数据的表面生长因子受体_酪氨酸激酶抑 制剂。临床实践显示易瑞沙对非小细胞肺癌的疗效存在很大的个体差异，仅有8-18%的个 体会有很好效果。通过对这些患者组织EGFR基因的突变分析，发现绝大多数个体在EGFR 基因酪氨酸激酶区域发生突变。这些突变主要集中在外显子18-21上，其中以19号外显子 内缺失突变以及21号外显子的L858R最为常见。因此，通过EGFR基因18-21号显子的突 变检测可以很好预测易瑞沙的治疗效果。本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测EGFR突变，协助临床医生筛选抗 EGFR靶向药物的有效患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。恶性肿瘤病人血浆或血清中存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细 胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这 是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究 的一个热点。目前，血浆突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。检测EGFR还可以 通过该基因的突变状态了解病人的复发转移风险。通过血清或血浆中动态监控EGFR基因 突变，可及早发现肺癌患者是否复发。对于有突变的胰腺癌、胃癌和直肠癌等多种癌症患 者，也可检测是否复发。目前普遍应用的EGFR基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在 以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳 性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序的原理是该方法存在以 下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序 的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确 的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。而临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的EGFR基因突变 检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和防止污染的检测EGFR基因突变 的试剂盒，解决了现有技术中进行EGFR基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和 灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增EGFR基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有EGFR基因的第18外显子 EGFR18、第19外显子EGFR19、第20外显子EGFR20、第21外显子EGFR21中至少15个连续 的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述EGFR18具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列；所述 EGFR19具有SEQ ID No 2的连续核苷酸序列；所述EGFR20具有SEQ ID No 3的连续核苷 酸序列；所述EGFR21具有SEQ ID No 4的连续核苷酸序列。优选的，所述连续核苷酸序列为SEQ ID No :5 30序列之一的正向核苷酸序列或 反向核苷酸序列。优选的，所述引物为SEQ ID No 5 30序列之一的正向引物或反向引物。优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 IOX ；
dNTPs0. 01 1. 5mM ；
引物序列终浓度为0.01 2μΜ;
模板DNA0. 01 IOng/μ L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 1. OU/ μ L ；
MgCl2 终浓度为0. 5 5mM ；
荧光染料1 3X。
优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为
PCR缓冲液终浓度1 5X ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 1 0. 5 μ M ；
模板DNA0. 05 1. 5ng/ μ L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；
MgCl2终浓度为1 3mM ；
荧光染料1 2X。
优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的
混合液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0 间。本发明的另一目的在于提供一种检测EGFR基因外显子位点突变的方法，其特征 在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有EGFR基因的第二外显子EGFR2或第三外显子EGFR3中至 少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中EGFR基因进行PCR 扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的EGFR基因进行突变位点检测。优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔 道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
6
优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上 扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔解曲线法的条件为92 97°C 变性Imin ；40°C复性Imin ；然后初始熔解温度60°C开始程序升温熔解至95°C，并在溶解过 程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的EGFR基因突 变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和 肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。EGFR基因全序列如SEQ ID No :25所示，所述的突变，发生在EGFR基因外显子18、 EGFR基因外显子19、EGFR基因外显子20和EGFR基因外显子21处，包括下表所示的热点突变。 本发明所述的试剂盒，包括PCR引物、反应体系、反应条件和阴性对照DNA样品。所 述的PCR引物，用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模板，以及与之 配对的反向序列，包括但不限于为SEQ ID No :5 30序列之一的正向引物或反向引物。所 述的PCR引物，包括但不限于为SEQ ID No :5 13序列之一的正向引物或反向引物。所述的阴性对照样品，包括EGFR基因外显子18、19、20、21阴性对照样品。本发明的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgC12、Taq酶、 DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括Tris *cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；pH 8. 0-9.0 (-20°C )。 更优选的，所述的PCR缓冲液，包括IOx缓冲液，终浓度15mM氯化镁，终pH 8. 