一种用于监测环境中Hg²⁺污染的重组工程菌及其应用的制作方法

专利名称：一种用于监测环境中Hg²⁺污染的重组工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种含抗汞基因(merR-Pt)启动子和报告基因的重组系统及其构 建方法和用途。
背景技术：
汞是一种具有严重生理毒性的化学物质。由于其具有持久性、易迁移性和高度的 生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一；另一方面，汞及汞盐在工业 中又使用很广。基于上述原因，环境中汞的检测引起人们的极大关注，不断探讨其检测方 法。随着科技的发展与时代的进步，人类生存环境的保护与治理已经越来越多地引起 人们的关注。地球村生物的保护，人类生存环境的可持续发展，对相关环境质量及检测的标 准及方法提出了更高的要求。据最新资料统计，目前水、土壤、大气中汞的含量较多年前已 经提高了 3倍，众所周知，汞污染对人类具有极大的危害。人体无法通过自身的代谢排泄食 物链或其它途径累积的微量汞，微量汞累积将直接导致心脏、肝、甲状腺等疾病，甚至导致 神经系统紊乱及慢性汞中毒。在工业化工程中，国际上相关地区曾出现过严重的大面积汞 中毒事件，并严重影响了当地人民的生命。为此，国际社会对汞的关注程度极高，并提出了 极为严格的控制要求，例如，2003年2月欧盟提出的针对中国高达270亿美元的新电子和电 气设备中确保无汞(Hg)等有害物质，从而要求国内相关企业必须找出应对措施、改进检测 方法、提高检测标准，同时质量检测部门必须要提高其对汞元素的监控能力和手段。环境中重金属介质的毒性依赖于环境中生物可利用的金属离子的浓度。发光型 微生物传感器已被广泛应用于研究检测生物可利用的金属离子。Ralstonia eutropha AE2515已被构建出来，通过将cnrYXH调节基因转录融和到生物发光luxCDABE报告系统来 构造出一个完整的细胞传感器用于检测土壤中生物可利用的Ni2+和Co2+的浓度(Tibazarwa C etal.2001)。还有一些光学传感器的工程细菌中包含mer基因的调控区域(merR)和 luxCDABE的融合片断，这已被发展用于对Hg2+的定量测定。当Hg2+结合到merR上时，mer 启动子即表示出活性，接着引起Iux报告基因的转录，随后发出亮光(Olga Selifonova et al. 1993)。土壤中生物可利用的铜离子也可通过荧光假单胞工程菌测出，方法是通过铜离 子诱导的基因和含有Tn5:: Iux启动子转座子探针来实现(Tom-Petersen et al. 2004)用荧光素酶作为报告基因来检测环境污染物有许多优点，如对样品的要求不高， 对设备和技术的要求不高，检测的时间段，检测的精度和灵敏度也比较高等等。但是由于实验中所用荧光素酶的活性测定需要裂解细胞，不能活体检测，提取酶 的过程相对比较麻烦，且其表达系统在细胞中不能稳定存在，因而不利于方法的推广和利 用。GFP是从多管水母属的Aequorea Victoria中分离出的一种天然荧光蛋白，含有 238个氨基酸残基。Aequoria的GFP在395nm能吸收蓝光，受到Ca2+或紫外线激活时发绿 色荧光，最大发射峰为509nm。GFP的生色团为一个稳定的环状三肽结构，由Ser65、Tyr66
3和Gly67这3个氨基酸残基通过自身环化和氧化形成，生色团之间是通过共价键结合。野 生型GFP的荧光强度较低，细胞质中约1 X IO4个GFP分子发射的荧光才能用普通荧光显微 镜精确测定。通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同激发峰和发射 峰的突变体，使GFP荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。由于GFP基因表达产物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记检测十分 方便简单，被广泛用于科学研究工作中。GFP作为环境微生物的标记基因的优点(1)荧光 特性稳定。只有过热(> 65°C )、过酸(pH < 4)、过碱(pH为12 13)或其他变性剂存在 时GFP的荧光才会消失。(2)检测极为方便。对GFP的检测仅需蓝光和近紫外光激发，不需 要任何外源基质，也不必对细胞进行预处理、固定或染色；用普通荧光显微镜或手提式紫外 灯(365nm)照射即可进行观察，使用激光扫描共聚焦显微镜效果更佳，还可以使用细胞分 选仪检测。能在现场进行在线检测。