专利名称：：诱导培养基及用其培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法
技术领域：
：本发明涉及一种诱导培养基及利用该诱导培养基游离培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法。
背景技术：
：在番茄育种中，利用单倍体培养技术具有极大的优势和潜力1.加快育种材料的纯合速度，加速育种进程。用常规育种手段进行育种材料的纯化，需要经过68代的自交，才可育出稳定的株系，同时还存在植株表现型和基因型不一致的问题。利用花药或小孢子培养获得单倍体(haploid)，经染色体加倍后得到纯合双倍体(doublehaploid,DH)，从而能够较快地从杂种中(包括异种间杂种)分离出大量纯合、稳定的自交系。这样的自交系植株的基因型和表现型完全一致，极大提高了选择效率，因此育种年限大大缩短。2.单倍体培养可加速远缘杂种的稳定。远缘杂种后代会发生强烈的性状分离，还经常出现大量的非整倍体杂种，通过自交或天然杂交难以保存其遗传特性。将杂种一代的番茄花药、小孢子进行离体培养，再对单倍体植株进行染色体人工加倍，可克服性状分离，迅速获得稳定的新类型。3.DH群体有利于遗传图谱的构建、基因定位及依图谱法克隆基因。将杂种一代的番茄花药、小孢子进行离体培养，再进行染色体人工加倍就能获得DH群体，一些在杂种中不能表现的隐性性状会在双单倍体(DH)中表现，DH群体的不同株系间存在基因型差异，但株系内的基因型相同，自交不分离，通过自交繁殖后代，各个株系的遗传组成不会改变，并能在很大程度上消除环境因素的影响，这不仅有利于番茄遗传图谱的构建和质量基因的定位，更为重要的是可以进行数量性状位点QTL的精确定位和克隆。番茄的产量、品质、抗逆性等重要农艺性状均为数量性状，表现型与基因型之间的关系不明确，易受外界条件的干扰，依据表现型进行选择常常不能真实地反映基因型，利用DH群体就能克服利用普通群体进行QTL研究所存在的缺点，获得与QTL紧密连锁的分子标记，使番茄育种水平得以提高。4.单倍体培养与诱变育种结合可提高诱变育种的效果。在诱变育种中，由于基因突变的几率很低，特别是当发生隐性基因突变时，突变性状在植株上不能直接表现出来，这就需要种植大量的植株。以单倍体植株作诱变材料，突变隐性基因就可表现出来，获得突变体的速度可大大加速，育种年限得以缩短。基于以上优势，番茄的单倍体培养受到极大的重视，早期研究多集中在番茄花药培养方面。1971年，Sharp首先对栽培番茄的花药进行培养，得到了的愈伤组织。1978年，Cappadocia等培养番茄(L.peruvianum)的杂种番茄花药从中观察到球状胚。20世纪80年代初，Krueget-Lebus等培养番茄品种Nadja和Piccolo的小孢子，得到了球形胚。Khoang等(1986)报道从番茄品种Roma的花药中再生出单倍体植株，同时还得到二倍体和混倍体植株。Evans和Morrison(1989)也报道利用番茄花药培养产生了单倍体植株。我国随后也进行了此方面的研究。高秀云、王纪方等(1979、1980)进行番茄番茄花药培养，发现有单倍体植株。袁亦楠(1999)以栽培番茄和野生番茄为材料，培养小孢子至球状胚和类心形胚阶段。与番茄花药培养相比，小孢子已经是单倍体细胞，诱导小孢子后经过愈伤组织或胚状体所发育成的小植株都是单倍体，这可以消除花药培养时因花药壁、花丝、药隔等体细胞组织干扰而出现的混倍现象，对材料的固定和纯化效率更高，因此，是当前番茄育种技术研究的一个热点。培养番茄小孢子形成愈伤组织是关键技术环节。目前还没有一套通用的番茄小孢子获得愈伤组织的培养程序，本发明综合小孢子发育所处时期、供体植株基因型、预处理方法、特别是基本培养基与植物生长调节剂和添加物组成配比等多方面因素提出一种培养番茄小孢子形成愈伤组织的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种诱导培养基及利用该诱导培养基游离培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法。为实现上述目的，本发明首先提供了一种诱导培养基，该诱导培养基包含有基本培养基、碳源、附加物和植物生长调节剂，所述基本培养基为MS、PM或HN；所述植物生长调节剂为NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.IA6-BA0.Olmg.I71或NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71；所述碳源为0.3%蔗糖和/或0.3%麦芽糖；所述附加物为500mg.L—1谷氨酰胺和/或3mg.I^AgNCV本发明还提供了上述诱导培养基的优选技术方案所述基本培养基为MS，植物生长调节剂为NAAO.lmg.L^+B-BAO.2mg.L—1、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71或NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71，附加物为500mg.I71谷氨酰胺+3mg.I^AgNOy碳源为0.3%蔗糖。