筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及其应用的制作方法

专利名称：筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学、基因工程、肿瘤学以及医学相关领域。更具体的，本发明涉及两种肿瘤工程细胞的构建。通过在来源细胞基因组中稳定的整合一段启动子区域被过甲基化的荧光基因，该肿瘤工程细胞可以选择性的且灵敏的对可逆转基因沉寂的物质产生荧光反应。此外，本发明还涉及使用该两种肿瘤工程细胞为模型，筛选可逆转基因沉寂的药物及疗法的方法。
背景技术：
在探索生命科学与人类疾病的关系中，我们很早就了解并接受了这样一个发现-遗传密码的变异普遍的存在于各种疾病中。而随着越来越多人类疾病建立起了与遗传物质(DNA，RNA)核酸序列的增、减、替代、重组的关联，我们已经确立起这样一个概念和共识大多数(如果不能说是绝大多数的话)疾病的起源，就是一种或数种被改变(变异)的遗传状态。特别是对于现代人类头号杀手之一的癌症更是如此。事实上，癌症也一直都被认为是一种基因变异所致的疾病(Hanahan和Weinberg，Cell 2000，100 :57-70)。然而，随着对癌症分子机理的深入研究以及对染色质变化的观测在技术上成为可能，生物医学科学家们在肿瘤细胞中发现了一种更为普遍的分子损伤(既导致癌变的原因)_表观遗传学修饰水平上的基因沉寂-它甚至比基因本身的变异导致了更多的肿瘤形成。表观遗传学研究的是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，其中两个最为关键的分子因素是DNA甲基化以及组蛋白修饰引起的染色质构象变化。组蛋白是将DNA 包裹进核小体(组成染色质的最小单元)的一组小蛋白。每个核小体由8个组蛋白以及147 个DNA碱基对共同组成。这些组蛋白的氨基端(N-端)从核小体内核中延伸出来，形成了组蛋白尾，而组蛋白尾部上的氨基酸则可以被乙酰基化、甲基化、磷酸化、泛素化等方式修饰。 这些修饰的组合构成了复杂的组蛋白密码。基于组蛋白密码，激活或抑制蛋白被吸引到核小体的DNA上，决定这一段的染色质是以松散(基因表达)还是紧密(基因沉寂)的形式存在。在组蛋白修饰中，组蛋白乙酰基化是DNA激活状态的重要标志。与组蛋白令人眼花缭乱的复杂修饰相比，DNA甲基化相对来说较为简单，是将单个甲基(CH3-)添加到胞嘧啶的5位上。在哺乳动物中这样的修饰只发生在位于鸟嘌呤之前的胞嘧啶上，因此被称为CpG (既cytosine preceding guanine)。在约半数的人类基因的启动子区域存在着由几十至上百CpG组成的CpG岛，其胞嘧啶在正常细胞中一般未被甲基化。在绝大多数的肿瘤细胞中，大量抑癌基因启动子区域的CpG岛出现了过甲基化现象。受影响的(启动子被过甲基化)基因将被永久的沉寂。由于DNA的甲基化可以随着有丝分裂在甲基化转移酶(DNMT)的作用下维持和扩增，又由于这些获得过甲基化从而抑制某些抑癌基因表达的细胞群获得了相对正常细胞的生存优势，这样的表观遗传学损伤将会逐渐积累、放大、叠加，最终导致癌变的发生。在人类肿瘤中，数以百计到千计的基因会因为启动子过甲基化而被沉寂，这种表现形在肿瘤学中被命名为CpG岛甲基化表现型(CIMP)。 CIMP最初在直结肠癌中被发现，而其后的研究在几乎所有的肿瘤与白血病类型中发现与确认了其存在(Issa, Nature Review Cancer 2004，4 :988-993)。表观遗传学水平上的 DNA 过甲基化在肿瘤中的发生率相比基因变异来说更为频繁得多。在多种人类乳腺癌与直结肠癌中进行的、超过20，000个转录子的大规模测序研究发现，DNA过甲基化引起的可致癌的基因沉寂是可致癌的基因变异的10-100倍(Wood等，Science 2007,318 :1108-13)。举例来说，Wnt细胞信号通路的过度活性长期被认为是癌症发生过程中重要的早期事件。实验证明，Wnt信号通路的过度活性与SFRP基因的沉寂相关。SFRP蛋白可以抑制Wnt受体，进而抑制Wnt信号通路。而启动子区域的过甲基化是导致SFRP基因沉寂的直接原因。此外， 表观遗传学水平的启动子区域过甲基化导致的基因沉寂还会抑制那些修复或阻止DNA损伤的基因，从而导致癌变的发生。比如，抑癌基因Pl6ffi4a的基因沉寂被发现普遍存在于上皮癌症、乳腺癌、淋巴癌以及淋巴细胞贫血症中。类似的，GST-PI基因的沉寂被发现存在于几乎所有的前列腺癌。