一种来源于矛头蝮蛇毒x因子激活物的制备方法

文档序号:408108阅读:247来源:国知局
专利名称:一种来源于矛头蝮蛇毒x因子激活物的制备方法
技术领域
本发明涉及酶及其提取方法,特别是提供了一种来源于矛头蝮蛇毒X因子激活物的提取方法。
背景技术
X因子激活酶是凝血作用最强的一个组分,凝血因子X(FX)是一种血浆糖蛋白,在凝血过程中起着重要的作用,它的活化形式ha,可以在凝血因子V、Caz+、磷脂的辅助作用下把凝血酶原活化为凝血酶。FX激活酶主要分布在圆斑蛙蛇(Rusesilviper)蛇毒中,在蛙蛇亚科和蝮蛇亚科及一些眼镜蛇的蛇毒中也有发现。中国蛙蛇蛇毒中FX激活酶(CRVV)是从圆斑蝗蛇 (Russelv币er)蛇毒中提取的X因子活化酶,能特异性激活凝血因子X而使血浆凝固,与外国同类产品Mypven reagent类同。FX激活酶能特异地激活血液中的凝血因子X(FX),促进血液凝固,在临床诊断,新药物的开发以及蛋白结构和功能的科学研究等众多领域都有巨大应用价值。

发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活酶。本发明为解决上述技术问题,采取以下技术方案一种X因子激活酶,是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行DEAE-kpharose fast flow离子交换层析、透析、纤维素DEAE-52离子交换层析和kphadex-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的蛋白。本发明所述来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活酶具有以下特点由金属蛋白酶(钙离子依赖性磷脂非依赖性)和丝氨酸蛋白酶(钙离子非依赖性)两大类组成。本发明所述X因子激活酶提取方法,包括以下步骤(1)、将矛头蝮蛇蛇毒溶于pH7-8、0. 05mol/L的1Tris-HCl缓冲液中,得到浓度为 100-120g/L的矛头蝮蛇蛇毒液;O)、对步骤⑴获得的矛头蝮蛇蛇毒液进行离子交换层析,固相填充物为 DEAE-Sepharose fast flow,洗脱液为含 0-0· 2mol/L NaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱;(3)、收集洗脱液,在^Onm的波长下对洗脱液进行紫外分光广度检测,得到吸收图谱,将各峰进行SDS-PAGE凝胶电泳,收集含有X因子激活酶的部分;(4)、浓缩除盐,用pH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl ;(5)、再次离子交换层析,步骤4)的浓缩液进行离子交换层析,固相填充物为纤维素 DEAE-52 ;洗脱液为含 0-0. 5mol/LNaCl 的 pH6. 2,0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液直线梯度洗脱;(6)、将步骤(5)获得的洗脱液各峰进行SDS-PAGE凝胶电泳,收集含有X因子激活酶的部分;
(7)、再次浓缩除盐,用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除 NaCl ;(8)、将步骤(7)浓缩液进行凝胶过滤层析,固相填充物为kphadeX-G75,洗脱液为pH7. 5、0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液,收集洗脱液,从中收集含有X因子激活酶部分,得到矛头蝮蛇X因子激活酶原液。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤(1)中为获得更好的实施效果,可先用离心的方法去除矛头蝮蛇蛇毒液中的杂质,离心条件可根据实际情况进行选择,如在 4500rpm 下离心 15min。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤O)中的DEAE-kpharosefast flow 离子交换层析柱在使用前,先用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为3. Oml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的 pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;所述步骤2) 中的Tris-HCl缓冲液优选为ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液·。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤C3)中的收集方法可为依据^Onm下紫外分光广度检测图谱手动收集;具有X因子激活酶部分的检测方法为=SDS-PAGE电泳。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤⑷浓缩除盐可选用截止值10000分子量膜切向流超滤,通过用pH6.2、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩,再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤(5)中纤维素DEAE-52层析柱在使用前,先用PH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为3. Oml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后PH6. 2、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min。本发明所述X因子激活酶提取方法中,步骤(8)中kphadeX-G75层析柱使用前, 先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3. Oml/min,层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱,流速为3. Oml/ min,用与步骤C3)相同的方法收集洗脱液中含有X因子激活酶的部分。本发明提供了一种从矛头蝮蛇毒液中提取到的X因子激活酶。所述X因子激活酶具有以下特点(1)由金属蛋白酶(钙离子依赖性磷脂非依赖性)和丝氨酸蛋白酶(钙离子非依赖性)两大类组成;( 该酶的提取方法以常规的层析技术为主,通过变换层析条件和调节技术参数实现精确分离的目的,且可以在常温下进行操作,并具有条件简单容易放大,成本低(选择的层析胶可以反复利用),收率高和产品纯度高的优点。基于上述特点,可以本发明的X因子激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物,将在生物制药领域发挥重要作用,应用前景广阔。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1本实施例所述X因子激活酶的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号 080709),用IOOml预冷的pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液于4_8°C的层析柜中搅拌溶解30min,4500rpm离心15min,取上清液。