所述基本培养基为HN，附加物为500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'Agm,,碳源为0.3%蔗糖，植物生长调节剂为NAAO.Olmg.L^+G-BAO.lmg.L—1；或者基本培养基为PM，附加物为500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'kgm,,碳源为0.3%麦芽糖，植物生长调节剂为6-BAO.Olmg.L-1。本发明还进一步提供了利用上述诱导培养基培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法，该方法包括以下步骤(1)番茄单核靠边期花蕾的消毒；(2)番茄小孢子的游离；(3)番茄小孢子的预处理；(4)番茄小孢子的培养，于上述诱导培养基上进行培养，直到获得愈伤组织。本发明还提供了上述利用诱导培养基培养番茄小孢子获得愈伤组织方法的优选技术方案步骤(1)中，获得所述番茄单核靠边期花蕾的方法为植株现蕾开始，从植株上采取花蕾，醋酸洋红染色压片镜检，得到番茄单核靠边期花蕾。步骤(1)中，所述消毒的方法为先用流水冲洗番茄单核靠边期花蕾1020min，再用70%酒精消毒2040s和5%次氯酸钠消毒1520min，最后用无菌水冲洗。步骤(2)中，所述游离的方法为番茄单核靠边期花蕾放于无菌试管中，然后加入0.3mol/L甘露醇溶液6-8mL，碾碎，所得悬浮液过300目的细胞筛，6001200rpm离心25min，去掉上清液，重复24次。最后，倒掉上清液，加入权利要求13任一项所述的诱导培养基悬浮番茄小孢子，并稀释所得番茄小孢子到浓度为1.52X105个/mL。步骤(3)中，所述番茄小孢子的预处理是将步骤(2)所得番茄小孢子分装在培养皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下静置13天后，再于3040°C下静置13天。步骤(4)中，所述番茄小孢子的培养是指于2430°C下，在权利要求13任一项所述的诱导培养基中进行暗培养，直到有愈伤组织出现，再转到2430°C下光照1418h进行光培养。所述暗培养的培养温度为27°C，有愈伤组织出现时，再转到27°C下光照16h进行光培养。本发明综合考虑了影响番茄小孢子培养的多方面因素，包括供体植株基因型、小孢子发育所处时期、基本培养基种类、碳源种类、植物生长调剂种类组合及浓度配比，预处理方法等。通过尝试多种基础培养基及植物生长调节剂等的组合，得到了适宜小孢子生长的培养基配方，并利用高、低温交替处理进行预培养的方法提高了出愈率，并通过液体游离培养小孢子进一步提高了出愈率，为后续研究工作的顺利开展奠定了坚实的基础。图1处于单核靠边期的番茄小孢子。图2番茄小孢子悬浮培养形成的愈伤组织。具体实施例方式下面用具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。诱导培养基的配制1)基本培养基①MS；②PM；③HN。2)碳源①蔗糖3%；②麦芽糖3%3)附加物500mg.L—1谷氨酰胺；3mg.I^AgNCV4)植物生长调节剂①NAAO.Olmg.L-1；②NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.Olmg.I71；③NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71；④6-BAO.Olmg.I71；⑤NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71；⑥NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71。5)基本培养基配方(mg.L—1)(1)MS:NH4N031650，KN031900，CaCl22H20440，MgS047H20370，KH2P04170，H3BO36.2，ZnS044H208.6，MnS044H2022.3，KI0.83，Na2Mo042H200.25，CuS045H200.025,CoC12*6H200.025，FeS047H2027.8，Na2EDTA37.3，泛酸1.0，肌醇100，烟酸1.0，Vb61.0,VbiVb6l.0,Vb0.01,pH5.8。(2)PM:MgS04'7H20185，CaCl2166，KH2P0468，KN03950，NH4N03200，Fe_EDTA40，肌醇450，pH5.8。(3)HN:MgS047H20185，CaCl2166，KH2P0468，MnS04H2025，H3B0310，ZnS04'7H2010，NaMo04.2H200.25，Fe_EDTA40，烟酸5，盐酸硫胺素0.5，盐酸吡哆醇0.5，肌醇100，甘氨酸2，pH5.6。