Kras基因突变的快速检测的制作方法

专利名称：Kras基因突变的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的 KRAS基因突变的快速检测。
背景技术：
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在 11、12和1号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS 对人类癌症影响最大，它是一种分子开关当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异 常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因 突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失 控而癌变。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化 疗疗效的重要指标。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，占 所有突变的90%以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种在胰腺癌、大肠癌、肺癌 中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90%以上。检测KRAS基因突变，对判断这些肿瘤的发生和发展、预后以及了解肿瘤的治疗效 果具有一定意义。(1)正常人血检中出现KRAS基因异常，提示属于肿瘤高危人群；(2)良性 肿瘤患者若是检出KRAS基因突变，提示有恶变的可能；(3)大量研究表明，KRAS基因突变阳 性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；(4)无KRAS基因突变 的肺癌、结直肠癌等肿瘤患者，经抗EGFR靶向药物治疗疗效明显，因此，通过检测KRAS基因 突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度 保持一致。一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。KRAS基因在很多癌中都发 生了突变，约30-50%的直肠癌，90%以上的胰腺癌，10-20%的肺癌等都含有KRAS突变， 而几乎所有的突变都发生在编码子12和13 (位于第2外显子)位置上，这些突变破坏了 KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态。(Amado，R. G.，et al.2008J Clin Oncol. 26 1626-34 ；Almoguera, C. et al. 1988 Cell53 549-554 ；Yanez, L, et al. 1987 Oncogene 1 :315_318 ；Takeda, S. et al. 1993Hum. Mutat. 2 :112_117 ； Takahashi, et al. Gastrointestinal Endo 2005.61 :76_9 ;Luigi L, etal. Oncogene 2002.21 :4301-6)。因此对KRAS基因突变的检测可用于胰腺癌、结肠癌、胃癌等癌症的早期 辅助诊断和筛查。临床上靶向新药爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗)和帕尼单抗(Panitumumab)仅 适用于无突变的KRAS基因野生型患者，对KRAS突变患者无效。《美国国立癌症综合网络 (NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2008年第3版)明确指出一是所有转移性结直肠癌患者 都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗 (Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的治疗；《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出当KRAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/ Erlotinib)进行分子靶向治疗。KRAS基因检测是目前医生筛选出抗EGFR(表皮生长因子受 体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后， 延长患者生存期。我国目前对于KRAS基因检测最新的调研数据结果显示，国内近40家检 测中心已完成检测近1000例，其中65. 9%为野生型。此时如果做了 KRAS基因检测，通过个 体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，如爱必妥，有效率可以达到60%左右。因 此，大肠癌患者不但要进行KRAS基因检测，而且越早越好，这样六成左右的KRAS野生型患 者就有希望抓住最佳的治疗时期，获得良好的治疗效果。本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测KRAS突变，协助临床医生筛选抗 EGFR靶向药物的有效患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。恶性肿瘤病人血浆或血清中存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细 胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这 是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究 的一个热点。目前，血浆突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。有研究表明，同时 检测P53基因与KRAS基因，在胰腺癌患者血浆的敏感性为70%，特异性为86%，阳性预测 值为90%，阴性预测值为63%。检测KRAS还可以通过该基因的突变状态了解病人的复发 转移风险。大多数刚切除大肠癌原发病灶的患者5年内会出现复发转移，病情分期越晚者 复发转移的风险越高。通过血清或血浆中动态监控KRAS基因突变，可及早发现大肠癌患者 是否复发。对于有突变的胰腺癌、胃癌和肺癌等多种癌症患者，也可检测是否复发。目前普遍应用的KRAS基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在 以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳 性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序的原理是DNA序列包括 Sanger双脱氧链终止法、焦磷酸测序法等。该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵， 非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、 GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能 避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便、设备要求低的KRAS基因突变检测 技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。

