专利名称：与植物株型相关蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及与植物株型相关蛋白及其编码基因。
背景技术：
株型(plant type)，是指与作物品种产量能力有关的一组特征或植物体在空间的排列方式，即长势长相。理想株型(Ideal plant type)亦称为理想型(Ideotype)，指由有利植株光合作用、生长发育和籽粒产量的性状所组成的理想化株型，它能最大限度地提高群体光能利用率，增加生物学产量和提高经济系数等。有关水稻株型的研究，20世纪50年代末期，日本科学家角田重三郎从他对水稻、大豆、甘蔗等的研究实践中总结出适于多肥集约栽培的品种应具有厚、小、直立且深绿色的叶片，短而坚韧的茎秆以及中等分蘖力的理想株型理论(角田重三郎.农业及园艺.1987，62(1) :25 四.)。不断改良株型也是我国水稻超高产育种的基本经验。从农家品种的高秆披叶型逐步改良为矮秆直叶型，从注重形态改良逐渐发展到形态和机能改良并重，不但改善了光能利用效率，增加了抗倒伏能力，还增强了水稻的生理功能。水稻叶片性状是株型构成的重要因素，直接关系到叶片的光合面积和光能利用率，进而对产量产生重要影响，因此对叶型的研究是育种家、遗传学家和分子生物学家共同关注的焦点之一，而叶片的宽度和卷曲情况是其中的重要组成部分。研究表明，水稻窄叶和卷叶性状主要受质量性状基因控制。目前报道的窄叶及卷叶突变体多作为经典的形态标记。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株型相关和/或与产量相关的由a)衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因为如下1)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是SEQ ID NO :1中自5'末端第140-1066位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQ ID NO 1所示DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述高严谨条件为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLI SEEDL上述(a)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a)中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO :1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3' 端连上表1所示的标签的编码序列得到。扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO 3所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO 4所示。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组载体为将所述编码基因插入载体pCAMBIA2300-Actin的多克隆位点得到的。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区等均具有类似功能。携带有本发明基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述任一所述编码基因在改变植物株型和/或改变产量表型中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述蛋白在改变植物株型和/或改变产量表型中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供一种改变植物株型和/或产量表型的方法。本发明所提供的改变植物株型和/或产量表型的方法，为如下1)或2)
1)是向出发植物中导入上述任一所述编码基因，得到与出发植物相比株型改变的目的植物；2)是向出发植物中导入上述任一所述编码基因，得到与出发植物相比产量表型改变的目的植物。上述方法中，所述编码基因是通过上述任一所述重组载体导入的。上述任一所述应用和任一所述改变植物株型的方法中，所述株型为植株主茎高、 植株叶片宽或植株叶片长；所述产量表型为植株主穗长或植株主穗粒数；所述株型改变为目的植物的植株主茎高小于所述出发植物、目的植物的植株叶片宽小于所述出发植物、和/或目的植物的植株叶片长小于所述出发植物；所述产量表型改变为目的植物的植株主穗长小于所述出发植物和/或目的植物的植株主穗粒数少于所述出发植物。上述任一所述应用和任一所述改变植物株型的方法中，所述出发植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻；所述水稻为水稻突变体nail。实验证明，向水稻突变体nail中导入本发明基因后，得到的转基因植株的株型明显改变，具体表现在植株叶片宽小于突变体nail、植株叶片长小于突变体nail、植株主茎高小于突变体nail、植株主穗长小于突变体nail、植株主穗粒数少于突变体nail。如果将该基因敲除则导致产量的增加。本发明基因在植物的遗传育种领域将有广阔的应用前景。
图1为转基因水稻与对照植株的表型。图2为转基因水稻与对照植株的主穗表型。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、基因的制备与功能验证野生型水稻浙辐802(zf8(^)在文献(郑雷英，朱旭东，钱前，赵忠，张建军，胡筱荷，林鸿宣，罗达.2003.水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析.科学通报第48卷第3期) 中公开过(由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)。pMD19-T载体购自takara，产品目录号为D102A。载体 pCAMBIA2300-Actin 在文献(Kejian Wang, Ding Tang, Lilan Hong, WenyingXu, Jian Huang, Ming Li, Minghong Gu, Yongbiao Xue, Zhukuan Cheng. 2010. DEPandAFORegu 1 ate Reproductive Habit in Rice. January 2010. Volume 6.)中公开过。 (由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)。根癌农杆菌EH105在文献(赵志强，傅亚萍，杨鹃，张玉满，颜永胜，方荣祥，孙宗修，陈晓英.2008.水稻小G蛋白Osl^ra〗基因的克隆及功能分析.Chin J Biotech2008, December 25 ；24(12) :2027-2033中公开过(由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)。水禾§突变体 nail (Dong Fenggao, Xiong Zhenmin，Qian Qian，Zu Xudong，Chen