层析前先将DEAE-S^)harose fast flow层析柱用pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为3ml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后用PH7、0. 05mol/L 的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;依据^Onm下紫外分光广度检测图谱手动收集,经电泳分析具有X因子激活酶部分,合并洗脱液,共得23^11,用截止值10000分子量膜切向流超滤,通过用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩,再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度,浓缩样品40ml ;上样至纤维素DEAE-52层析柱,先用PH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为3. Oml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后PH6. 2、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;再次用pH7. 5,0. Olmol/L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐,然后上样kphadeX-G75层析柱,先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡 5-6小时,流速为3. Oml/min,层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱,流速为3. Oml/min。收集样品45ml,收获蛋白3%ig,HPLC分析纯度为 97. 5%,SDS-PAGE 为一条带。实施例2本实施例所述X因子激活酶的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号 080709),用IOOrnl预冷的ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液于4-8°C的层析柜中搅拌溶解30min,4500rpm离心15min,取上清液。层析前先将DEAE-S^harose fast flow层析柱用ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3ml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后用PH7. 5、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 ρΗ7· 5、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;依据^Onm下紫外分光广度检测图谱手动收集,经电泳分析具有X因子激活酶部分,合并洗脱液,共得^5ml,用截止值10000分子量膜切向流超滤,通过用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐,浓缩样品40ml ;上样至纤维素DEAE-52层析柱,先用pH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为 3. Oml/min;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后ρΗ6· 2、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 5mol/LNaCl的ρΗ6· 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐,然后上样kphadex-G75层析柱,先用pH7. 5,0. 01mol/L的 Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3. Oml/min,层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱,流速为3. Oml/min。收集样品58ml,收获蛋白36. 2mg, HPLC分析纯度为98. 3%, SDS-PAGE为一条带。实施例3
本实施例所述X因子激活酶的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号 080709),用IOOml预冷的ρΗ8· 0、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液于4-8°C的层析柜中搅拌溶解30min,4500rpm离心15min,取上清液。层析前先将DEAE-S^harose fast flow层析柱用ρΗ8· 0、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3ml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后用PH8. 0、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 ρΗ8· 0、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;依据^Onm下紫外分光广度检测图谱手动收集,经电泳分析具有X因子激活酶部分,合并洗脱液,共得Maul,用截止值10000分子量膜切向流超滤,通过用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐,浓缩样品40ml ;上样至纤维素DEAE-52层析柱,先用pH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为 3. Oml/min;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后pH-6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 5mol/LNaCl的pH6. 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min ;再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐,然后上样kphadex-G75层析柱,先用pH7. 5,0. Olmol/L的 Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3. Oml/min,层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱,流速为3. Oml/min。收集样品39ml,收获蛋白33. 4mg, HPLC分析纯度为97. 9%,SDS-PAGE为一条带。
权利要求