发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和有效避免污染的检测KRAS基因 突变的试剂盒，解决了现有技术中进行KRAS基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、灵敏 度低和易污染等问题，尤其提供了除病理组织之外的对非创伤性血清或血浆中突变的高灵 敏度检测。本发明提供的技术方案是一种检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异 性扩增KRAS基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有KRAS基因的第二外显子KRAS2 或第三外显子KRAS3中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述KRAS2具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列；所述KRAS3具有SEQ ID No 2的连续核苷酸序列。优选的，所述连续核苷酸序列选自SEQ ID No 3 22序列之一的核苷酸序列。优选的，所述引物对的引物为SEQ ID No :3 22序列之一的正向引物或反向引 物。优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 10X ；
dNTPs0. 01 1. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 01 2iiM ；
模板DNA0. 01 10ng/y L ；
TaqDNA聚合酶0. 01 1. 0U/ii L ；
MgCl2终浓度为0. 5 5mM ；
荧光染料1 3X。
优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为
PCR缓冲液终浓度1 5X ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 1 0. 5 ii M ；
模板DNA0. 05 1. 5ng/ u L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. 10U/ u L ；
MgCl2终浓度为1 3mM ；
荧光染料1 2X。
优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混
合液；所述PCR缓冲液包括Tris *cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。本发明的另一目的在于提供一种检测KRAS基因外显子位点突变的方法，其特征 在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取含有KRAS基因的第二外显子KRAS2或第三外显子KRAS3中至少 15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；(2)从非细胞体系或细胞体系中提取的核酸作为模板DNA，利用步骤⑴得到的引 物对对模板DNA中KRAS基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的KRAS基因进行突变位点检测。优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、 腔道的脱落物、病变组织中提取，方法中进行PCR扩增反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性 10 30s，56 60°C退火 10 30s，70 75°C延伸 10 30s，40 50个循环。优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上 扩增后，运行熔解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔解曲线法的条件为92 97°C 变性lmin ；40°C复性lmin ；然后初始熔解温度60°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过 程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的KRAS基因突 变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和 肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。本发明KRAS基因的序列如SEQ ID No 23所示，其包括下表所示的突变点 肿瘤细胞的生长、增殖、血管生成等过程都需要细胞内蛋白进行信号传导，而KRAS 基因是传导蛋白的决定因素，在这条传导通路中起着重要的“开关”作用，从而影响肿瘤的 生长和扩散。KRAS基因可以是正常状态(称为野生型)或异常状态(突变型)。通过本发 明的KRAS基因突变检测方法科技进行野生型或突变型的分型。KRAS突变型编码异常的蛋 白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散；并且不受上游EGFR的信号影响，对抗EGFR治疗 效果差。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持 一致。目前，大肠癌患者KRAS突变率为30%-35%。检测KRAS突变在大肠癌诊断中起着 重要作用。本发明的试剂盒中先进行PCR扩增，然后对扩增产物进行HRM检测突变点；本发明 的PCR引物，为化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端5-23个序列的模板，以及与之配 对的反向序列，可以是下表序列 更为优选的，可以是下表序列
本发明的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgC12、Taq酶、 DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括Tris *cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；pH 8. 0-9.0 (-20°C )。 更优选的，所述的PCR缓冲液，包括10x缓冲液，终浓度为15碰氯化镁，终？11为8.7。所述 的dNTP混合液，包括10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP的混合液。所述的荧光 染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYT0 9染料。所述的 MgCl2，包括 15-50mM MgCl2。最优选的，所述的 MgCl2 为 25mM MgCl2。Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/minat 72°C，存储缓冲液 10-40mM Tris cl，50_200mM 氯化钾(KCL), 0-5. OmM 二硫苏糖醇(DTT)， 0-1. OmM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA),0-2. 0% (V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40， 0-2. 0% (V/V)吐温 20(Tween 20) ,30-70% (v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer) pH 7. 0-10. 0 (20°C )。所述的存储缓冲液,包括终浓度为20mM Tris cl、100mM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.0. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 稳定剂终pH值为9.0。DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的核酸，包括DNA和RNA。所述的患 者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些 组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。利用试剂盒进行检测时，包括PCR扩增和HRM程序，其反应条件(PCR反应条件和 HRM的条件)如下表所示 更为优选的条件可以如下表所示