对于直结肠癌，70-80%的患者的DNA错配修复基因MLHl发生基因沉寂。对于乳腺癌，BRCA1、pl61NK4a、E-cadherin、TIMP-3、CDHl、TWIST、CCND2 等众多抑癌基因因为启动子区域过甲基化而发生沉寂。过甲基化导致的抑癌基因沉寂是肿瘤发生的主因之一。调控组蛋白密码(既组蛋白修饰)也对肿瘤发生有极为关键的作用。在肿瘤细胞中，某些基因的变异会吸引组蛋白修饰酶，从而改变重要基因的表达。如组蛋白去乙酰基酶 HDAC的异常活性会导致组蛋白失去乙酰基，从而将染色质从激活的松散状态改变为导致基因沉寂的紧密状态，进而导致正常细胞向癌细胞的转化。一个实例是在急性前髓细胞白血病中，PML-RAR基因的移位会吸引并激活HDAC，导致正常细胞的白血病化。此外，其他影响组蛋白密码因子的抑制或激活，如组蛋白乙酰化酶CBP与激活组蛋白3的甲基化转移酶MLL 的失活、以及抑制组蛋白3的三甲基化转移酶EZH2的过度活性，都会抑制抑癌基因的转录表达，在肿瘤发生中起到了相当关键的作用。由于表观遗传学在健康与疾病上的作用被生物医学界越来越牢固的认可，美国以及国际科学界已经联合起来建立表观遗传学组，也就是在整个基因组的水平上确定表观遗传学修饰在不同人群、不同生理组织、不同疾病中的变化。美国的国立卫生研究院已经宣布了表观遗传组学路线图项目，而美国癌症研究协会也与欧盟科学顾问委员会联合建立了人类表观遗传组与疾病联盟。随着表观遗传学及表观遗传组学研究的深入，国际医学界已经确认，抑癌基因沉寂是致癌作用的原因，而非结果；抑癌基因沉寂发生在肿瘤发生发展过程的非常早期，既癌变前期；启动子区域的过甲基化是比基因变异更为普遍的导致癌变的原因。鉴于以上的事实，一种可以便捷、灵敏、易于观测的筛选那些可以逆转基因沉寂的物质的方法，将会对开发针对抑癌基因沉寂为治疗靶标的药物与疗法产生极为重要的推动作用；提高该类药物的开发效率，降低开发成本。

发明内容
本发明所要解决的问题是，提供一种筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞， 该肿瘤工程细胞能够便捷、灵敏地筛选那些可以逆转基因沉寂的物质。本发明提供的技术方案是筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞，包含有一个报告基因，该报告基因置于一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下，因此该报告基因处于被沉寂的状态。而且，该报告基因为表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的报告基因，该报告基因的启动子为CMV启动子，且该启动子区域内的CpG岛被甲基化从而该启动子被抑制；该肿瘤工程细胞还包含有一个新霉素抗性基因neor为选择基因，该选择基因的启动子为SV40启动子。而且，该肿瘤工程细胞源于HCT-116人直结肠癌细胞，并经过基因工程改造以达到所述特征；该工程细胞被命名为ECRC-I人直结肠癌工程细胞，保藏号为CCTCC C201044(保藏日期2010年4月30日；保藏单位中国典型培养物保藏中心CCTCC)。所述基因工程改造为在HCT-116人直结肠癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体，该载体包含有CpG岛被甲基化的CMV启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白EGFP 报告基因、以及一个SV40启动子及其所控制的新霉素抗性基因neor。或者，该肿瘤工程细胞源于MDA-MB-231人乳腺癌细胞，并经过基因工程改造以达到所述特征；该工程细胞被命名为EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞，保藏号为CCTCC C201045(保藏日期2010年4月30日；保藏单位中国典型培养物保藏中心CCTCC)。所述基因工程改造为在MDA-MB-231人乳腺癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体，该载体包含有CpG岛被甲基化的CMV启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白EGFP 报告基因、以及一个SV40启动子及其所控制的新霉素抗性基因neor。