专利名称：一种大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及动物病毒，更具体涉及生产动物用狂犬 病毒抗原的方法。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)感染引起的一种病症严重、病死率极 高的自然疫源性人兽共患传染病，死亡率几乎100%，目前尚无有效的治疗措施。野生动物 是RV的主要储存宿主，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率 为100%。根据卫生部最新公布的传染病疫情统计数据，显示近年来狂犬病继续呈现凶险的 迹象。但是狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病疫苗是唯一有效手段。目前市场上的狂犬病毒疫苗基本都是采用转瓶工艺传代细胞培养的，大规模生产 需要大量的物力人力资源，成本较高，并且批间差异大，质量不稳定。高效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出病毒。病毒株生长的培 养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大意义。因此，为了最大化所想要的 病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的 环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有工艺存在的不足之处，提供一种潮汐式细胞 微载体悬浮培养系统大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法。该方法生产工艺简单且稳 定、易操作，病毒抗原产量高，批间差异小，质量易控制，可显著提高疫苗产量和质量，降低 成本。为达到上述目的，本发明利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产动物 用狂犬病毒抗原，包括下列技术步骤(1)培养制备抗原用细胞将制备抗原用宿主细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐中，并将上述细胞与 微载体混合均勻，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养 环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种 浓度的5 40倍。(2)毒液的接种与繁殖将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当 培养环境下培养病毒；连续培养3 5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例 为50% ；继续培养9 11日，每24h收获换液一次，换液比例为50%。(3)经检验合格后，将半连续工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合， 于-20°C冻融两次，灭活纯化得到狂犬病毒抗原。病毒液检验按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。通过小鼠脑内 接种法测定，病毒液每1. 0ml病毒含量> 107 0LD50 ；上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖狂犬病毒的细胞系，如仓鼠肾细胞细 胞系(BHK21)等。本发明方法中所述的培养液最好是95 % 98 % DMEM，加2 % 5 %牛血清，加适量 抗菌素，PH值为7. 0 7. 4较好。上述技术方案中，所述接种的狂犬病毒可以是LEP-Flury毒株。上述技术方案中，所述的适宜本发明的微载体可以为具有网状结构的纤维，如聚
酯纤维等。本发明方法中细胞获得气体交换的方式可以通过培养液液面升降的方式实现。上述技术方案中，步骤(1)中，一般启动贴附程序后4h换成细胞培养程序。所述细 胞贴附程序最佳参数为up :2400mL/min hold lmin、Down :2400mL/min hold lmin、设定最 大换液量18500mL ；细胞培养程序最佳参数为up :1800mL/min hold lmin、Down 1800mL/ min hold lmin、设定最大换液量18500mL。上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5. 5g微载体 较好，细胞的初始接种量为1. 8 3. 6X 107cellS/g微载体较好。上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度一般为1. 1X108 1.0X109cells/g 微载体。上述技术方案中，步骤⑵中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.0. I.)为 0.01 1的比例。上述技术方案中，步骤(2)中，一般启动吸附程序后4h换成病毒培养程序，所述病 毒吸附程序最佳参数为up :1500mL/min hold lmin、Down :1500mL/min hold lmin、设定最 大换液量18500mL ；病毒培养程序最佳参数为up :1000mL/min hold lmin、Down 1000mL/ min hold lmin、设定最大换液量18500mL。