用本发明的试剂盒，以及制备的DNA模板，根据本发明所述的反应条件，在荧光定 量PCR仪上进行序列扩增，然后分析数据，运行熔解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自 动分析程序，得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，包括LightCycler480(罗氏公司， 巴塞尔，瑞士)、Qiagen Rotor-Gene 6000 (德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner (美国Idaho公司，爱达荷州，美国)、ABI 7500FAST (美国应用生物系统公司， 纽约，美国)、ABI 7900HT FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)。在使用时，将待测样 本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行PCR反应，配套的基因分型软件即可 自动区分野生型与突变型。采用的阴性对照样品可以包括KRAS2和KRAS3阴性对照样品。本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检 测，所述的肿瘤，包括结肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉 瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌 癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。较为优选 的，所述的肿瘤包括结肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌。检测KRAS基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用于KRAS第二外显子中第12个 密码子和第13个密码子及第三外显子的第61密码子突变的检测。本发明检测KRAS基因 突变时，所述引物用于扩增KRAS基因靶向序列，包括以下引物对⑴第一引物序列含有 KRAS2的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有KRAS2的至少15个连续的核苷酸；(2) 第一引物序列含有KRAS3的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有KRAS3的至少15 个连续的核苷酸。优选的，本发明的检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本(2)用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时 定量PCR检测(3)分析数据，运行熔解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴 性对照参比，判断样本DNA中KRAS基因的各位点是否突变。以下对本发明的一些专用术语进行解释说明在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计一般遵循以下原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能 有连续4个碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要 避开密码子的第3位。进行引物设计的软件有Primer Premier 5，BeaconDesigner 7。本发明引物进行筛选，确定引物片段大小，最后确定最佳引物为18_28bp大小的 引物。本发明的引物采用亚磷酰胺三酯法进行合成；其原理是将DNA固定在固相载体上完 成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通 过3' -5'磷酸二酯键连接。具体包括以下步骤1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱 去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚 磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟 基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5 ‘-羟基没有参加反应(少于 2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是由于采用上述技术方案，本发明的检测KRAS基因突变的试剂盒、引物及方法，采 用新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用带HRM模 块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样品基因型的判断。另外，本发明的试剂盒灵敏度特别高，可以检测各种组织来源的基因组DNA，不仅 来源于细胞体系，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。本发明人通过 非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段作为模板DNA，进行检测得到意想不到的效果。


下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；图5为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的熔解曲线图；图7为本发明实施例进行PCR条件优化筛选时的熔解曲线图；图8为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR-HRM的PCR产物电泳图；图9为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的熔解曲线图；图10为本发明实施例试剂盒灵敏度的检测11为本发明实施例试剂盒分型12为本发明应用例结肠患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的熔解曲线 图；图13为本发明应用例正常人外周血血浆标本、结肠患者外周血血浆标本模板DNA 进行扩增后检测的熔解曲线图；图14为本发明应用例正常人外周血血浆标本、胰腺癌者外周血血清标本模板DNA 进行扩增后检测的熔解曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1引物的验证及筛选按照KRAS基因第二外显子和第三外显子的序列，进行引物设计。对引物的不同序 列长度进行扩增比较，筛选特异性好的引物。引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性 结果如下表和图1所示表1引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性结果
引物大 小(bp)5-913-1618-2324-2830-3739-45特异性特异性很 差特异性差特异性好特异性较 好特异性差特异性 很差图la为5_9bp的引物PCR扩增的电泳图，图lb为13_16bp的引物PCR扩增的电 泳图，图lc为18-23bp的引物PCR扩增的电泳图，图Id为24-28bp的引物PCR扩增的电泳 图，图le为30-37bp的引物PCR扩增的电泳图，图If为39_45bp的引物PCR扩增的电泳图。 由下表或图1可知，最佳引物为18-28bp大小的引物。引物由上海英潍捷基(Invtrogen)公司按照亚磷酰胺三酯法负责合成。采用聚丙 烯酰胺凝胶电泳法进行引物验证，得到电泳图如图2所示。图2a为获得的Kras-eX0n2-F 电泳图；图2b为获得的Kras-exon2-R电泳图；图2c为获得的Kras-exon3_F电泳图；图2d为获得的Kras-exon3-R电泳图。实施例2阴性对照DNA的提取阴性对照DNA的提取按照如下步骤进行取正常人的混勻的抗凝全血2ml，然后使 用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组 DNA 提取试剂盒，按照试 剂盒操作说明，提取DNA。使用Nano 1000定量仪定量，测定DNA浓度。阴性对照DNA符合以下条件时可以视为合格1、符合0D值A260/A230 2. 0-2. 2 ； A260/A280 1.8-2.0之间；2、电泳条带主条带清晰(上样6ul，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电 压，25分钟)，电泳图如图3所示；3、测序鉴定KRAS基因外显子2、3无任何异常突变存在。 