本发明所述的肿瘤工程细胞在筛选用于逆转表观遗传水平基因沉寂的药物上的应用。本发明涉及到两种肿瘤工程细胞，该两种肿瘤工程细胞均包含有一个被表观遗传学水平失活的启动子所控制的报告基因。因此，该报告基因在该两种肿瘤工程细胞中是被沉寂的。所述表观遗传学水平的失活由DNA甲基化形成。DNA甲基化由位于CpG岛的胞嘧啶的甲基化形成。该被甲基化的启动子是PCMV。该报告基因为增强绿色荧光蛋白(EGFP) 基因。该肿瘤工程细胞均包含有一个选择基因。该选择基因为新霉素抗性基因(neor)。该新霉素抗性基因为一个SV40启动子所控制。该两种肿瘤工程细胞来源于两种人类癌症细胞系一种肿瘤工程细胞的源细胞是HCT-116人直结肠癌细胞，该细胞包含有一个表达增强型绿色荧光蛋白的报告基因，该报告基因的启动子为CMV启动子，该CMV启动子被甲基化，甲基化发生在启动子区域的CpG岛中；该工程细胞包含有一个选择基因，该选择基因为新霉素抗性基因，该新霉素抗性基因为一个SV40启动子所控制。该工程细胞为ECRC-I人直结肠癌肿瘤工程细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址武汉大学)。另一种肿瘤工程细胞的源细胞是MDA-MB-231人乳腺癌细胞，该细胞包含有一个表达增强型绿色荧光蛋白的报告基因，该报告基因的启动子为CMV启动子，该CMV启动子被甲基化，甲基化发生在启动子区域的CpG岛中；该工程细胞包含有一个选择基因，该选择基因为新霉素抗性基因， 该新霉素抗性基因为一个SV40启动子所控制。该工程细胞为EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址武汉大学)。本发明还提供将候选物质(药物或疗法)与如上描述的肿瘤工程细胞接触，其后检测报告基因是否在该肿瘤工程细胞中表达的方法。而且，检测报告基因是否在该肿瘤工程细胞中表达使用的是荧光激活细胞分拣术，也称为流式细胞术。而且，当细胞与候选物质相接触时，该肿瘤工程细胞处于活跃的复制状态中。
而且，在细胞与候选物质接触前，该肿瘤工程细胞在平面培养皿中应该生长至较为密集。而且，在细胞与候选物质接触前，该肿瘤工程细胞在三维培养条件下应该生长为球状细胞团。本发明提供了针对直结肠癌和乳腺癌的两种肿瘤工程细胞，构造该类肿瘤工程细胞的方法，以及使用该类肿瘤工程细胞进行药物筛选的方法。可以提高该类药物的开发效率，降低开发成本。保藏说明ECRC-I人直结肠癌工程细胞，保藏号CCTCC C201044 ；保藏日期2010年4月30日； 保藏单位中国典型培养物保藏中心CCTCC ；EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞，保藏号CCTCC C201045 ；保藏日期2010年4月30 日；保藏单位中国典型培养物保藏中心CCTCC。


图1为本发明报告基因载体示意图。图2为本发明实施例的pEGFP-Nl载体示意图。图3为本发明实施例的在ECRC-I细胞及EBTC-I细胞中基因载体插入实时定量 PCR实验结果示意图。显示的是针对CMV启动子、EGFP基因、neor基因及内部参照物HBB 基因的每一个实时定量PCR探针(即引物)在(a)ECRC-I肿瘤工程细胞及(b)EBTC_l肿瘤工程细胞的基因组DNA中产生的标准曲线。横坐标代表的是DNA浓度的LoglO，纵坐标显示的是Ct value，即实时定量PCR循环数。根据Applied Biosystems公司提供的实验手册计算确定，CMV启动子、EGFP及neor基因在(a) ECRC-I肿瘤工程细胞及(b) EBTC-I肿瘤工程细胞的基因组中的拷贝数均为1个。图4为本发明实施例的ECRC-I人直结肠癌肿瘤工程细胞在SAHA及DAC处理下的反应示意图，其中(a)在没有药物处理的情况下，ECRC-I的源细胞HCT-116人直结肠癌细胞中没有表现绿色荧光信号；(b)在没有药物处理的情况下，ECRC-I肿瘤工程细胞中没有表现绿色荧光信号；(c)在低剂量组蛋白去乙酰基酶抑制剂SAHA处理的情况下，12. 76%的ECRC-I肿瘤工程细胞表现出绿色荧光信号；(d)在低剂量DNA甲基化转移酶抑制剂DAC处理的情况下，25.91%的ECRC-1肿瘤工程细胞表现出绿色荧光信号。图5为本发明实施例的EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞在SAHA及DAC处理下的反应示意图，其中(a)在没有药物处理的情况下，EBTC-I的源细胞MDA_MB_231人乳腺癌细胞中没有表现绿色荧光信号；(b)在没有药物处理的情况下，EBTC-I肿瘤工程细胞中没有表现绿色荧光信号；(c)在低剂量组蛋白去乙酰基酶抑制剂SAHA处理的情况下，16. 37%的EBTC-I肿瘤工程细胞表现出绿色荧光信号；
