专利名称：一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，特别提供了一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取具有止血功能的类凝血酶的方法。
背景技术：
我国的蛇毒资源十分丰富，在全世界已知的10科2200多种蛇中，我国就有7科 175种之多。我国也是蛇毒用于医疗最早的国家，但随着国外发达国家的生物技术的迅猛发展，加之对天然物质的重视，其对蛇毒有效成分的研究已相当深入。1936年，Klobusitzi 和Koning首次从美洲矛头蝮蛇(B. jararaca)毒液中获得部分纯化的类凝血酶。1967年， hnoff等从马来西亚红口蝮蛇(A. rhodostoma)中分离得到蛇毒类凝血酶，并应用于治疗血管闭塞性疾病，高粘滞性疾病以及预防术后血栓再发等，取得了令人鼓舞的结果。多年来，我国因技术原因一直使用多组分混合成分的蛇毒制剂，多数成分的药理性质并不清楚， 虽在临床上取得了一定的疗效，但存在着较严重的副作用。主要原因为类凝血酶是采用层析法从蛇毒中纯化得到的，纯度难以控制，从而增加了毒副作用。白眉蝮蛇[Agkistrodon halys (pallas)]产于中国的长白山，资源丰富，开发价值
很1 。现有的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的分离纯化一般均采用阴离子交换层析和分子筛层析方法进行。采用这种工艺方法，生产周期长、收率底、纯度较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取具有止血作用的类凝血酶的方法，取得比活力较高的单一成分产品类凝血酶，使类凝血酶的生产实现规模化。本发明所述的从白眉蝮蛇蛇毒中提取单一成分产品类凝血酶的方法，包括以下步骤(1)白眉蝮蛇蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液；(2)蛇毒上清液经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析，上样结束后，用 pH6. O的PBS缓冲溶液I进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH6. O 含0. 2M NaCL的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；(3)类凝血酶粗提液用pH8. O的PBS缓冲溶液III透析；(4)透析后样品经 M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose 亲和层析，上样结束后，用pH8. O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一组分的类凝血酶；上述提取分离的全过程均在常温下进行操作。本发明所述步骤(1)中的缓冲溶液是pH6. O的PBS缓冲溶液I。
本发明所述步骤O)中SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱所选择的流速为 3. OmL/min。本发明所述步骤( 中类凝血酶粗提液需用pH8. O的PBS缓冲溶液III透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH8. O。本发明所述步骤(4)中用梯度混合仪进行梯度洗脱，梯度混合仪的前槽为50mm的 NaH2PO4溶液IV，梯度混合仪的后槽为pH8. O的PBS缓冲溶液III，15个柱体积，梯度洗脱。本发明所述步骤(4)中M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose亲和层析柱所选择的流速为1. 5mL/min。本发明的方法是以SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和 M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose亲和层析进行单一成份的类凝血酶的纯化提取方法。本发明可以在常温下进行操作，并具有工艺稳定、适合规模化生产、操作简单、生产周期短、产品纯度高等特点。
图1 白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶生产工艺流程图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1从白眉蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取白眉毒蛇蛇毒干粉(批号070704) 30g，溶于200ml ρΗ6· O的PBS缓冲溶液 I中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；(2)、SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ6· O 的 PBS 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH6. O含0. 2M NaCL的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪^Onm检测， 收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；(4)、类凝血酶粗提液需用pH8. O的PBS缓冲溶液III透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH8. O ；(5)、M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose 亲禾口层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O的PBS缓冲溶液III至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速为1. 5ml/min, 上样结束后，用pH8. O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行15个柱体积的梯度洗脱，梯度混合仪的前槽为50mm的NaH2PO4 溶液IV，梯度混合仪的后槽为pH8. O的PBS缓冲溶液III，紫外检测仪280nm检测，收集挂柱峰，得到单一组分的类凝血酶。检测纯度为95. 9%，比活力为2610U/mg蛋白。实施例2从白眉蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取白眉毒蛇蛇毒干粉(批号090907) 30g，溶于150ml pH6. O的PBS缓冲溶液 I中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