7。所述的dNTP 混合液，包括IOmM dATPUOmM dCTP、IOmMdTTP、IOmM dGTP的混合液。所述的荧光染料，包 括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO 9染料。所述的MgCl2,包 括 15-50mM MgCl2。最优选的，所述的 MgCl2 为 25mM MgCl2。所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/ min at 72 °C，存储缓冲液 10_40mM Tris · cl，50_200mM 氯化钾(KCL)，0-5. OmM 二硫苏 糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2. 0 % (V/V)乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet) P-40,0-2. 0% (V/V)吐温 20 (Tween 20) ,30-70% (ν/ν)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer) :pH 7. 0-10. 0 (20°C )。所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris .cl、 IOOmM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.O. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v)。稳定剂终 pH 值为 9· 0。 所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的核酸，包括DNA和RNA。所 述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及 用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。所述的反应条件，包括PCR反应条件和HRM反应条件如下表所示
过程温度时间循环数cycles
预变性95 0C4_15min1
扩增95 0C10-30s
50-60 0C10-30s40-50
72 0C10-30s
高分辨率熔解95 0CImin
40 0CImin
65 0CIs1
每秒检测荧光30-50
95 0C次
冷却40 0C10-30s1
最优选的，所述的反应条件如下表所列的PCR和HRM反应条件
过程温度时间循环数cycles
预变性95 0C15min1
扩增95 0CIOs
60 0C15s50
72 0C25s
高分辨率熔解95 0CImin
40 0CImin1
65 0CIs
95 0C每秒检测荧光40次
冷却40 0CIOs1
用本发明的试剂 盖，以及制备的DNA模板，根据本发明所述的反应条件，在荧光定
量PCR仪上进行序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan 自动分析程序，得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，其特征在于，LightCycler 480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、Qiagen Rotor-Gene 6000 (德国Qiagen公司，杜塞尔多夫， 德国)、Idaho LightScanner (美国Idaho公司，爱达荷州，美国)、ABI 7500 FAST(美国应 用生物系统公司，纽约，美国)、ABI 7900 HT FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)。 在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行PCR反应，配套 的基因分型软件即可自动区分野生型与突变型。采用的阴性对照样品可以包括EGFR18、 EGFR19、EGFR20、和EGFR21阴性对照样品。 本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检测，所述的肿瘤，包括结肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉 瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌 癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。所述的肿 瘤，包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌和外阴癌。所述 的个性化用药诊断，用于EGFR信号通路相关药物的反应性诊断。所述的EGFR信号通路相 关药物，包括但不限于吉非替尼片(Iressa，Gef itinib)、它赛瓦(Tarceva，特罗凯)、达沙 替M (dasatinib)。将待测样本稀释到同一浓度，同时设阴性对照，加入试剂盒中相应的试剂，进行 PCR和HRM反应，进行野生型与突变型的区分(这段是方法的描述)在本发明的一个方面，提供了检测EGFR基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用 于EGFR基因第18、19、20、21外显子突变的检测。较佳地，所述试剂盒包含反应所需的buffer、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、 Taq 酶。在本发明的另一个方面，提供了检测EGFR基因突变，所述引物用于扩增EGFR基因 靶向序列，包括以下引物对(1)第一引物序列含有EGFR18的至少15个连续的核苷酸，第 二引物序列含有EGFR18的至少15个连续的核苷酸(2)第一引物序列含有EGFR19的至少 15个连续的核苷酸，第二引物序列含有EGFR19的至少15个连续的核苷酸(3)第一引物序 列含有EGFR20的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有EGFR20的至少15个连续的核 苷酸⑷第一引物序列含有EGFR21的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有EGFR21 的至少15个连续的核苷酸。在本发明的另一个发明，提供了一种检测EGFR基因突变的方法，包括以下步骤 在血液、体液或是组织中提取核酸样本；用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、 阴性对照及阳性对照为模板，进行实时定量PCR检测；PCR反应的条件和HRM条件如下表 分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴性 对照参比，判断样本DNA中EGFR基因的各位点是否突变。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、原料、引物、荧光染料、Taq酶、mgcl2等。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的
