用于检测Hg²⁺的核酸纳米金生物传感器的制作方法

专利名称：用于检测Hg²⁺的核酸纳米金生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种快速检测Hg2+的生物传感器。
背景技术：
目前汞检测的主要方法是光谱法，包括原子(吸收、发射、荧光等)光谱方法以及 分光光度法等。近年来，原子光谱与电感耦合发射光谱的联用，提高了检测的灵敏度，拓宽 了检测的线性范围，而电感耦合等离子体质谱使检测更加灵敏，数据分析更加方便。但是， 此类仪器较为昂贵，在大多数实验室中的推广应用因此受到限制。除光谱法外，以冠醚类小 分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，但尚有灵敏度低、可重复性差等不足之处，检 测的可靠性和准确性也不足。近年来，纳米材料的发展为解决这一问题提供了新的思路。纳米金颗粒具有优异 的光学性质、电学性质、化学活性和生物兼容性，在生物领域得到广泛应用。研究表明，纳米 金溶液的颜色与纳米金颗粒的间距以及纳米金聚集体的大小有关。纳米金颗粒的间距若 明显超过其平均直径，纳米金呈分散状态，宏观上表现为红色；该间距若小于平均直径，则 纳米金易团聚，呈聚集态，宏观上表现为紫色到蓝色。利用纳米金的这种性质，可设计一系 列生化反应以改变纳米金颗粒间的距离，从而实现对靶物质的检测。最近，Ono等(Ono A, TogashlH. Angew Chem Int Ed, 2004,43 (33) 4300-4302)利用 Hg2+与 DNA 的特异性作用， 设计了一种新型生物传感方法，通过检测两端标记的DNA探针结合Hg2+后产生的荧光变化 实现对Hg2+的特异性检测。该方法具有较高的特异性，可排除实际样品体系中大多数离子 的干扰，但是检测灵敏度不高，而且需要进行DNA双标记，还依赖于荧光仪器，检测成本仍 然较高。

发明内容
本发明的目的是克服现有Hg2+检测技术存在的问题和不足，提供了一种用于Hg2+ 快速检测的新工具，即核酸纳米金生物传感器，利用Hg2+存在时，T-T碱基能够互补配对的 原理，配合胶体金放大系统，用来检测Hg2+，因而能快速检测Hg2+、不需要仪器，使用方便，且 灵敏度高。本发明所述的一种用于检测Hg2+的核酸纳米金生物传感器，包括检测试纸条、检 测核酸试剂和上样缓冲液；所述检测试纸条从左到右依次由固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素 膜和吸水纸组成；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记的第一核酸，其序列如SEQ ID NO. 1所示，该核酸 序列的5’端标记巯基并与胶体金颗粒偶联，3’端标记生物素；所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；质控线上固定有第三核酸，其序列如 SEQ ID NO. 3所示，该核酸序列的5’端标记生物素，与链霉亲和素反应后，固定在硝酸纤维 素膜的质控线上；检测线上固定有链霉亲和素；
其中，第三核酸序列与第一核酸序列特异性互补；所述检测核酸试剂含有第二核酸，其序列如SEQ ID NO. 2所示，从5’端开始第6 个碱基处与第一核酸序列有T-T碱基的错配；所述检测核酸试剂与待检测溶液及上样缓冲 液一起滴在所述样品垫上；所述上样缓冲液为4X核酸杂交液，含0. 6M氯化钠，0. 06M柠檬酸钠。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述质控线与检测线相 距 3-10mm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述固定于胶板上的样 品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l_5mm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述胶体金的粒径为 8-100nm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金的制备方 法包括选用粒径为8-lOOnm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备，通 过控制还原剂的量在0. 01%-0. 05%以及搅拌速度在1000-50000转之间来控制颗粒粒径。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金与核酸序 列的偶联与封闭老化的方法包括将巯基修饰的第一核酸序列加入到5倍体积浓缩的纳米 金溶液中，混合，在4-37°C反应10-24小时，用牛血清白蛋白封闭多余的活性位点，30分 钟后加入NaCl和SDS使其终浓度分别至0. 15M和0. 01 %，老化10-20小时后，10000-16000 转/分钟离心20-60分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记寡核苷酸探针，将此纳米金 标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4°C保存。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的样品垫是经过以 下处理的采用含TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的混合液浸泡玻璃纤维4个小时 后，37 °C烘干过夜。本发明的技术原理是根据当Hg2+存在时，T-T碱基能够互补配对的原理，设计特 异的核酸序列，用来检测溶液中Hg2+的存在。