(d)在低剂量DNA甲基化转移酶抑制剂DAC处理的情况下，17. 51%的EBTC-I肿瘤工程细胞表现出绿色荧光信号。
具体实施例方式实施例1.构建筛选逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞的原理在此处用到的“肿瘤工程细胞”，指的是其基因组被稳定的插入一段外源DNA的肿瘤细胞。稳定的插入的意思是，这段外源DNA随着细胞的分裂而复制，并被分配到其子代细胞中。具体来说，这段外源DNA片段包含有一个被甲基化的启动子，一个被该甲基化启动子控制的(因此是沉寂的)报告基因，以及一个选择基因。在此处用到的“启动子”，指的是一段可以启动基因转录的DNA序列。基因转录这一过程的结果是基因表达产物(通常是蛋白质)的合成。在真核细胞中，启动子的调控序列通常被称为转录因子的蛋白所附着，从而导致转录复合物的形成，以及基因的转录与表达。如果与某基因相连的启动子序列被在遗传学水平或表观遗传学水平上所抑制，相应的该基因被沉寂；也就是说，该基因不可以被转录，其基因产物也不可以被表达出来。“遗传学水平的抑制”指的是通过改变核苷酸序列的方法，既增加、减少、替代、重组构成启动子序列的碱基对。而另一方面，“表观遗传学水平的抑制”指的是一种可遗传的(既可以被稳定的传递到下一次代的)，不涉及核苷酸序列本身改变的基因表达的改变。表观遗传学水平抑制的一个主要例子就是启动子区域CpG岛甲基化，其结果是与该启动子区域相连的基因被沉寂。CpG指的是16种可能的DNA碱基双核苷序列(即AA、AT、AC、AG、TT、ΤΑ、TC、TG、 CC、CA、CT、CG、GA、GT、GG和GC)中的一种。此处的“P”指的是连接胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G) 的磷酸二酯键。因此，CpG是一个“胞嘧啶-磷酸二酯键-鸟嘌呤”序列。从概率统计上来说，这16种双核苷序列在一段随机的DNA序列中出现的几率都是1/16，既约6. 2%。然而， 在人类基因组中，CpG出现的几率却远低于6. 2%。这一现象被认为与脱氨基作用有关。然而，在基因组中存在着CpG双核苷序列出现几率很高(接近其统计学概率)的区域，这种区域被称为CpG岛。目前被广泛接受的CpG岛的定义是一段长于200个碱基对的DNA序列，其胞嘧啶加鸟嘌呤含量超过50%且CpG出现几率不少于其统计概率的0. 6倍。CpG岛在其正常状态下表现出比整个基因组中零散的CpG双核苷序列低得多的甲基化。DNA甲基化转移酶(DNMT)家族包含有4种DNMT。DNA甲基化转移酶通过使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体来甲基化CpG双核苷的胞嘧啶的第五位。CpG岛以非常显著的高频率发生在基因的启动子区域；据估算，高达70%的基因启动子区域包含有CpG岛。如上面所述的，正常的细胞状态下，启动子区域的CpG岛是未被甲基化的，而包含有未被甲基化CpG岛的启动子处于激活状态。另一方面，启动子区域的 CpG岛的甲基化是启动子失活以及基因沉寂的指示。尽管表观遗传学水平DNA甲基化所导致启动子失活是导致基因沉寂的主要因素， 但可以预料的是，DNA甲基化不会是单独作用的。事实上，一系列极为复杂的组蛋白尾部氨基酸的修饰与DNA甲基化一同作用于基因沉寂中。这些修饰包括组蛋白尾部某些氨基酸的甲基化、乙酰基化以及去乙酰基化，其复杂的组合形成了被称为“组蛋白密码”的一套编码，调控着基因的转录活性状态。事实上，在人类基因组中的大多数DNA都以过甲基化的染色质形式存在，并与去乙酰基化的组蛋白一起形成紧密核小体。这种紧密的核小体结构会阻止转录因子与DNA结合；因此，这些被包裹进紧密核小体的染色质区域被沉寂了。这种基因沉寂被一组组蛋白去乙酰基酶(HDACs)所维持。以上的论述建议了两种有效的恢复基因活性(既逆转基因沉寂)的方法，既逆转基因启动子区域的甲基化，以及抑制组蛋白去乙酰基酶的活性。这样的推论被显示出至少是部分正确的。