测序结果如图4所示。实施例3肿瘤组织DNA的提取样本采集按照如下步骤进行取新鲜组织块50 lOOmg以PBS或生理盐水清洗干 净，所用组织必须切至厚度在0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分 混勻(30分钟内完成)。室温下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取按照如下步骤进行使用 TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGENBIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。然后进行DNA纯化、检 测。若提取的DNA, 0D值不在A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，标准范围内，则需 要进行DNA纯化步骤。DNA纯化按照如下进行加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管 5min以充分混勻，13000rpm离心lOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体 积的醋酸钠(PH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇勻，沉淀DNA13000rpm 离心3min，轻轻倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,离心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否 则DNA将难以被熔解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分熔解。对提取的DNA进行检测时，需测定所提取的DNA在A260/280/230上的吸光度，符 合0D值A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0之间。其步骤可以是将提取的DNA稀 释到10ng/ u 1 ；电泳鉴定主条带清晰(上样6 iU，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电压，25分钟) 若符合以上条件，将DNA-20°C保存，留待作为PCR反应的模板DNA。实施例4血液中血浆DNA的提取抽取病人外周血l-2ml于枸橼酸纳(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管， 吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管 子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血浆用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l-2ml至无抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另 一无菌管子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期 即可。
然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血清用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例6 :PCR-HRM条件优化实验1)热启动Taq酶选择用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如表2和图5，最终确定 HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活性最高。表2不同厂家的热启动Taq酶活性 2)荧光染料的选择用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如表3和图6所 示，可知最佳染料为Eva Green和LC Green。图6中1为Eva Green染料；2为LC Green ； 3 为 SYBRGreen ；4 为 DAPI ；5 为 Flamingo。表3不同厂家的染料的荧光结合效果 染料Eva Green和LC Green的效果最好。3) PCR条件优化PCR条件优化在退火温度、MgCl2浓度两方面进行调整和优化，其中分别对 KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3的PCR条件进行摸索和优化，确定PCR最佳条件为退火温度为60°C，MgCl2终浓度为3Mm。PCR条件优化试验的结果如表4
表4不同MgCl2终浓度和退火温度的PCR扩增结果 图7为进行PCR条件优化筛选时的熔解曲线图(图7A为KRAS-EX0N2的溶解曲线； 图7B为KRAS-EX0N3的溶解曲线；)，图8为进行PCR条件优化筛选时的PCR产物电泳图。 其中箭头1、2分别对应KRAS-EX0N2、3PCR产物电泳结果。4)HRM条件优化HRM条件的优化主要在熔解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面进行优化 调整。起始温度选择60°C、65°C、70°C三个条件，检测荧光次数(次)选择10、40、100次/ 秒三种。其结果如表5所示表5不同检测荧光次数和起始熔解温度的熔解曲线效果 最后确定的最佳条件如表6所示表6最佳HRM条件 5)DNA来源样本分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，经实验证实外周 血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。实验结果如图9和表7所 示表7不同来源的模板DNA检测结果 图9A D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，结果表明血清、血 浆、口腔拭子、组织和石蜡切片等提取的DNA均可用于本试剂盒检测。6)灵敏度检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入 阴性对照样本、突变样本、5%突变样本、10%突变样本、15%突变样本。如图9和表8所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1 %。其他检测方 法对照文献Mutation Research 635(2007) 105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示， 本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1%。表8不同检测方法的灵敏度(单位％ ) 7)检测精度分析用实施例1 6获得的材料和优化的条件，确定检测的精确度。实验中，用kras 外显子2的引物检测结肠癌患者石蜡切片组织，并与直接测序法相比较。本试剂盒的检测 结果如表9 表9使用本发明试剂盒对不同样本的检测结果 本试剂盒检测和测序检测对照结果表明KRAS-eXOn2引物检测20例石蜡组织切片样本实验中，本试剂盒检测出 7例样本检测有突变分型，实际测序有6例突变，HRM和测序检测成功率100%，阳性检测出 率达测序比较一致性100%，两种方法检测一致率为94%。从检测结果分析，HRM技术本试 剂盒检测突变的准确灵敏度超过测序。试剂盒检测分型图如图11所示。应用例1结肠癌患者石蜡标本的基因扫描对30例结肠癌患者石蜡切片中KRAS基因进行突变检测，取结肠癌患者的石蜡切 片30例，提取DNA作为模板。使用仪器LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、刮削5-10 iim厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作 说明提取DNA。引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 在结肠癌患者石蜡切片提取的DNA检测中，有11例是检测出有KRAS-EX0N2突变， 1例有KRAS-EX0N3突变的，其余18列样本未检测出突变，突变比率40 %，符合国内外研究 报道的结肠癌患者中KRAS基因突变的几率。应用例2结肠癌患者外周血血浆的突变检测用实施例1 6获得的材料和优化的条件对结肠癌患者外周血的基因扫描，其 过程如下取结肠癌患者和正常人的外周血2ml各20例，提取DNA作为模板。使用仪器 LightCycler 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。引物序列 PCR反应体系