上述技术方案中，细胞与病毒培养的环境温度一般为36°C 37°C，培养环境中含 有C02浓度为2. 5% 5%较好。本发明方法中，潮汐式微载体悬浮培养技术采用的生物反应器主要由载体罐、储 液罐、PH控制器、D0监测器、输入和输出系统组成。工作过程如下细胞贴附在载体罐中的 载体上生长，当储液罐的培养液被泵入载体罐时，培养液液面上升向细胞供给养分并促进 细胞新陈代谢产物的去除；当载体罐的培养液泵入储液罐时，培养液面随之下降，使细胞进 行通风，促进呼吸，减小细胞切向压力，无02供应限制，无泡沫烦恼。这个重复的运动使载 体上的细胞能够得到足够的营养和02，同时产生的代谢废物如C02能够有效的被排出去，从 而能够大量的扩增细胞并增值病毒，此种技术称之为潮汐式微载体悬浮培养技术。本发明所提供的以潮汐式细胞微载体悬浮培养系统生产动物用狂犬病毒抗原的 方法，与传统转瓶传代细胞培养技术相比，更具有以下优点1.采用本发明方法，解决了传统转瓶大规模生产时单批产量不高、批间差异大、产 品质量不稳定、劳动强度大、生产成本高等问题。2.本发明方法中采用的载体为网状的聚酯纤维，具有亲水性和生物无害性，lg载 体约占15ml的空间，可提供2400cm2的贴壁面积，在同样的空间内极大的增大了细胞的贴
4壁面积，增加了细胞生长的密度，细胞数可达到1.0X109以上，其效能为传统转瓶培养系统 的数十倍，可以节省许多成本及人力。3.本发明方法制备的细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度 的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本发明提供一种新的工艺技术，能够极大的满足病毒大量繁殖所需要的条件，并 且能够制备高滴度的抗原，极大的满足疫苗制备所需，显著提高了疫苗的产量和质量，降低 生产成本。
具体实施例方式实施例中所使用的生物反应器为美国CESC0公司生产的TideCell-020型，所使 用的载体为该公司的BioNoc II聚酯纤维，宽5mm，长10mm，lg载体约占15ml的空间，提供 2400cm2的贴壁面积，可提供1. OX 109以上数量的细胞生长。实施例11.病毒与细胞株用于制备狂犬病毒抗原的病毒株为LEP-Flury毒株，经过致病性测试，该毒株病 毒不具有致病性。以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)，作为制苗用 细胞系，藉以感染并大量繁殖狂犬病毒。2.制备方法(1)将制备抗原用细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)接种到加有DMEM液体培养基(包 括 5%牛血清、0. 01mol/LNaHC03>0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)、100，000IU 青霉素G钠盐(Penicillin G Sodium)、pH值为7. 2)与BioNoc II聚酯纤维的载体罐内； 微载体用量为每500ml培养液添加5. 5g微载体，细胞初始接种量为2. 7 X 107cells/g微载 体。(2)于37°C、5% C02培养环境下，细胞贴附4h，使上述制备抗原用细胞与微载体 混合均勻，并使细胞贴附在微载体上。贴附程序参数为up :2400mL/minhold lmin、Down 2400mL/min hold 30s、设定最大换液量18500mL ;4h后切换为细胞培养程序，细胞培养 程序参数为up :1800mL/min hold lmin、Down :1800mL/min hold lmin、设定最大换液量 18500mL。(3)于37°C、5% C02培养环境下，使细胞在上述微载体上生长，待细胞达到 4.0X1010cell时，换用添加2%牛血清的DMEM细胞维持培养液，按病毒感染复数(M. 0. I.) 为0. 01的比例接种狂犬病毒LEP-Flury毒株，并使之感染细胞，使病毒增值，病毒吸附程序 为up :1500mL/min hold lmin、Down :1500mL/min hold lmin、设定最大换液量 18500mL ; 病毒培养程序up :1000mL/min hold lmin、Down lOOOmL/min hold lmin、设定最大换液量 18500mL ；(4)于37°C、5%C02培养环境下继续培养；培养5日后，第一次收获，采用半连续 工艺，换液比例为50% ；连续培养11天，每24h收获一次，每次换液比例为50% ；(5)将半连续工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液于-20°C冻融两次后混 合，并进行以下检验(a)纯净性检验按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(b)病毒含量测定按照常规小鼠脑内接种法进行。即将收获的狂犬病毒液用灭 菌生理盐水进行10倍系列稀释，每个病毒液取10_3 10_6各4个稀释度，每个稀释度通过 脑内接种注射4只11 13g的昆明系小鼠，0. 03ml/只，连续观察14天，记录14天后小鼠 死亡情况，并根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1. 0ml含病毒> 107 0LD50 ；(c)特异性将毒种(疫苗)用灭菌生理盐水稀释成为每1ml含有100个小鼠的 最小感染量的病毒悬液，与等量的抗狂犬病毒特异性血清充分混合，置10 15°C中和lh， 其间振摇2 3次。