(2)、SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ6· O 的 PBS 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH6. O含0. 2M NaCL的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪^Onm检测， 收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；(4)、类凝血酶粗提液需用pH8. O的PBS缓冲溶液III透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH8. 0 ；(5)、M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose 亲禾口层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O的PBS缓冲溶液III至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速1. 5ml/min,上样结束后，用pH8. O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行15个柱体积的梯度洗脱，梯度混合仪的前槽为50mm的NaH2PO4溶液IV，梯度混合仪的后槽为pH8. O的PBS缓冲溶液III，紫外检测仪280nm检测，收集挂柱峰， 得到单一组分的类凝血酶。检测纯度为95. 5%，比活力为2570U/mg蛋白。实施例3从白眉蝮蛇蛇毒中提取类凝血酶的步骤为(1)、取白眉毒蛇蛇毒干粉(批号100331) 30g，溶于200ml ρΗ6· O的PBS缓冲溶液 I中，于4°C冰箱中浸泡溶解，过夜，4500转/分离心15分钟，去除沉淀，收集蛇毒上清液；(2)、SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱(2. 6cmX 30cm)用 ρΗ6· O 的 PBS 缓冲溶液至少平衡5个柱体积，将上述上清液上柱，控制流速3. Oml/min,上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；(3)、用pH6. O含0. 2M NaCL的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪^Onm检测， 收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；(4)、类凝血酶粗提液需用pH8. 0的PBS缓冲溶液III透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近PH8. 0 ；(5)、M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose 亲禾口层析柱(1. 6cmX 30cm)，用 pH8. O的PBS缓冲溶液III至少平衡5个柱体积，将上述透析液上柱，控制流速1. 5ml/min,上样结束后，用pH8. O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行15个柱体积的梯度洗脱，梯度混合仪的前槽为50mm的NaH2PO4溶液IV，梯度混合仪的后槽为pH8. O的PBS缓冲溶液III，紫外检测仪280nm检测，收集挂柱峰， 得到单一组分的类凝血酶。检测纯度为95. 9%，比活力为^30U/mg蛋白。
权利要求
1.一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于在常温下，从白眉蝮蛇蛇毒中提取单一成份类凝血酶的步骤为(1)白眉蝮蛇蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得到蛇毒上清液；(2)蛇毒上清液经SPSepharose Fast Flow阳离子交换层析，上样结束后，用pH6. O的 PBS缓冲溶液I进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用pH6. O含0. 2M NaCL的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；(3)类凝血酶粗提液用pH8.0的PBS缓冲溶液III透析；(4)透析后的样品经M-AminothenyltrotionicAcid-Agarose亲和层析，上样结束后， 用pH8. O的PBS缓冲溶液111进行洗脱，紫外检测仪^Onm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行梯度洗脱，紫外检测仪^Onm检测，收集挂柱峰，得到单一组分的类凝血酶；
2.按照权利要求1所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于所述步骤(1) 中的缓冲溶液是PH6. O的PBS缓冲溶液I。
3.按照权利要求1所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于所述步骤(2) 中SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱所选择的流速为3. OmL/min。
4.按照权利要求1所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于所述步骤(3) 中类凝血酶粗提液需用PH8. O的PBS缓冲溶液III透析至少三次，使类凝血酶粗提液接近 ρΗ8· O。
5.按照权利要求1所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于所述步骤(4) 中采用梯度混合仪进行梯度洗脱，梯度混合仪的前槽为50mm的NaH2PO4溶液IV，梯度混合仪的后槽为PH8. O的PBS缓冲溶液III，15个柱体积，梯度洗脱。
6.按照权利要求1所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的提取方法，其特征在于所述步骤(4) 中 M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose 亲和层析柱所选择的流速为 1. 5mL/min。
全文摘要
一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取具有止血作用的类凝血酶的方法，其具体步骤包括如下蛇毒经浸泡溶解、离心；上清液经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析；含有效成分的洗脱液经透析；透析样品再经M-Aminothenyltrotionic Acid-Agarose亲和层析，即可得到单一成分的类凝血酶。本方法可以在常温下进行操作，并具有工艺稳定、适合规模化生产、操作简单、生产周期短、产品纯度高等特点。
文档编号C12N9/64GK102242104SQ20101016671
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者张妍, 李小军, 温丽丽, 王宏英, 王寒, 薛百忠, 薛雁 申请人:辽宁诺康医药有限公司