5Shihua(1994). Breeding Near-isogenic lines ofmorphological markers in indica rice. Chinese J. Rice Sci. 8，135-139。(由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)。一、基因制备人工合成SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位碱基所示的DNA，也可按照如下方法制备SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位碱基所示的DNA。SEQ ID NO :1中自 5，端起第140-1066位碱基所示的DNA编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。提取野生型水稻浙辐802 (zf802)的总RNA，以其反转录产物为模板，用如下引物 P1/P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Pl :5，-ATGGACTCCCCGTCGCCTAT(正向引物)(SEQ ID NO 3)；P2 :5，-CTAGAGGCTCAAGTTGAGGT(反向引物)(SEQ ID NO 4)。将PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA片段，与pMD_19T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选，挑取单克隆；将单克隆分别进行液体培养，提取质粒，将质粒进行测序。结果，PMD-19T载体中插入的基因序列如SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位碱基所示，表明构建的重组载体正确，将其命名为pMD-19T-SUNl。二、基因转化突变体nail1、重组表达载体构建用限制性内切酶)(ba I和Ml I酶切PMD-19T-SUN1，回收目的基因片段；用限制性内切酶)(ba I和Ml I酶切载体pCAMBIA2300-Actin，回收载体大片段；目的基因片段与载体大片段连接，得到重组载体。将重组载体转化大肠杆菌，抗性筛选，挑取单克隆；将单克隆分别进行液体培养，提取质粒，将质粒进行测序。结果，pCAMBIA2300-Actin载体的)(ba I和Ml I酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位碱基所示，表明构建的重组载体正确，将其命名为pActin: :SUN1。2、重组农杆菌构建用热击法将重组表达载体pActin: SUNl转化根癌农杆菌EH105，筛选阳性重组子，得到含有重组表达载体pActin: SUNl的根癌农杆菌EH105，记作EH105_pActin: SUNl。3、转基因植株构建用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化法将pActin: SUNl转化水稻突变体nall，对转化植株进行PCR鉴定，PCR鉴定所用引物为上述P1/P2，结果得到10株阳性植株，均为TO 代植株；将转入基因SUNl的植株记作转基因植株。同时以转入空载体pCAMBIA2300_Actin的水稻突变体nall作为对照，以未进行任何处理的野生型水稻突变体nall作对照。4、转基因植株的表型分析观察统计转基因植株、对照植株的表型。再对植株的主茎高度、主穗长度、主穗粒数、叶片宽、叶片长进行统计分析。转基因植株与对照植株的表型如图1和图2所示。A为野生型水稻突变体nall， B为转基因植株。结果表明，与对照植株相比，转基因植株的株型改变，具体如下主茎高度变矮、叶片明显变窄、叶片长度明显变小；转基因植株的产量表型改变，具体如下主穗长度变小、主穗粒数变少。野生型水稻突变体nall与转入空载体pCAMBIA2300-ACtin的水稻突变体nall的株型相同。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株型相关和/或与产量相关的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白质的编码基因为如下1)、 2),3)或4)的基因1)其核苷酸序列是SEQID NO :1中自5'末端第140-1066位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQID NO 1所示DNA分子；3)在严格条件下与1)或2、限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对；或，所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO 3所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO 4所示。
5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒； 或，所述重组载体为将权利要求2或3所述编码基因插入载体pCAMBIA2300-Actin的多克隆位点得到的。
6.权利要求2或3所述编码基因在改变植物株型和/或改变产量表型中的应用，或权利要求1所述蛋白在改变植物株型和/或改变产量表型中的应用。
7.一种改变植物株型和/或产量表型的方法，为如下1)或2)1)是向出发植物中导入权利要求2或3所述编码基因，得到与出发植物相比株型改变的目的植物；2)是向出发植物中导入权利要求2或3所述编码基因，得到与出发植物相比产量表型改变的目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述权利要求2或3所述编码基因是通过权利要求5中所述重组载体导入的。
9.根据权利要求6所述的应用或权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述株型为植株主茎高、植株叶片宽或植株叶片长；所述产量表型为植株主穗长或植株主穗粒数；所述株型改变为目的植物的植株主茎高小于所述出发植物、目的植物的植株叶片宽小于所述出发植物、和/或目的植物的植株叶片长小于所述出发植物；所述产量表型改变为目的植物的植株主穗长小于所述出发植物和/或目的植物的植株主穗粒数少于所述出发植物。
10.根据权利要求6所述的应用或权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述出发植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻；所述水稻为水稻突变体nail。
全文摘要
本发明公开了与植物株型相关蛋白及其编码基因。该蛋白是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株型相关和/或与产量相关的由a)衍生的蛋白质。实验证明，向水稻突变体nall中导入本发明基因后，得到的转基因植株的株型明显改变，具体表现在植株主茎高小于突变体nall、植株主穗长小于突变体nall、植株主穗粒数少于突变体nall、植株叶片宽小于突变体nall、植株叶片长小于突变体nall。本发明基因在植物的遗传育种领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102234330SQ201010168639
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月4日 优先权日2010年5月4日
发明者刘小强, 孙加强, 李传友, 李淑钰, 王保, 蒋红玲 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所