PCR和HRM反应条件 结果图12. A为20例正常人血液中KRAS基因突变检测结果；图12. B为20例结 肠癌患者的血液中KRAS基因突变检测结果；在正常人群中，未筛查出有突变的基因存在； 在结肠癌患者中，有六列是检测出有KRAS-EX0N2突变，有一列是同时检测出KRAS-EX0N2和 KRAS-EX0N3突变的，其余13列样本未检测出突变，突变的检出率在35%，符合国内外研究 报道的结肠癌患者中KRAS基因突变的几率。应用例3结肠癌患者外周血血清的基因扫描用实施例1 6获得的材料和优化的条件对结肠癌患者外周血的基因扫描，其 过程如下取结肠癌患者和正常人的外周血2ml各20例，提取DNA作为模板。使用仪器 LightCycler 480荧光定量PCR仪器分析。DNA模板提取1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。
2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 结果如图13A、13B为正常人血液中KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3突变检测图，未有突变者检出；图13C、13D为结肠癌患者KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3突变检测图，在结肠癌患 者中，有六列是检测出有KRAS-EX0N2突变，有一列是同时检测出KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3 突变的，其余13列样本未检测出突变，突变的检出率在35%，符合国内外研究报道的结肠 癌患者中KRAS基因突变的几率，检测结果与血液血浆中的检测结果相同。应用例4胰腺癌患者外周血血清/血浆的基因扫描用实施例1 6获得的材料和优化的条件对胰腺癌患者外周血的基因扫描，其过 程如下取胰腺癌患者外周血2ml各30例，提取DNA作为模板。使用仪器LightCyClerTM480 荧光定量PCR仪器分析。DNA模板提取1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取DNA。引物序列 PCR反应体系
PCR和HRM反应条件 结果如图14A、14B为正常人血液中KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3突变检测图，未有 突变者检出；图14C、14D为胰腺癌患者KRAS-EX0N2和KRAS-EX0N3突变检测图，有18列是 检测出有KRAS-EX0N2突变，有2列是检测KRAS-EX0N3突变的，其余10列样本未检测出突 变，突变的检出率在66. 7%，符合国内外研究报道的胰腺癌患者中KRAS基因突变的几率。同时也检测了患者的血浆，结果与血清的检测结果相同，如表10 表10胰腺癌患者血清、血浆检测结果 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增KRAS基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有KRAS基因的第二外显子KRAS2或第三外显子KRAS3中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述KRAS2具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述KRAS3具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续 核苷酸序列为SEQ ID No 3 22序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物 为SEQ ID No 3 22序列之一的正向引物或反向引物。
4.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂 盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系， 所述PCR反应体系终浓度组成为
5.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR 反应体系终浓度组成为
6.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光 染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCGreen PLUS染料、ResoLight染料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR缓冲液包括Tris cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。
7.—种检测KRAS基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取含有KRAS基因的第二外显子KRAS2或第三外显子KRAS3中至少15个 连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中KRAS基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的KRAS基因进行突变位点检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细 胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片 中提取，方法中进行PCR扩增反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性 10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR 仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行熔解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔 解曲线法的条件为92 97°C变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度60°C开始 程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
10.一种PCR反应试剂盒在肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变检测方面的应用。全文摘要
本发明公开了一种检测KRAS基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增KRAS基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有KRAS基因的第二外显子KRAS2或第三外显子KRAS3中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述KRAS2具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述KRAS3具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率熔解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为肿瘤包括肺癌、结直肠癌的选择用药和诊断提供指导。
文档编号C12Q1/68GK101875972SQ20101013424
公开日2010年11月3日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者李晓燕, 王弢, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司