(3)GFP的表达与受体细胞的种属无关，原核和真核细 胞都能表达，而且对细胞没有毒性，不会扰乱受体细胞的正常功能。(4)能进行单细胞和活 细胞观察，也可进行实时原位观测，不会破坏被观察的细胞及其生长环境。(5) 土著微生物 中不含有GFP，因而检测GFP时一般不会出现假阳性结果。通常将GFP作为分子标记。研究表明，可将GFP基因加以改造，去除其多余、调控 片断，人为添加调控元件，构建应用于环境监测的报告基因表达系统。另外，GFP基因可用 许多载体、以不同方式导入到原核生物细胞内构建报告基因表达系统。如可将GFP基因与 质粒构成重组体后导入，还可通过嗜菌体以转导方式转移到宿主细胞中。转移GFP基因的 载体除常用的质粒外，还有很多转座子载体，如Min-MiuTn系列等。目前尚未见到有关构建稳定重组HierR-Pt启动子和报告基因及它的用途方面的 专利和报道。

发明内容
本发明的目的就是公开一种稳定的含HierR-Pt启动子和报告基因的重组表达系 统，该报告基因的活性测定不需要裂解细胞，能活体检测，且稳定性好操作过程相当方便。本发明的有一目的是公开一种产生上述含merR-Pt启动子和报告基因的重组表 达系统的方法。本发明的再一个目的就是公开一种上述含merR-Pt启动子和报告基因的重组表 达系统的用途。本发明是通过如下技术方案来实现的。以增强型绿色荧光蛋白EGFP为报告基因， 构建含merR-Pt启动子和EGFP报告基因的重组表达系统，且将该系统通过转座整合到菌体 染色体上；筛选稳定转座菌体；通过Ha2+的诱导引起菌体细胞荧光蛋白表达的变化，以荧光 强度的变化来检测环境中Hg2+的污染。本发明所说的用于监测环境中Hg2+污染的重组工程菌是以高耐汞细菌为宿主，在 宿主中导入含merR-Pt的抗汞基因调控区和EGFP基因的重组载体。上述含merR-Pt的抗汞基因调控区和EGFP基因的重组载体是pUT_P_G。所述的高 耐汞细菌是恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)。用上述的重组工程菌检测Hg2+污染的方法，是通过Hg2+的诱导引起菌体细胞荧光 蛋白表达的变化，以荧光强度的变化来检测环境中Hg2+的污染。
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因本发明中采用的报告基因是EGFP，其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类 型的限制，活性测定不需要裂解细胞，能进行活体检测，对细胞无毒害，无需底物或共反应 因子。且本发明中携带有merR-Pt启动子和EGFP报告基因的BM菌株具有不具抗生素抗性， 使得该系统用来检测Hg2+污染时具有检测方便，结果可靠，适用范围广，不对生态环境造成 二次污染的特点。


图1是发光报告基因系统的构建过程2是pUT-P-G结构示意3不同种类和浓度的重金属离子诱导MB菌株荧光表达的强度曲线
具体实施例方式下面结合附图，对本发明作进一步描述。本发明的具体步骤为构建含merR-Pt启动子和EGFP报告基因的重组系统；将该 系统通过Tn5转座系统整合到高耐汞的细菌染色体中。通过Hg2+的诱导使得绿色荧光蛋白 表达，根据荧光强度的变化来检测环境中Hg2+污染。所说的高耐汞的细菌是指恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)。一、实验材料1、质粒pEGFP-Nl、pGEX4T-l、pUT-Km (质粒均购自南京尊微生物技术有限公司)2、菌株大肠杆菌DH5 α、恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida菌种编号1. 1003)、 大肠杆菌SMlO (λ pair)3、LB培养基配方胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂15 20 克，水1000毫升，pH7. 24、生化试剂l)Xho I、Not I、EcoRI、BamHI、T4DNA连接酶等工具酶和DNA回收试剂盒购自 TAKARA公司2)PCR引物由南京金斯特生物工程公司合成。