10引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计遵循原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不 能形成二级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60%之间。 ⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个 碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要避开密码子 的第3位。进行引物设计的软件有Primer 5，Beacon Designer 7。引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的 合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' -5' 磷酸二酯键连接。具体步骤包括1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原 料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3 ‘ 端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5' _羟基发生缩合反应。3、带帽 (capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2% )，用乙酸酐 和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的 作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是由于采用上述技术方案，本发明的检测EGFR基因突变的试剂盒、引物及方法，采 用新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用带HRM模 块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样品基因型的判断。综上所述，本发明提供了一种检测表皮生长因子受体基因(EGFR)突变的试剂盒、 方法及应用，属于肿瘤及个性化用药诊断的技术领域。本发明针对表皮生长因子受体基因 热点突变位点设计并优化PCR引物、试剂和方法，通过对组织标本运用序列扩增和高溶解 曲线检测，实现对表皮生长因子受体基因突变的判断，达到肿瘤或/和个性化用药诊断的 目的。本发明具有操作简便、灵敏度高、特异性好、重复性好、精确度高、适用范围广等特点。 本发明试剂盒灵敏度非常高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜 细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。这采用现有技 术中的检测方法是不可能实现的。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；图5为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；图7为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图8为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR-HRM得到的PCR产物电泳图；图9为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图10为本发明实施例试剂盒灵敏度的检测图；图11为本发明实施例试剂盒检测肺癌患者石蜡组织模板DNA分型图；图12为本发明应用例肺癌患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；图13为本发明应用例正常人血液标本模板、肺癌患者血液标本模板DNA进行扩增 后检测的溶解曲线图；图14为本发明应用例正常人血液标本模板、结肠癌患者血液标本模板DNA进行扩 增后检测的溶解曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1引物的验证及筛选本实施例采用Primer 5设计引物，首先优化设计引物片段的大小，得到不同片段 大小引物PCR扩增的电泳图，结果如图1和下表所示。图Ia为5-9bp的引物PCR扩增的电 泳图，图Ib为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图Ic为18_23bp的引物PCR扩增的电泳 图，图1 d为24-28bp的引物PCR扩增的电泳图，图1 e为30_37bp的引物PCR扩增的电泳图， 图If为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。由下表或图可知，最佳引物为18_28bp大小的 引物。
设计好的引物由上海英潍捷基公司合成，然后对引物进行验证。用聚丙烯酰胺凝 胶(PAGE)电泳对合成的引物进行鉴定，包括以下步骤使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿 素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95°C，2minS)。加入
尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥 胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件 许可，也可以用EB染色或银染方式染色。结果如图2所示。实施例2阴性对照DNA的提取阴性对照DNA的提取按照如下步骤进行取正常人的混勻的抗凝全血2ml，然后使 用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO. ,LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试 剂盒操作说明，提取DNA。使用Nano 1000定量仪定量，测定DNA浓度。阴性对照DNA符合以下条件时可以视为合格1、符合OD值A260/A230 2. 0-2. 2 ； A260/A280 1.8-2.0之间；2、电泳条带主条带清晰(上样6ul，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电 压，25分钟)；结果如图3所示的电泳图。3、测序鉴定EGFR基因外显子18、19、20、21无任 何异常突变存在，结果如图4所示。实施例3肿瘤组织DNA的提取样本采集按照如下步骤进行取新鲜组织块50 IOOmg以PBS或生理盐水清洗干 净，所用组织必须切至厚度在0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分 混勻(30分钟内完成)。室温下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取按照如下步骤进行使用 TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGENBIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。然后进行DNA纯化、检 测。若提取的DNA, OD值不在A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，标准范围内，则需 要进行DNA纯化步骤。DNA纯化按照如下进行加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管 5min以充分混勻，13000rpm离心IOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体 积的醋酸钠(PH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇勻，沉淀DNA13000rpm 离心3min，轻轻倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,离心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否 则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分溶解。对提取的DNA进行检测时，需测定所提取的DNA在A260/280/230上的吸光度，符 合OD值A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0之间。其步骤可以是将提取的DNA稀 释到IOng/ μ 1 ；电泳鉴定主条带清晰(上样6 μ 1，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电压，25分钟)； 若符合以上条件，将DNA-20°C保存，留待作为PCR反应的模板DNA。