专利名称：一种红细胞吸附法联合rt-pcr检测具有血凝性病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，具体涉及一种以新城疫为研究对象，采用红细胞吸附法联合RT-PCT检测具有血凝性病毒的方法。
背景技术：
有些病毒能吸附于鸡、火鸡和鸭等动物的红细胞表面，并引起红细胞凝集，这种特性与病毒囊膜上的纤突所含血凝素和神经氨酸酶有关。具有这种特性的病毒主要有新城疫和禽流感等。0(Newcastle Disease, ND)(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种极易传染的毁灭性疾病，典型症状是呼吸道、消化道黏膜出血，最常侵袭家鸡，也能感染许多其它家禽和野鸟，人也有易感性。该病1拟6年首次发现于印尼，同年发现于英国新城，因此得名新城疫。该病分布于世界各地，1928年我国已有该病的记载，1935年在我国有些地区流行。新城疫感染的死亡率高达100%，同高致病性禽流感同属A类病，给世界养禽业带来巨大的威胁。目前用于检测NDV的方法有血凝和血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、病毒分离法等，这些方法虽然可以对病原作出诊断，但却存在费时、代价高、敏感性和稳定性不够好的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法。以新城疫病毒(NDV)作为研究对象，选取NDV的核衣壳蛋白的核苷酸序列设计一对引物，利用其能吸附于鸡、火鸡和鸭等动物的红细胞表面这一重要生物学特性， 建立一种适合于NDV快速检测的红细胞吸附联合RT-PCR法。本发明方法敏感性和稳定性都很好，具有较大的临床运用价值，也同样适合于禽流感等具有血凝性病毒的检测。本发明的红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，具体包括以下步骤1)制备红细胞用灭菌注射器吸取柠檬酸抗凝剂ImL (其用量为所需血量的1/4体积)，从鸡翅静脉抽血4mL，置灭菌离心管内，加灭菌PBSlOmL，以2000r/min离心5min，弃上清液，再加灭菌 PBS IOmL悬浮血球，再以2000r/min离心5min，如此将红细胞洗涤三次即可。2)红细胞吸附NDV取出从鸡场采集的污染粪便0. Ig,加2mLPBS振荡混勻，使病毒溶解于PBS中，以 10000r/min离心5min，取离心后上清液加约50uL的红细胞，室温作用1小时，2000r/min离心5min，弃上清，沉淀即为含有NDV的红细胞。如果污染的病料中含极少NDV，可通过红血球多次吸附以集中NDV。3)病毒RNA提取
RNA提取按1Trizol-A+提取总RNA说明书进行。4) RT-PCR 扩增i)引物设计与合成根据GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，设计合成了一对特异性引物，能扩增 578bp的基因片段。引物序列如下NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ii)反转录冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水6 μ L，5 X反转录酶 Buffer 4 μ L，dNTP Mixture (IOmM) 1 μ L, NP 上游引物 Fll μ L(10 μ Μ)，RNA 酶抑制剂 1 μ L, NDV病毒RNA 5 μ L，AMV反转录酶2 μ L (5U/ μ L)，总体积20 μ L。在冰上混合后，室温放置 IOmin, 420C Ih后冰上冷却2 ^iin ；所得的反应液可立刻用于PCR反应或_20°C保存备用。iii)PCR 反应在PCR 管中依次加入反转录产物 2 μ L，IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L， dNTP (IOmM) 1 μ L, NP-FU NP-Rl (10 μ Μ)各 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L, ddH20 15. 25 μ L ；总体积25 μ L在冰上混合。PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，49°C退火25s，72°C延伸60s，循环 32次，最后72°C延伸IOmin05)敏感性试验取出冻存的新城疫病毒尿囊液20uL到2mL的PBS内，震荡混勻后从中取200uL到 2mL的PBS内，依次类推，共稀释九个梯度。一组未做处理，另一组用红血球吸附NDV，分别抽提病毒RNA，用RT-PCR法检测其敏感性。6)稳定性试验取出感染有F48E9，ND79和La Sorta毒株的鸡粪便和肾脏，用红细胞吸附法和 RT-PCR法共同检测NDV。本发明的红细胞吸附法联合RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和稳定性，且临床运用价值较大，还可适用于禽流感等具有血凝性病毒的检测。
图1为敏感性试验结果，其中M为Marker DL2000，1 5为红血球吸附联合 RT-PCR法检测第5 第9稀释梯度的NDV结果，6 10为只用RT-PCR法检测第5 第9 稀释梯度的NDV结果。图2为稳定性实验结果，其中M为Marker DL2000，1、3、5分别为感染F48E9、ND79 和LaSorta鸡粪便的检测结果，2、4、6分别为感染F48E9、ND79和LaSorta鸡肾脏的检测结^ ο
具体实施例方式