同时设立阳性对照组(病毒对照)和阴性对照组(生理盐水)。中和 结束后分别接种小鼠2只，每只脑内注射0. 03ml。除阳性对照组全部死亡外，其余两组在接 种后2周内精神状态良好，无不良反应。(6)经检验合格的每毫升病毒含量> 107 0LD50的狂犬病毒原液经过灭活离心纯化 得到狂犬病毒抗原。对比例悬浮培养工艺与传统转瓶培养技术比较通过对大规模潮汐式细胞微载体悬浮培养系统与常用转瓶培养系统相关生产性 能指标进行对比，结果如表1所示。表1不同培养系统增殖狂犬病毒的相关比较 备注BioN0C II载体贴壁面积lg = 2400cm2,1个TideCell_020微载体悬浮培养 系统加入BioNOC II载体220g。上列详细说明系针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限 制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案 之专利范围中。
权利要求
一种狂犬病毒抗原的制备方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统大规模生产狂犬病毒抗原，包括如下技术步骤(1)培养制备抗原用细胞将可增殖狂犬病毒的细胞系接种到含有培养液与微载体的载体罐中，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；(2)毒液的接种与繁殖将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次，换液比例为50％；(3)经检验合格后，将半连续工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃冻融两次，灭活纯化得到狂犬病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于，所述细胞微载体悬 浮培养系统为潮汐式。
3.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于步骤(1)中启动贴附 程序4h后切换培养程序；所述的细胞贴附程序参数为up :2200 2600mL/min hold 40 100s、Down 2200 2600mL/min hold 40 75s、设定最大换液量18500mL ；细胞培养程序 参数为up 1600 2000mL/min hold40 100s、Down 1600 2000mL/min hold 40 100s、设定最大换液量18500mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中启动吸附程序后4h换成病毒培 养程序，所述病毒吸附程序参数为up 1300 1700mL/min hold40 100s、Down 1300 1700mL/min hold 40 75s、设定最大换液量18500mL ；病毒培养程序参数为up 1000 1400mL/min hold 40 100s、DownlOOO 1400mL/min hold 40 100s、设定最大换液量 18500mLo
5.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于所述可增殖狂犬病毒 的细胞系为仓鼠肾细胞系；培养液为95% 98% DMEMJn 2% 5%牛血清，加适量抗菌 素，PH值为7. 0 7. 4 ；所述微载体为聚酯纤维。
6.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于细胞培养温度36 37°C，培养环境中含有2. 5% 5%二氧化碳。
7.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于微载体用量为每 500ml培养液添加5. 5g微载体，细胞初始接种量为1. 8 3. 6 X 107cellS/g微载体。
8.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的接种 狂犬病毒时的细胞密度为1. IXlO8 1.0X109cells/g微载体。
9.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)按病毒感染 复数(M. 0. I.)为0. 01 1的比例接种病毒。
全文摘要
本发明公开了一种大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统大规模生产狂犬病毒抗原将制备抗原用细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐中，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次；将收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃冻融两次，灭活纯化得到狂犬病毒抗原。该方法生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低。
文档编号C12N7/02GK101851610SQ20101013513
公开日2010年10月6日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者乔荣岑, 习向锋, 孙进忠, 张海洋, 张许科, 李三, 王进产, 陶家权 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司