实施例4血液中血浆DNA的提取抽取病人外周血l_2ml于枸橼酸纳(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管， 吸取部分血液至离心管SOOOrpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管 子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血浆用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。 实施例5血液中血清DNA的提取 抽取病人外周血l_2ml至无抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血清用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例6 =PCR-HRM条件优化实验1)热启动Taq酶选择用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，图5中1、2、 3、4 分别为 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速热启动 DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活 性最高。 2)荧光染料的选择用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6 中 1、2、3、4、5 分别为 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 荧光染料的实验结 果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。 染料Eva Green和LC Green的效果最好。3) PCR条件优化PCR条件优化在退火温度、MgCl2浓度两方面进行调整和优化，其中分别对 EGFR-EX0N18、EGFR-EX0N19、EGFR-EX0N20 和 EGFR-EX0N21 的 PCR 条件进行摸索和优化，确定
PCR最佳条件为退火温度为60°C，MgCl2终浓度为3Mm。PCR条件优化试验的结果如下表
PCR条件MgCl2终浓度l.OmM1. 5 mM2. 0 mM2. 5 mM3. 0 mM3. 5 Mm退火温度55 "C无扩增有非特 异性条 带有非特 异性条 带有非特 异性条 带有非特 异性条 带有非特 异性条 带58 "C无扩增二聚体 产生二聚体 产生二聚体 产生二聚体 产生二聚体 产生60 °C无扩增扩增效 率低扩增正 常扩增正 常二聚体 产生二聚体 产生如图7和图8所示为进行PCR条件优化筛选时的溶解曲线图和PCR产物电泳图。 其中箭头 1、2、3、4 分别对应 EGFR-EXCM18、EGFR-EX0N19, EGFR-EX0N20 和 EGFR-EX0N21 的 PCR产物电泳结果。4) HRM条件优化HRM条件的优化主要在溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面进行优化
15调整。起始温度选择60°C、65°C、7(TC三个条件，检测荧光次数(次)选择10、40、100次/
秒三种。其结果如下表所示 最后确定的最佳条件如下表所示 5) DNA来源样本分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，经实验证实外周 血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。实验结果如图9和下表所示， 图9A为外周血DNA的检测结果；图9B为口腔DNA的检测结果；图9C为组织DNA的检测结 果；图9D为石蜡切片DNA的检测结果。由图可知，血清、血浆、口腔拭子、组织和石蜡切片等 提取的DNA均可用于本试剂盒检测。 6)灵敏度检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入 阴性对照样本、突变样本、5%突变样本、10%突变样本、15%突变样本。经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1%。如图10所示，对照文献 MutationResearch 635(2007) 105-117的检测方法灵敏度，如下表所示，本试剂盒达到目前
多种突变检测方法中最高灵敏度1%。
7)试剂盒检测精度分析
用上述所获得的材料和优化的条件用于肺癌石蜡组织切片检测，确定的精确度。选取肺癌组织石蜡切片40例，提取DNA作为模板，用EGFR-eXonl9的引物检测，并 与直接测序比较。本试剂盒的检测结果如下表表9本试剂盒和测序检测对照表 结论EGFR-eXOnl9引物检测40例石蜡组织切片样本实验中，本试剂盒检测出 10例样本检测有突变分型，实际测序有9例突变，HRM(检测图如图11所示)检测成功率 100%，阳性检测出率达测序比较一致性100%，两种方法检测一致率为95%。从检测结果 分析，HRM技术本试剂盒检测突变的准确灵敏度超过测序。试剂盒检测分型图如图11所
7J\ ο应用例130例肺癌患者的基因扫描取肺癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。使用仪器=LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、刮削5-10 μ m厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作 说明提取DNA引物序列
PCR扩增反应体系 PCR和HRM反应条件 检测结果如图12所示，图12A D分别对应于EGFR18、EGFR19、EGFR20、EGFR21 基因的检测；从图可知，在肺癌患者石蜡切片中检测出4例EGFR19突变的患者，2例EGFR20 突变的患者，1例EGFR21突变的患者，共计检出7例突变患者，突变检出率达23%，符合国 内外文献报道的数据。应用例2肺癌患者外周血血浆的突变检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件对结肠癌患者外周血的基因扫描，其过 程如下取肺癌患者和正常人的外周血2ml各20例，提取DNA作为模板。使用仪器LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析
DNA模板提取1，将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。2，用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。使用仪器=LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析引物序列 PCR扩增反应体系 PCR和HRM反应条件 用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图13A D (分别 对应于EGFR18、EGFR19、EGFR20、EGFR21)的20例正常人血液血浆中EGFR基因突变检测图和如图13E H13A D (分别对应于EGFR18、EGFR19、EGFR20、EGFR21) 20例肺癌患者血液 血浆中EGFR基因突变检测结果图；从图中可知，在正常人血液血浆中没有检测到EGFR基因 突变，在肺癌患者中检测出1例EGFR18突变的患者，5例EGFR19，突变的患者1例EGFR20 突变的患者，1例EGFR21突变的患者，共计检出8例突变患者，突变检出率达40%，符合国 内外文献报道的数据。应用例3肺癌患者外周血血清的突变检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件对肺癌患者外周血的基因扫描，其过程 如下取肺癌患者外周血2ml 20例，提取DNA作为模板。