例如，DNA甲基化转移酶抑制剂阿扎胞苷Azacitidine (简称AZA)及脱氧阿扎胞苷Decitabine (2，-deoxy-5' -Azacitidine简称DAC)可以重新激活被沉寂的基因启动子以及随后的基因表达。组蛋白去乙酰基酶抑制剂SAHA可以有效的抑制组蛋白去乙酰基酶，从而恢复基因表达。而另一方面，用阿扎胞苷AZA处理细胞除了通过抑制DNA甲基化转移酶进而有效的逆转了启动子区域CpG岛的甲基化，还明显的影响了包裹该基因DNA的组蛋白赖氨酸9及赖氨酸4的乙酰基化的恢复；这些作用共同导致了被沉寂基因的激活与表达。随着快速积累的证据压倒性的表明表观遗传学水平上的基因沉寂不单伴随着多种疾病(特别是癌症)的发展，更是伴随在这些疾病发生的最初阶段，医学界与医药开发界显然亟需一种可以灵敏快捷的筛选那些可逆转启动子区域甲基化以及组蛋白去乙酰基化的物质的方法。这些被筛选到的可以逆转基因沉寂的物质将会是用来治疗及阻止疾病，特别是癌症，的非常有效的药物。本发明正是提供了这样一种方法，以及使用这一方法的工具。实施例2.载体与工程细胞的构建在此处，此方法涉及到构建肿瘤工程细胞系。该肿瘤工程细胞均包含一个在甲基化(因此是被抑制的)启动子控制下的可以稳定遗传的报告基因。在使用候选物质处理的情况下，检测报告基因产物的在该工程细胞中的表达；如果报告基因表达，表明该候选物质可以逆转报告基因表观遗传学水平上的沉寂。尽管有很多种的细胞系可以被选择作为构建该肿瘤工程细胞的源细胞，我们最初成功构建的两种肿瘤工程细胞来源于HCT-116人直结肠癌细胞以及MDA-MB-231人乳腺癌细胞。该两种源细胞均来自NCI-60细胞组(美国国立癌症研究所维持的被医药界普遍接受用于筛选抗癌药物的一组60种肿瘤细胞)。可以理解的是，本发明提供的方法可构建的肿瘤工程细胞并不是局限于某几种特定的细胞系；也就是说，任何可以稳定转录插入的外源报告基因的细胞系，当然在目前阶段特指肿瘤细胞系，均可以成为本发明所提供的工程细胞构建方法的源细胞系。对于将被工程化改造的细胞系来说，本发明提供的方法可以适用于多种报告基因。在目前阶段，我们倾向于选择一种报告基因，其基因产物的表现型可以被容易、便捷的监测到。其中特别倾向于那些基因产物可以发出冷光、荧光、或者吸收某个波长光的报告基因。同时，一个非常关键的考虑因素是这种报告基因不可以原本就存在于源细胞中；另外一个关键的考虑因素是该报告基因的激活不需要任何其他的底物或者共同作用因子。基于这些原则，绿色荧光蛋白基因GFP被选择作为报告基因。更具体的，我们选择的增强型绿色荧光蛋白基因EGFP。增强型绿色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的变种，可以在荧光激活细胞分拣术实验中激发出比绿色荧光蛋白更强的荧光信号。值得说明的是，本发明提供的构建肿瘤工程细胞的方法不局限于某一种特定的报告基因，凡是符合上述标准的基因，如萤光素酶基因、beta-半乳糖苷酶基因、beta-葡萄糖苷酸酶基因等，均可以依据实际需要被选择成为报告基因。在本发明中，报告基因被置于一段启动子的控制之下。被选择成为报告基因启动子的标准是该启动子可以诱导EGFP增强型绿色荧光蛋白基因的转录与表达，启动子区域内包含有一个或更多的CpG岛，其CpG岛的甲基化可以使该启动子失去活性。所有符合上述要求的启动子均在本发明的范畴内。在本发明已经构建的两种肿瘤工程细胞(既来源于 HCT-116细胞的ECRC-I人直结肠癌肿瘤工程细胞和来源于MDA-MB-231细胞的EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞)中，我们使用了人类细胞巨化病毒CMV启动子。该启动子已知可以在极为广泛的细胞系中，稳定且连续的支持被克隆基因的表达。为了提高稳定的细胞克隆的效率，一个选择基因被整合到源细胞的基因组中。选择基因会表达一个基因产物，该基因产物可以保护细胞不受到人为添加到细胞培养液中的毒素的伤害。用这种方法，被稳定克隆的带有该选择基因的工程细胞可以在有毒素的培养液中存活，而没有被稳定克隆的细胞则会死亡。在本发明已经构建的ECRC-I人直结肠癌肿瘤工程细胞和EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞中，我们使用的是新霉素抗性基因neor。该抗性基因被包括到携带报告基因的质粒载体中，并被置于SV40启动子的控制下。在添加有新霉素(或其类似物)的细胞培养液中，该选择基因的表达提供了对被克隆的哺乳动物细胞稳定的保护和选择作用。