二、方法步骤1、重组merR-Pt启动子和EGFP报告基因系统的构建(I)EGFP基因的扩增、酶切及纯化用pEGFP-Nl质粒转化常规制备的大肠杆菌DH5 σ感受态细胞，进行大量扩增；碱 裂解法大量抽质粒，电泳检测质粒纯度和含量；根据质粒序列，设计引物引物egfp-XhoI为上游端引物，其中包含10个EGFP基因端互补的碱基，一 个XhoI识别位点，3个保护碱基；引物egfp-BamHI为下游3、端引物，其中包含10个与EGFP基因;T端互补的碱基， 一个BamHI识别位点，3个保护碱基；egfp-XhoI :5，-CCGCTCGAGATGGTGAGCA-3，egfp-BamHI :5，-CGCGGATCCTTACTTGTAC-3，以pEGFP-Nl质粒为模版，利用Ex Taq进行PCR扩增；反应条件为95 V预变性 5min，95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s，反应 30 个循环，72°C延伸 5min。反应结束后，取 25 μ 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收EGFP基因片段。将回收的产 物，用XhoI和BamHI双酶切。(2)merR-Pt启动子的扩增、酶切及纯化根据恶臭假单胞菌TOl9ctg69 (Pseudomonas Putida W619 ctg69)抗汞基因(基 因登录号为AAVY01000006)调控区设计引物mer-XhoI :5’ -CCGCTCGAGCGTTTTTGGTTCAGACATG-3’mer-EcoRI :5’ -CCGGAATTCCTAAGGCATAGCCGAACCT-3’引物mer-XhoI为上游5、端引物，其中包含19个EGFP基因5、端互补的碱基，一 个XhoI识别位点，3个保护碱基；引物mer-EcoRI为下游3、端引物，其中包含19个与EGFP基因3、端互补的碱基， 一个EcoRI识别位点，3个保护碱基；以受到Hg2+污染的土壤样品为模版，利用Ex Taq进行PCR扩增；反应条件为95°C 预变性5min，95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s，反应30个循环，72°C延伸5min。反应结束后， 取25 μ 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收merR-Pt启动子片段。 将回收的产物，用XhoI和EcoRI双酶切。(3)pGEX4T-l 质粒的制备用pGEX4T-l质粒转化常规制备的大肠杆菌DH5 σ感受态细胞，进行大量扩增；碱 裂解法大量抽质粒，电泳检测质粒纯度和含量；用EcoRI和BamHI对提取的pGEX4T_l质粒 进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段酶切产物。(4)连接反应将酶切的egfp片段、merR-Pt启动子片段和pGEX4T_l片段在离心管中用T4连接 酶进行连接反应，0°c连接12h(5)筛选重组子连接液转化DH5 α感受态细胞，从转化子平板上随机挑取若干个菌落，扩增培养 后用碱裂解法少量提取质粒进行酶切、测序鉴定即得到merR-Pt启动子和报告基因系统 PGEX4T-P-G(图 1)2、可稳定携带merR-Pt启动子和报告基因系统的无抗生素抗性的MB细菌的建立(1)携带merR-Pt启动子和报告基因系统的pUT_P_G质粒的构建将含有PGEX4T-P-G质粒的大肠杆菌接种LB培养基37°C过夜培养，进行大量扩增； 碱裂解法大量抽质粒，电泳检测质粒纯度和含量；根据质粒序列，设计以下引物merR-Notl :5，-GTCAGTCACGAT-3，pUT BamHI :5，-CGCGGATCCGGCCTAGG-3，pUT NotI :5，-TCATTAAACGCG-3，以 pGEX4T-P-G 为模版，merR-Notl 和 egfp-BamHI 为引物，利用 Ex Taq进行PCR扩 增；反应条件为95°C预变性5min，95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s，反应30个循环，72°C延 伸5min。反应结束后，取25 μ 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收 merR-Pt启动子和报告基因系统片段。将回收的产物，用BamHI和NotI酶切后用琼脂糖凝 胶电泳，凝胶回收试剂盒回收1. 2Kb片段。同样方法，以pUT-Km为模版，pUT BamHI和pUT NotI为引物；扩增后得到的产物