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以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。其中，F48E9，ND79和La Sorta毒株均由上海农科院畜牧所病毒课题组提供。AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP及DNA MarkerDL-2000等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。Trizol-A+总RNA提取试剂购自上海皓嘉科技发展有限公司。实施例11)制备红细胞用灭菌注射器吸取柠檬酸抗凝剂lmL，从鸡翅静脉抽血4mL，置灭菌离心管内，加灭菌PBSlOmL，以2000r/min离心5min，弃上清液，再加灭菌PBSlOmL悬浮血球，再以2000r/ min离心5min，如此将红细胞洗涤三次即可。2)红细胞吸附NDV取出从鸡场采集的污染粪便0. Ig,加2mLPBS振荡混勻，使病毒溶解于PBS中，以 10000r/min离心5min，取离心后上清液加约50uL的红细胞，室温作用1小时，2000r/min离心5min，弃上清，沉淀即为含有NDV的红细胞。如果污染的病料中含极少NDV，可通过红血球多次吸附以集中NDV。3)病毒RNA提取RNA提取按1Trizol-A+提取总RNA说明书进行。实施例2RT-PCR 扩增i)引物设计与合成根据GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，设计合成了一对特异性引物，能扩增 578bp的基因片段。引物序列如下NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ii)反转录冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水6 μ L，5X反转录酶 Buffer 4 μ L，dNTP Mixture (IOmM) 1 μ L, NP 上游引物 Fll μ L(10 μ Μ)，RNA 酶抑制剂 1 μ L, 病毒RNA 5 μ L，AMV反转录酶2 μ L (5U/ μ L)，总体积20 μ L。在冰上混合后，室温放置lOmin， 42°C Ih后冰上冷却2 ;3min ；所得的反应液可立刻用于PCR反应或_20°C保存备用。iii)PCR 反应在PCR 管中依次加入反转录产物 2 μ L，IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L， dNTP (IOmM) 1 μ L, NP-FU NP-Rl (10 μ Μ)各 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L, ddH20 15. 25 μ L ；总体积25 μ L在冰上混合。PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，49°C退火25s，72°C延伸60s，循环 32次，最后72°C延伸IOmin0实施例3敏感性试验取出冻存的新城疫病毒尿囊液20uL到2mL的PBS内，震荡混勻后从中取200uL到2mL的PBS内，依次类推，共稀释九个梯度。一组未做处理，另一组用红血球吸附NDV，分别抽提病毒RNA，用RT-PCR法检测其敏感性，结果参见图1。从图1可以看出通过红血球吸附联合RT-PCR法共同检测的NDV，在第8个稀释梯度之前的都能检测到一条为578bp的条带。而仅通过RT-PCR法检测的NDV，在最初的第 5稀释梯度时就已检测不到条带，说明红血球吸附联合RT-PCR法检测NDV的敏感性要高于仅用RT-PCR法至少104以上。实施例4稳定性试验取出感染有F48E9，ND79和LaSorta毒株的鸡粪便和肾脏，分别用红细胞吸附法联合RT-PCR共同检测NDV，结果参见图2。从图2可以看出感染有F48E9，ND79和LaSorta毒株的鸡粪便和肾脏都能检测到一条578bp的条带。由此得知红细胞吸附法联合RT-PCR不仅适用于NDV不同的毒株，而且还可以适用于不同的样品间。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1.一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤1)制备红细胞；2)红细胞吸附新城疫病毒；3)病毒RNA提取；4)RT-PCR 扩增；5)敏感性试验；6)稳定性试验。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备红细胞过程中柠檬酸抗凝剂的用量为所需血量的1/4体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的引物序列如下 NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有血凝性病毒为新城疫病毒。
全文摘要
本发明公开了一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，以新城疫病毒NDV作为研究对象，选取NDV的核衣壳蛋白的核苷酸序列设计一对引物，利用其能吸附于鸡、火鸡和鸭等动物的红细胞表面这一重要生物学特性，建立适合于NDV快速检测的红细胞吸附联合RT-PCR法。具体包括以下步骤1)制备红细胞；2)红细胞吸附新城疫病毒；3)病毒RNA提取；4)RT-PCR扩增；5)敏感性试验；6)稳定性试验。本发明具有较好的敏感性和稳定性，临床运用价值大，可适用于禽流感等具有血凝性病毒的检测。
文档编号C12Q1/68GK102234692SQ20101015478
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者刘成倩, 易建中 申请人:上海市农业科学院