利用本发明提供的诱导培养基游离培养番茄小孢子主要步骤如下1)番茄单核靠边期花蕾的消毒普通番茄植株进入花期，及时去掉已开的花，使番茄植株总处于花期状态。从可以观察到花蕾开始，用镊子从植株上取不同大小的花蕾，常规醋酸洋红染色压片镜检确定小孢子发育时期。选择小孢子发育处于单核靠边期的花蕾，流水冲洗，然后酒精消毒和次氯酸钠消毒，最后用无菌水冲洗。2)番茄小孢子的游离用镊子取番茄花蕾放于无菌试管中，加入甘露醇溶液，碾碎；悬浮液通过细胞筛后放入离心管中离心；去掉上清液，再加入甘露醇溶液，过细胞筛、离心，重复24次。然后，倒掉上清液，再向离心管中加入诱导培养基悬浮小孢子，血球计数板计数，稀释小孢子浓度到1.52X105个.mL—1。3)番茄小孢子的预处理将所得的番茄小孢子分装在培养皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下静置13天后，再于3040°C静置13天。4)番茄小孢子的培养于2430°C下在诱导培养基中进行暗培养，直到有愈伤组织出现，再转到2430°C下光照1418h于诱导培养基中进行光培养实施例1试验材料普通番茄、樱桃番茄、野生番茄及杂种一代番茄在内的8种不同基因型的番茄材料。表1.8种不同基因型的番茄品种序号番茄基因型序号番茄基因型1中杂9号(普通番茄)5大圣女(糗桃番茄)2中蔬6号(普通番茄)6醋栗番茄(野生番茄)3多彩番茄(普通番茄)7红牛心X醋栗番茄453号番茄(普通番茄)853号番茄X津粉701)番茄单核靠边期花蕾的消毒植株显蕾开始，及时去掉已开的花，使番茄植株总处于花期状态。从可以观察到花蕾开始，用镊子从植株上取不同大小的花蕾，醋酸洋红染色压片镜检，得到单核靠边期的番茄花蕾。选择小孢子发育处于单核靠边期的番茄花蕾，流水冲洗1020min，70%酒精消毒2040s，5%的次氯酸钠消毒1520min，去离子无菌水冲洗25次，每次35min。2)番茄小孢子的游离用镊子取番茄花蕾放于无菌试管中，加入0.3mol.L—1的甘露醇溶液6-8ml，然后用玻璃棒将番茄花蕾碾碎，悬浮液通过300目的细胞筛后，放入带刻度的离心管中，于6001200rpm离心25min。弃上清液，再加入0.3mol.L—1甘露醇溶液6-8ml,6001200rpm离心25min。然后，倒掉上清液，再向离心管中加入诱导培养基悬浮小孢子，血球计数板计数，稀释小孢子浓度到1.52X105个.ml/1。3)番茄小孢子的预处理最后以3mL的量分装在60X15mm的培养皿中，用6Paraflim封口，然后在黑暗中，于4°C下静置2天后，再于36°C静置2天。4)番茄小孢子的培养于27°C下在诱导培养基进行暗培养，直到有愈伤组织出现，再转到27°C下光照16h于诱导培养基中进行光培养诱导培养基的组成基本培养基为MS，植物生长调节剂为NAAO.lmg.L-1+6-BAO.2mg.L-1附加物为500mg.L-1谷氨酰胺+3mg.L-1AgNCV碳源为0.3%蔗糖。实施例2试验材料同实施例1.1)番茄单核靠边期花蕾的消毒植株显蕾开始，每天上午8:00-10:00用镊子从植株上取不同大小的花蕾，用冰盒带回实验室，醋酸洋红染色压片镜检，确定小孢子发育时期。选择小孢子发育处于单核靠边期的花蕾，流水冲洗15min，70%酒精消毒30s，5%的次氯酸钠消毒1520min，去离子无菌水冲洗3次，每次35min。2)番茄小孢子的游离用镊子取番茄花蕾放于无菌试管中，加入0.3mol.L—1的甘露醇溶液68mL；用玻璃棒将番茄花蕾碾碎，所得悬浮液通过300目的细胞筛，放入带刻度的离心管中，600rpm离心5min；弃上清液，加入68mL甘露醇溶液，600rpm离心5min，重复3次。最后，弃上清液，加入诱导培养基悬浮小孢子，血球计数板计数，稀释小孢子浓度到1.5ZXK^f.mL—1。3)番茄小孢子的预处理将小孢子悬浮液以3mL的量分装在60X15mm的培养皿中，用Paraflim封口。黑暗条件下，于4°C下静置2天，然后于36°C下静置2天。4)番茄小孢子的培养于27°C下进行暗培养，直到有愈伤组织出现，再转到27°C光照16h进行光培养。诱导培养基的组成同实施例1。实验结果不同基因型的番茄品种的小孢子在实施例1和实施例2中均获得了大量的愈伤组织。实施例3实验的各步骤同实施例2，实验材料为普通番茄，各实验所用的诱导培养基见表2。表2.各实验所用的诱导培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果不同基因型的番茄品种的小孢子在以下诱导培养基中获得了大量愈伤组织，见表3。表3.获得了大量愈伤组织的实验列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>不同基因型的番茄品种的小孢子在以下诱导培养基中获得了少量愈伤组织，见表4。表4.获得了少量愈伤组织的实验列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其他的诱导培养基没有获得愈伤组织。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。