本发明一共设计3条核酸序列核酸序列1共 有36个碱基，两端互补配对，形成一个颈环结构，称为Molecular Beacon (MB) 0此序列5’ 端标记巯基，3’端标记生物素，5’端巯基能与胶体金颗粒通过静电结合，装配在胶体金颗粒 表面。装配好核酸的胶体金颗粒喷在金标垫上。核酸序列2为靶序列DNA，共24个碱基，此 序列从5’端开始第6个碱基处与MB序列有T-T碱基的错配。此DNA溶液与要检测的溶液 一起滴在样品垫上，当待检溶液中没有Hg2+存在时，靶序列DNA不能与MB序列完全互补配 对，从而不能将MB的颈环打开，标记在MB —端的生物素不能被释放出来，不能与T线上的 链霉亲和素反应，从而T线不显色，只有C线显色；当检测溶液中有Hg2+存在时，Hg2+的存在 使得错配的T-T碱基能够互补配对，从而将MB的颈环结构打开，隐蔽在胶体金颗粒表面的 生物素被暴露出来，与标记在T线上的链霉亲和素结合，使胶体金停留在T线上，T线显色， 同时C线也显色。核酸序列3为对照序列，共30个碱基，与MB序列完全互补配对。此序列 5’端标记生物素，与链霉亲和素反应后，划在硝酸纤维素膜的质控线上。当金标垫上的胶体 金颗粒被释放出来的时候，胶体金颗粒上标记的核酸序列1与质控线上的核酸序列3结合， 从而使得质控线显色。本发明的优点在于巧妙的利用分子信标能分辨单核苷酸错配以及Hg2+存在时能
4使T-T碱基互补配对的原理，设计出了一种高灵敏度、低费用、不需要使用任何仪器的胶体 金试纸条生物传感器。既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测灵敏 度，而且制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员。


图1为本发明所述的核酸纳米金生物传感器对于Hg2+标准溶液梯度的检测实验结 果；图2为本发明所述的核酸纳米金生物传感器对于不同金属离子的检测实验结果。
具体实施例方式实施例一本发明所述的核酸纳米金生物传感器的制备1、三种核酸序列的设计根据本发明的技术原理，设计的三段核酸序列是核酸序列1 :SEQ ID NO. 15，-巯基修饰-ACACGCTAATCAAGCTTTAACTCATAGTTAGCGTGT-3，生物素修饰核酸序列2 :SEQ ID NO. 25， -ACGCTTACTATGAGTTAAAGCTTG-3，核酸序列3 :SEQ ID NO. 35，-生物素修饰-ACGCTAACTATGAGTTAAAGCTTGCTTAAG-3，2.纳米金(胶体金)的制备向250ML的圆底烧瓶中称取100g 0. 01 %的HAuCL4溶液，磁力搅拌加热至沸腾； 然后向上述溶液中迅速加入4ml 的柠檬酸三钠，溶液变为红色后，继续煮沸lOmin，停 止加热继续搅拌直至冷却；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。金标核酸的制备用100 ill去离子水溶解10D核酸序列1，加入到1ml 5倍体积浓缩的胶体金溶液 中，4°C 24小时；的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl和的SDS，分别至终浓 度为0. 15M和0. 01 %，4°C过夜，11500转/分钟离心20分钟，弃上清，沉底用500ul重悬液 (20mM Na3P04,5%BSA,0. 25% Tween，和10%蔗糖)重悬，重复洗三遍后用200ul的重悬液 重新悬浮，制成悬浮液。3.样品垫的处理玻璃纤维浸泡含有TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的溶液后，37°C烘干备用。4.金标垫的制备将本发明制备的金标核酸序列1涂于玻璃纤维上，37°C干燥2个小时，制成金标
垫，备用。5.硝酸纤维素膜上质控线和检测线的处理用32iU去离子水溶解10D生物素标记的核酸序列3，使其浓度为100 y M，取 15 ill 100iiM的核酸序列3，加入15ia(lmg/ml)链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用
5划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜质控线上，37°C干燥两个小时。用30ia(lmg/ml)链霉亲和素，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上， 37 °C干燥两个小时。6.胶体金试纸条的组装将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探 针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得 到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。实施例二 本发明所述的核酸纳米金生物传感器的质量控制与检测效果采用实施例一所制成的核酸纳米金生物传感器，进行以下实验，验证其检测效果。1.配制 Hg2+ 标准溶液梯度,浓度分别为 1 P M、500nM、100nM、50nM、20nM、10nM。2.配制 100nM 的 Hg2+、Mn2.、Cd2+、Pb2+、Mg2+、Zn2\ Fe2\ Ca2\ Fe3\ Al3+、Ag+ 溶液。3.用去离子水溶解10D核酸序列2，使其浓度为lOOnM。4.取10 ill上述核酸序列2与90 ill待检的Hg2+溶液混合，滴于上述纳米金生物 传感器的样品垫上，10分钟可判断结果。(见图1)结果显示随着Hg2+浓度的增加，检测线条带越来越深，肉眼可见(图1左)，用金 标试纸条读数仪的结果也一致，随着Hg2+浓度的增加，检测线的曲线也逐渐增大(图1右)， 质控线显色。