6用BamHI和NotI酶切后用琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收5. 3Kb片段。将merR-Pt启动子和报告基因系统酶切片段、pUT_Km质粒酶切后的5. 3Kb片段在 离心管中用T4连接酶进行连接反应，0°C连接12h得到携带merR-Pt启动子和报告基因系 统的 PUT-P-G 质粒(图 1)。将 pUT-P-G 质粒转化 E. coli SMlO ( λ pir)获得 SMlO (pUT-P-G)(2)双亲本滤膜结合转座在含有相应抗生素的LB培养基中过夜培养的受体菌Pseudomonas Putida (购自 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号1. 1003)和SMlO (pUT-P-G)。分 别取每一种培养物各ι μ L,离心后用灭菌的lOmmol/L MgSO4等体积重悬.各取100 μ L菌 液混勻，滴于LB平板上的0. 45 μ m的滤膜中央，放置0. 5 Ih.待液体基本渗干，将平板置 于28°C培养8 12h 将滤膜上生长的细胞用灭菌的5mL 10mmol/L MgSO4洗下后用于筛选 稳定性提高的突变体。(3)筛选重组子将转座接合实验中滤膜上生长的细胞用灭菌的lOmmol/L MgSO4洗下后，转接于LB 平板上。从转化子平板上随机挑取若干个菌落，分别点种于LB和氨苄抗性LB培养基。再 挑选氨苄平板上不长，LB平板上生长的菌落进行进一步检测。挑选菌落扩增培养后用碱裂 解法少量提取质粒用merR-Notl和egfp-BamHI作为引物进行PCR扩增、测序鉴定即得到稳 定携带merR-Pt启动子和报告基因系统的无抗生素抗性的MB菌株。3、运用MB菌株检测Hg2+接MB细菌单菌落于5mL LB培养液中，过夜培养，再按1 %接种量转接于新鲜的LB 培养液中。待菌体生长至对数生长期，加入10000PPM的HgCl2溶液，使得Hg2+浓度分别为 5、10、15、20、25nmOl/mL。12h后在荧光分光光度计下测定荧光强度。得到的数据用于建立 绿色荧光表达强度与不同浓度Hg2+的关系曲线。4、不同重金属离子对MB菌株的诱导检测将菌株MB菌株培养至对数期，分别接种至含Cu2+、Fe3+、Mn4+、Sn2+、Zn2+、Co2+、Ag+、 Ba2+和Hg2+LB培养基，培养12h后。在可见光和短波蓝光下，只有生长在含Hg2+LB培养基上 的菌落可发出荧光。 综上各步实验结果显示MB菌株可在有Hg2+存在条件下表达绿色荧光蛋白。菌体 在可见光下呈黄绿色；在短波蓝光下菌体呈亮绿色。其他重金属离子对MB菌株无诱导表达 效果。菌体发光量在一定范围内(< 30nM/mL)随汞离子浓度增大而呈一定关系递增(图 3)。在此范围内，菌体能灵敏、准确地通过荧光的强度反映汞离子的浓度。说明利用本发明 的重组菌可以对汞离子实施定性定量检测。在上述实施例中涉及的菌种和质粒来源如表1。表1.菌种和质粒
7 Apr 氨苄青霉素抗性，Cmr 氯霉素抗性，Kmr 卡那霉素抗性CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心NJZff Corp.南京尊微生物技术有限公司。
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权利要求
一种用于监测环境中Hg2+污染的重组工程菌，其特征在于，是以高耐汞细菌为宿主，在宿主中导入含merR Pt的抗汞基因调控区和EGFP基因的重组载体。
2.如权利要求1所说的用于监测环境中Hg2+污染的重组工程菌，其特征在于，所述的 含merR-Pt的抗汞基因调控区和EGFP基因的重组载体是pUT_P_G。
3.一种按权利要求1所述的用于监测环境中Hg2+污染的重组工程菌，其特征在于所述 的高耐汞细菌是恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)。
4.一种用权利要求1所述的重组工程菌检测Hg2+污染的方法，其特征在于，是通过Hg2+ 的诱导引起菌体细胞荧光蛋白表达的变化，以荧光强度的变化来检测环境中Hg2+的污染。
全文摘要
本发明属于监测环境中有毒物质的微生物发光报告基因系统的发明以及利用该系统监测有毒环境和其它残留物质的用途发明。所说的用于监测环境中Hg2+污染的重组工程菌是以高耐汞细菌为宿主，在宿主中导入含merR-Pt的抗汞基因调控区和EGFP基因而构建的重组载体。具体是pUT-P-G该菌株可专一且高灵敏监测土壤、河流、湖泊、地下水、市政污水处理系统中毒性最强的重金属Hg2+污染。与已有技术相比，本发明的菌株专一性和适应性强，便于增殖使用方便，监测灵敏度高，可实现高通量在线监测。
文档编号C12N1/21GK101921724SQ20101016609
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者何伟, 钟文辉 申请人:南京师范大学