1.一种来源于矛头蝮蛇毒X因子激活物的制备方法,其特征在于所述矛头蝮蛇毒凝血X因子激活酶,是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行DEAE-kpharose fast flow离子交换层析、 透析、纤维素DEAE-52离子交换层析和kphadex-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血X 因子激活酶活性的蛋白;所述第一次DEAE-kpharose fast flow离子交换层析用pH7_8、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液进行直线梯度洗脱;所述纤维素DEAE-52离子交换层析用pH6. 2,0. 05mol/L的 Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 5mol/LNaCl的pH6. 2,0. 05mol/L的iTris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱;所述kphadex-G75凝胶过滤层析用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱。
2.按照权利要求1所述来源于矛头蝮蛇毒X因子激活物的制备方法,其特征在于所述矛头蝮蛇毒凝血X因子激活酶可分为金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶两大类,金属蛋白酶是由两条轻链和一条重链经链间二硫键形成的糖蛋白,其活性是钙离子依赖性磷脂非依赖性的;激活FX的丝氨酸蛋白酶分子量较小,其活性为钙离子非依赖性。
3.按照权利要求1所述来源于矛头蝮蛇毒X因子激活物的制备方法,其特征在于所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法包括以下步骤(1)蛇毒预处理;(2)将预处理的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE-kpharosefast flow离子交换层析,用 pH7-8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱;(3)收集洗脱液,在^Onm的波长下对洗脱液进行紫外分光广度检测,得到吸收图谱, 将各峰进行SDS-PAGE凝胶电泳,收集含有X因子激活酶的部分;(4)将上述洗脱液进行超滤浓缩去除NaCl;(5)再次离子交换层析,步骤的浓缩液进行离子交换层析,固相填充物为纤维素 DEAE-52 用 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱;(6)将步骤( 获得的洗脱液各峰进行SDS-PAGE凝胶电泳,收集含有X因子激活酶的部分;(7)超滤浓缩去除NaCl;(8)将步骤(7)浓缩液进行凝胶过滤层析,固相填充物为kphadex-G75,洗脱液为 pH7. 5、0. 01mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液。
4.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤(1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的pH7-8、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解; 步骤(1)还包括用离心的方法去除矛头蝮蛇蛇毒液中的杂质的步骤。
5.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤(2)中DEAE-Sepharosefast flow离子交换层析柱在使用前,先用pH7_8、0. 05mol/L的 Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时,流速为3. 0ml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/ min0
6.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤(3)中的收集方法为依据^Onm下紫外分光广度检测图谱手动收集;具有X因子激活酶部分的检测方法为=SDS-PAGE凝胶电泳。
7.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征于所述步骤(4) 中的浓缩方法为用PH6. 2、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl。
8.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤 (5)中纤维素DEAE-52层析柱在使用前,先用ρΗ6· 2、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡 5-6小时,流速为3. Oml/min ;层析时,待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液,然后进行直线梯度洗脱,流速为3. Oml/min,用与步骤(3)相同的方法收集洗脱液中含有X因子激活酶的部分。
9.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤(7)中的浓缩方法为用pH7.5、0. Olmol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl。
10.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒X因子激活酶的制备方法,其特征在于所述步骤(8)中kphadex-G75层析柱使用前,先用pH7.5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时,流速为3. Oml/min,层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱,流速为3. Oml/min,用与步骤(3)相同的方法收集洗脱液中含有X因子激活酶的部分。
全文摘要
一种来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活物及其提取方法,该激活物是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析、透析、纤维素DEAE-52离子交换层析和Sephadex-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的蛋白;以本发明的凝血X因子激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物,将在生物制药领域发挥重要作用,应用前景广阔。
文档编号C12N9/64GK102242102SQ201010166689
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者刘鹏辉, 孙东, 崔亮亮, 张宏杰, 曹丽丽, 王宏英, 薛百忠, 薛雁 申请人:辽宁诺康医药有限公司
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