5.取10 ill上述核酸序列2与90 ill待检的其他离子溶液混合，滴于上述纳米金 生物传感器的样品垫上，10分钟可判断结果。(见图2)结果显示在lOOnM浓度下，只有Hg2+存在时，检测线显色，其他离子均不显色，肉 眼可见(图2左)，用金标试纸条读数仪的结果也一致，只有Hg2+存在时，检测线有曲线，其 他离子存在时，检测线没有曲线(图2右)，质控线显色。质量控制标准(1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。(2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品中Hg2+含量超标；(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品中Hg2+含量没 有超标；(3) C线没有出现红色的线，说明纳米金生物传感器失效。
权利要求
一种用于检测Hg2+的核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括检测试剂条、检测核酸试剂和上样缓冲液；所述检测试纸条从左到右依次由固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记的第一核酸，其序列如SEQ ID NO.1所示，该核酸序列的5’端标记巯基并与胶体金颗粒偶联，3’端标记生物素；所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；质控线上固定有第三核酸，其序列如SEQ ID NO.3所示，该核酸序列的5’端标记生物素，与链霉亲和素反应后，固定在硝酸纤维素膜的质控线上；检测线上固定有链霉亲和素；其中，第三核酸序列与第一核酸序列特异性互补；所述检测核酸试剂含有第二核酸，其序列如SEQ ID NO.2所示，从5’端开始第6个碱基处与第一核酸序列有T-T碱基的错配；所述检测核酸试剂与待检测溶液及上样缓冲液一起滴在所述样品垫上；所述上样缓冲液为4X核酸杂交液，含0.6M氯化钠，0.06M柠檬酸钠。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述质控线与检测线 相距 3-10mm。
3.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述固定于胶板上的 样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l_5mm。
4.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述胶体金的粒径为 8-100nm。
5.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的纳米金的制备 方法包括选用粒径为8-lOOnm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备， 通过控制还原剂的量在0. 01% -0. 05%以及搅拌速度在1000-50000转之间来控制颗粒粒径。
6 根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的纳米金与核酸 序列的偶联与封闭老化的方法包括将巯基修饰的第一核酸序列加入到5倍体积浓缩的 纳米金溶液中，混合，在4-370C反应10-24小时，用1 %牛血清白蛋白封闭多余的活性位 点，30分钟后加入NaCl和SDS使其终浓度分别至0. 15M和0. 01 %，老化10-20小时后， 10000-16000转/分钟离心20-60分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记寡核苷酸探针， 将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4°C保存。
7.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的样品垫是经过 以下处理的采用含TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的混合液浸泡玻璃纤维4个小 时后，37°C烘干过夜。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测Hg2+的核酸纳米金生物传感器，包括检测试纸条、检测核酸试剂和上样缓冲液；检测试纸条从左到右依次由固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；玻璃纤维上涂有纳米金标记的第一核酸；硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；质控线上固定有第三核酸，该核酸序列的5’端标记生物素，与链霉亲和素反应后，固定在硝酸纤维素膜的质控线上；检测线上固定有链霉亲和素；第三核酸序列与第一核酸序列特异性互补；检测核酸试剂含有第二核酸，从5’端开始第6个碱基处与第一核酸序列有T-T碱基的错配。本发明所述的核酸纳米金生物传感器能快速检测Hg2+、不需要仪器，使用方便，且灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK101851677SQ20101016977
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者列浦昌, 方志远, 曾令文, 萧卓, 顿博影, 黄婧 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院