权利要求一种诱导培养基，包含有基本培养基、碳源、附加物和植物生长调节剂，其特征在于所述基本培养基为MS、PM或HN；所述植物生长调节剂为NAA0.1mg.L-1+6-BA0.2mg.L-1、NAA0.01mg.L-1+6-BA0.1mg.L-1、NAA0.01mg.L-1+6-BA0.1mg.L-1、6-BA0.01mg.L-1或NAA0.01mg.L-1+6-BA0.2mg.L-1；所述碳源为0.3％蔗糖和/或0.3％麦芽糖；所述附加物为500mg.L-1谷氨酰胺和/或3mg.L-1AgNO3。2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基的基本培养基为MS,植物生长调节剂为NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71或NAAO.Olmg.L^+B-BAO.2mg.L—1，附加物为500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'AgNO,,碳源为0.3%蔗糖。3.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基的基本培养基为HN，附加物为500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.I^AgNC^，碳源为0.3%蔗糖，植物生长调节剂为NAAO.Olmg.L^+B-BAO.lmg.L—1；或者基本培养基为PM，附加物为500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.I^AgNOy碳源为0.3%麦芽糖，植物生长调节剂为6-BAO.Olmg.I71。4.利用权利要求13任一项所述的诱导培养基培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法，其特征在于包括以下步骤(1)番茄单核靠边期花蕾的消毒；(2)番茄小孢子的游离；(3)番茄小孢子的预处理；(4)番茄小孢子的培养，于权利要求13任一项所述的诱导培养基上培养，直到获得愈伤组织。5.根据权利要求4所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于步骤(1)中，获得所述番茄单核靠边期花蕾的方法为植株现蕾开始，从植株上采取花蕾，醋酸洋红染色压片镜检，得到番茄单核靠边期花蕾。6.根据权利要求4所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于步骤(1)中，所述消毒的方法为先用流水冲洗番茄单核靠边期花蕾1020min，再用70%酒精消毒2040s和5%次氯酸钠消毒1520min，最后用无菌水冲洗。7.根据权利要求4所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于步骤(2)中，所述游离的方法为番茄单核靠边期花蕾放于无菌试管中，然后加入0.3mol/L甘露醇溶液68mL，碾碎，所得悬浮液过300目的细胞筛，6001200rpm离心25min，去掉上清液，重复24次。最后，倒掉上清液，加入权利要求13任一项所述的诱导培养基悬浮番茄小孢子，并稀释所得番茄小孢子到浓度为1.52X105个/mL。8.根据权利要求4所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于步骤(3)中，所述番茄小孢子的预处理是将步骤(2)所得番茄小孢子分装在培养皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下静置13天后，再于3040°C下静置13天。9.根据权利要求48任一项所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于步骤(4)中，所述番茄小孢子的培养是指于2430°C下，在权利要求13任一项所述的诱导培养基中进行暗培养，直到有愈伤组织出现，再转到2430°C下光照1418h进行光培养。10.根据权利要求9所述的获得愈伤组织的方法，其特征在于所述暗培养的培养温度为27°C，有愈伤组织出现时，再转到27°C下光照16h进行光培养。全文摘要本发明涉及一种诱导培养基及利用该诱导培养基游离培养番茄小孢子获得愈伤组织的方法。上述诱导培养基包含有基本培养基(MS、PM或HN)、碳源(蔗糖或麦芽糖)、附加物(谷氨酰胺和/或AgNO3)和植物生长调节剂(NAA+6-BA)。本发明综合考虑了影响番茄小孢子培养的多方面因素，通过尝试多种培养基及植物生长调节剂的组合，得到了适宜小孢子生长的培养基配方，高、低温交替处理预培养的方法提高了出愈率，通过液体游离培养进一步提高了出愈率，为后续研究工作的顺利开展奠定了坚实的基础。文档编号C12N5/04GK101824396SQ20101016847公开日2010年9月8日申请日期2010年5月11日优先权日2010年5月11日发明者孙亚东,徐加新,李继纲,梁燕,王晓静申请人:西北农林科技大学