使用仪器LlightCyclerTM 480 荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1，将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2，用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。使用仪器=LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析引物序列 PCR扩增反应体系 PCR和HRM反应条件 结果用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，在肺癌患者中检测出1 例EGFR18突变的患者，5例EGFR19，突变的患者1例EGFR20突变的患者，1例EGFR21突变 的患者，共计检出8例突变患者，突变检出率达40%，符合国内外文献报道的数据，检测结 果与血液血浆中的检测结果相同。应用例4结肠癌患者外周血血浆的突变检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件对结肠癌患者外周血的基因扫描，其过 程如下结肠癌患者和正常人的外周血2ml各20例，提取DNA作为模板。使用仪器LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1，将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。2，用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。使用仪器=LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析引物序列 PCR扩增反应体系
PCR和HRM反应条件 用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图14. A的20例 正常人血液血浆中EGFR基因突变检测图和图14. B 20例肺癌患者血液血浆中EGFR基因突 变检测结果图；从图中可知，在正常人血液血浆中没有检测到EGFR基因突变，在结肠患者 中检测出3例EGFR19，突变的患者1例EGFR20突变的患者，2例EGFR21突变的患者，共计 检出6例突变患者，突变检出率达30%，符合国内外文献报道的数据。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增EGFR基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有EGFR基因的第18外显子EGFR18、第19外显子EGFR19、第20外显子EGFR20、第21外显子EGFR21中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述EGFR18具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述EGFR19具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列；所述EGFR20具有SEQ ID No3的连续核苷酸序列；所述EGFR21具有SEQ ID No4的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续 核苷酸序列为SEQ ID No 5 30序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物 为SEQ ID No 5 30序列之一的正向引物或反向引物。
4.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂 盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系， 所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 01 1. 5mM ；弓丨物序列终浓度为0. 01 2 μ M ；模板 DNA0. 01 lOng/μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 1. OU/ μ L ； MgCl2终浓度为 0. 5 5mM ； 荧光染料1 3X。
5.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR 反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列终浓度为0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为1 3mM ；荧光染料1 2X。
6.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光 染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCGreen PLUS染料、ResoLight染料、 SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-200CT pH值在8. 0-9. 0间。
7.—种检测EGFR基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有EGFR基因的第二外显子EGFR2或第三外显子EGFR3中至少 15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中EGFR基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的EGFR基因进行突变位点检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA是从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切 片中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s， 56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR 仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔 解曲线法的条件为92 97°C变性Imin ；40°C复性Imin ；然后初始熔解温度60°C开始程序 升温熔解至95°C，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
10.一种PCR反应试剂盒在肿瘤用药选择和诊断相关的EGFR基因突变检测方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增EGFR基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有EGFR基因的第18外显子EGFR18、第19外显子EGFR19、第20外显子EGFR20、第21外显子EGFR21中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述EGFR18具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述EGFR19具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列；所述EGFR20具有SEQ ID No3的连续核苷酸序列；所述EGFR21具有SEQ ID No4的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术完成对样品基因型的判断，从而为肿瘤包括肺癌、结直肠癌的选择用药和诊断提供指导。
文档编号C12Q1/68GK101921830SQ20101013420
公开日2010年12月22日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者李晓燕, 王弢, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司