值得说明的是，HCT-116细胞及ECRC-I工程细胞的细胞培养液为含有10%胎牛血清的改进型McCoy’ s 5A培养液，而MDA-MB-231细胞及EBTC-I工程细胞的培养液为含有 10%胎牛血清的Leibovitz’ s L-15培养液。这些培养液在细胞生长、新霉素选择、质粒转染、药物筛选及其他所有需要培养细胞的条件下均适用。根据我们构建肿瘤工程细胞的要求，我们所需的报告基因载体依次包含有PCMV 启动子、EGFP基因、SV40启动子以及neor基因组成。该报告基因载体的线性示意图见图 1。将该报告基因质粒载体转染进入源细胞(既HCT-116细胞及MDA-MB-231细胞)， 我们使用了本领域的工作人员熟知的标准的质粒转移技术。在转染前，PCMV启动子区域的 CpG岛必须被甲基化，以使该启动子失去启动EGFP基因转录及表达的活性。为了达到这一目的，我们选择了 pEGFP-m质粒(Clontech公司)。需要再一次指出的是，任何符合下述克隆操作要求的质粒载体均可以被用于此处，且均包含在本发明的范畴中。PEGFP-Nl载体的示意图见图2。制备EGFP报告基因启动子区域被单独甲基化质粒的具体步骤为1) 一部分pEGFP-Nl质粒被使用ksl (CpG)甲基化酶(新英格兰生物实验室公司) 处理。该酶可以特异性的甲基化双链CpG双核苷酸序列；使用ksl酶处理质粒的方法依据新英格兰生物实验室公司提供的标准方法，在此不予详述。2)由于ksl甲基化酶的非选择性，它可以甲基化被克隆过的载体中所有的CpG。 因此，我们使用两种限制性内切酶Pci I和Bgl II (新英格兰生物实验室公司)将CMV启动子序列完全从被^sI甲基化过的质粒中切除出来；Pci I和Bgl II双酶切的方法依据新英格兰生物实验室公司提供的标准方法，在此不予详述。被切除的甲基化CMV启动子片段在DNA琼脂糖胶中被与质粒分离，并被DNA胶提取试剂盒(Qiagen公司)所提纯出来；提纯方法依据Qiagen公司提供的标准方法，在此不详述。3)同时，未被ksl处理的pEGFP-Nl也被限制性内切酶Pci I和Bgl II双酶切， 被切除CMV启动子区域的未被甲基化的质粒被分离并提纯出来。方法同上。4)步骤2中被甲基化的CMV启动子片段与步骤3中未被甲基化的切除了 CMV的质粒，被DNA连接酶连接起来，使用的是DNA快速连接试剂盒(Roche公司)及其提供的标准方法。于是就获得了仅有报告基因启动子被特异性甲基化的质粒。pCMV启动子的甲基化水平可以被亚硫酸氢盐测序法以及亚硫酸氢盐焦硫酸测序法来检测。前者(亚硫酸氢盐测序法)可以检测pCMV中总的CpG甲基化水平。而后者(亚硫酸氢盐焦硫酸测序法)可以定量测量多个连续的CpG位点各自的甲基化程度，非常精确， 且实验结果可重复性极佳(高于95%的可重复性)。将该改造过的质粒转染进HCT-116细胞或MDA_MB_231细胞使用的是 Lipofectamine 2000 Qnvitrogen公司)转染试剂。转染细胞的条件可以依据hvitrogen 公司提供的守则及对不同细胞转染条件的数据库来确定。因此，转染的具体操作程序在此不详述。在转染之后，被整合进报告基因载体的细胞在含有新霉素的培养液(终浓度 400 μ g/mL)中进行选择。如前所述，稳定整合了 neor新霉素抗性基因的细胞将会在含有新霉素(或其类似物)的培养液中存活下来。在存活的细胞被转入不含有新霉素的培养液中培养以后，细胞被胰蛋白酶消化下来，并被荧光激活细胞分拣术筛选出没有绿色荧光蛋白表达的细胞，既其PCMV启动子区域的CpG岛被甲基化的细胞。为了确定在获得的肿瘤工程细胞中整合的EGFP基因确实处于沉寂状态，源细胞 (HCT-116细胞和MDA-MB-231细胞)及获得的肿瘤工程细胞(ECRC-1人直结肠癌肿瘤工程细胞和EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞)均被荧光激活细胞分拣术测试其绿色荧光状态。从图如和4b以及图和恥可以看到，不出预料，所有的源细胞，既HCT-116细胞和 MDA-MB-231细胞，均没有绿色荧光信号；同时，两种肿瘤工程细胞ECRC-I及EBTC-I也没有被检测到绿色荧光信号。可见，两种肿瘤工程细胞的EGFP基因启动子pCMV处于被甲基化的状态。为确认包含有pCMV启动子、EGFP基因、SV40启动子以及neor基因的载体是否被成功整合进工程细胞的基因组，我们进行了下述实验，具体步骤为1)CMV启动子的正向引物与反向引物被用于实时定量PCR扩增工程细胞内可能的CMV启动子DNA序列。如检测到该对引物PCR产物，可证明CMV启动子序列在工程细胞基因组内的存在。该对引物为正向CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA，反向 GAAATCCCCGTGAGTCAAACC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 CAATGGGCGTGGATAG。2)EGFP基因的正向引物与反向引物被用于实时定量PCR扩增工程细胞内可能的 EGFP基因DNA序列。如检测到该对引物PCR产物，可证明EGFP序列在工程细胞基因组内的存在。该对引物为正向GTCCGCCCTGAGCAAAGA，反向TCCAGCAGGACCATGTGA。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 CCCAACGAGAAGCG。3)Neor基因的正向引物与反向引物被用于实时定量PCR扩增工程细胞内可能的neor基因DNA序列。如检测到该对引物PCR产物，可证明neor基因序列在工程细胞基因组内的存在。该对引物为正向CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA，反向 GAAATCCCCGTGAGTCAAACC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 TGGCCGCTTTTCT。4)人beta-血球蛋白HBB基因被用作内部参照物，以此来进行定量分析。该对引物为正向 TGAAGGCTCATGGCAAGAAA，反向 GGTGAGCCAAGGCCATCAC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 TGCTCGGTGCCTTT。图3a和3b显示，ECRC-I工程细胞及EBTC-I工程细胞的基因组内均整合有CMV 启动子、EGFP基因及neor基因的DNA序列，且其在工程细胞内的基因拷贝数均为1，证明了 ECRC-I及EBTC-I细胞均为成功构建的符合我们要求的肿瘤工程细胞。实施例3.使用该两种肿瘤工程细胞筛选表观遗传学药物在此处，ECRC-I及EBTC-I肿瘤工程细胞被用于对表观遗传学药物进行测试。如果受测药物具有逆转基因沉寂的效果，可以预见，该药物会重新激活被甲基化抑制的CMV启动子，进而恢复CMV启动子控制的增强型绿色荧光蛋白EGFP在被该药物处理的肿瘤工程细胞中的表达。EGFP蛋白在被激发的条件下会发出绿色荧光。对于受测细胞荧光信号的分析采用的是荧光激活细胞分拣术。该技术特别适用于对于整个细胞群体中单独细胞的荧光信号的分析。在筛选中可以用到的“候选物质”指的是任何小分子或生物物质，如DNA、RNA、 siRNA,shRNA或其他多核苷酸序列(无论是自然存在的核苷酸序列还是人工合成或修饰的核苷酸类似物)，蛋白质或蛋白质片段，抗体，或任何其他的有可能逆转表观遗传学水平基因沉寂的物质。当细胞与候选物质相接触时，该肿瘤工程细胞应该处于活跃的复制状态中。在细胞与候选物质接触前，如果在平面培养皿中，该肿瘤工程细胞应该生长至较为密集；如果在三维培养条件下，该肿瘤工程细胞应该生长为球状细胞团。为了验证本发明所提供的药物筛选模型系统对于检测逆转基因沉寂效果的精确性，以及对检测抑制DNA甲基化转移酶及抑制组蛋白去乙酰基酶的物质的反应，两种已知的药物DAC及SAHA被用于处理肿瘤工程细胞。DAC,以及其类似物AZA，都是DNA甲基化转移酶抑制剂类药物，可以逆转CpG岛的甲基化。DAC和AZA均是胞核嘧啶的类似物，可以代替胞核嘧啶被整合进基因组的DNA中； 一旦整合，便可以阻止DNA甲基化转移酶在基因复制的过程中甲基化CpG位点。其产生的结果称为少甲基化，既甲基化水平降低到较少的水平；于是，原先在过甲基化状态下，处于失活状态的启动子被重新激活，从而恢复过去被沉寂的基因表达。另一方面，组蛋白去乙酰基酶抑制剂SAHA也可以逆转基因沉寂。在实验中，两种肿瘤工程细胞ECRC-I及EBTC-I均被DAC或SAHA分别处理，且其源细胞HCT-116及MDA-MB-231被用作对照。处理的方法为，当肿瘤工程细胞在平面培养皿中应该生长至较为密集的状态时，终浓度为IOOnM的DAC或SAHA被直接加入到培养工程细胞或对照细胞的培养液中。图如和d及图5c和d分别显示ECRC-I人直结肠癌肿瘤工程细胞及EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞在SAHA或DAC分别处理下EGFP荧光的水平。和预料的一致的是，两种作为对照的源细胞HCT-116及MDA-MB-231均没有任何细胞表现出绿色荧光。在没有药物作用的条件下，两种肿瘤工程细胞均没有绿色荧光出现在任何细胞中。在低剂量的(IOOnM)已知可逆转基因沉寂的药物DAC或SAHA处理4天之后，相当比率的两种肿瘤工程细胞均表达了 EGFP蛋白及发射出可以检测到的绿色荧光信号。这一结果显示，在DAC或SAHA存在的条件下，PCMV启动子的甲基化发生了逆转，从而允许EGFP基因的表达；这一结果也显示， 本药物筛选模型对可以产生逆转基因沉寂药物的反应相当敏感。 这一组对ECRC-I及EBTC-I肿瘤工程细胞的药物测试结果，证明了本发明提供的筛选逆转基因沉寂物质的方法与自然发生的基因沉寂逆转现象的完全一致性，证明了该使用肿瘤工程细胞筛选逆转基因沉寂物质的有效性。
权利要求
1.筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞，包含有一个报告基因，该报告基因置于一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下，因此该报告基因处于被沉寂的状态。
2.根据权利要求1所述的肿瘤工程细胞，其特征在于该报告基因为表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的报告基因，该报告基因的启动子为CMV启动子，且该启动子区域内的CpG 岛被甲基化从而该启动子被抑制；该肿瘤工程细胞还包含有一个新霉素抗性基因neor为选择基因，该选择基因的启动子为SV40启动子。
3.根据权利要求2所述的肿瘤工程细胞，其特征在于该肿瘤工程细胞源于HCT-116 人直结肠癌细胞，并经过基因工程改造以达到权利要求2所述特征；该工程细胞被命名为 ECRC-I人直结肠癌工程细胞，保藏号为CCTCC C201044。
4.根据权利要求3所述的肿瘤工程细胞，其特征在于所述基因工程改造为在HCT-116 人直结肠癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体，该载体包含有CpG岛被甲基化的CMV 启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白EGFP报告基因、以及一个SV40启动子及其所控制的新霉素抗性基因neor。
5.根据权利要求2所述的肿瘤工程细胞，其特征在于该肿瘤工程细胞源于 MDA-MB-231人乳腺癌细胞，并经过基因工程改造以达到权利要求2所述特征；该工程细胞被命名为EBTC-I人乳腺癌肿瘤工程细胞，保藏号为CCTCC C201045。
6.根据权利要求5所述的肿瘤工程细胞，其特征在于所述基因工程改造为在 MDA-MB-231人乳腺癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体，该载体包含有CpG岛被甲基化的CMV启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白EGFP报告基因、以及一个SV40启动子及其所控制的新霉素抗性基因neor。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的肿瘤工程细胞在筛选用于逆转表观遗传水平基因沉寂的药物上的应用。
全文摘要
本发明涉及筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞，包含有一个报告基因，该报告基因置于一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下，因此该报告基因处于被沉寂的状态。本发明提供了针对直结肠癌和乳腺癌的两种肿瘤工程细胞，构造该类肿瘤工程细胞的方法，以及使用该类肿瘤工程细胞进行药物筛选的方法。可以提高该类药物的开发效率，降低开发成本。
文档编号C12R1/91GK102234630SQ201010163858
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月4日 优先权日2010年5月4日
发明者司佳丽 申请人:武汉瀚湖细胞有限公司