专利名称：：猪繁殖性状相关基因ncoa1及其在猪标记辅助选择中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子标记制备
技术领域：
，涉及一种与猪繁殖性状相关的分子标记的存在，具体地说，是涉及一种与猪繁殖性相关的如SEQIDN0:1所示的NC0A1基因，更进一步地说，是涉及检测该基因的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点的存在。
背景技术：
：猪繁殖性状具有重要的经济性状，其遗传基础十分复杂，繁殖性状被认为是由多基因控制的一类性状。该性状遗传力极低，并且是限性性状，所以对该性状的改良十分有限，20世纪80年代以来，随着分子辅助选择和标记辅助渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种方法相结合，大大提高了猪的育种效率。目前的研究结果表明，在猪的基因组中存在产仔数的数量性状基因座(QTL)和主效基因，它们对决定产仔数的多少起重要作用。已经发现多个与产仔数相关的候选基因，如雌激素受体、催乳素受体、促黄体素、视黄酸受体、视黄酸结合蛋白、骨桥蛋白等基因。核受体辅激活蛋白1基因(Nuclearreceptorco-activator1gene,NC0A1)，又称为类固醇受体辅激活蛋白1基因(SRC1)，是影响猪繁殖性状的一个候选基因。核受体辅激活蛋白通过与结合到DNA上的核受体相互作用增强转录活性。受到NC0A1影响的核受体，如ESR，雄激素受体(AR)，在动物的生长发育，体内平衡，和繁殖等生理过程中起到重要作用。带负电的DNA和带正电的组蛋白N端有很强的相互作用，并且核小体的紧密结构通过限制转录因子结合到基因进而抑制DNA的转录。组蛋白乙酞基转移酶的活性使辅激活蛋白可以增强核受体的转录活性，并可以通过为其他辅因子提供结合位点而形成稳定的起始前复合物。由此可见，NC0A1蛋白可调节与猪繁殖性状的有关基因的转录，从而影响这些基因的表达。NC0A1与结合在DNA上的雌激素受体复杂的相互作用并加强其转录活性。NC0A1蛋白在暴露其他难接近的染色质的过程中使组蛋白乙酰化并与其他乙酰基转移酶(P300/CBP)相互作用。因此，NC0A1蛋白增强了雌激素受体的活性，反过来也刺激特定的雌激素反应基因的转录并调节随后的生理反应。国内虽有一些关于人和小鼠NC0A1基因的报道，但还没有猪NC0A1基因与产仔数性状的相关报道，然而有研究表明NC0A1可能是影响母猪多产性状的候选基因，该基因定位于猪3号染色体上。人的NC0A1基因总共有183.4kb，含有22个外显子，其cDNA长度为4721bp。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种猪繁殖性状相关NC0A1基因及其在猪标记辅助选择中的应用，为猪标记辅助选择提供有用的分子标记。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种猪繁殖性状相关基因NC0A1，其DNA序列如序列表SEQIDN0:1所述。所述序列表SEQIDNO1的第314bp处有一个T314—C314的碱基突变，导致PCR-RFLP-RsaI多态性。上述NC0A1基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的NC0A1基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，利用限制性内切酶RsaI对PCR产物进行酶切鉴定，检测在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp处是否存在T—C的突变。上述克隆及检测NC0A1基因突变所用的引物为正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。上述猪繁殖性状相关基因NC0A1在猪分子标记辅助选择中的应用。利用上述制备的与猪繁殖性状相关的分子标记可对外来猪和中国地方猪进行关联分析的应用。本发明利用比较基因组学方法根据人的NC0A1基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用SSCP技术和测序技术发现SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型，再利用SAS软件GLM(通用线性模型)分析SNP与繁殖性状的关联度。SNP发现与检测方法建立发明人设计了扩增包含该SNP引物，该基因扩增片段有440bp，当第314bp位置是T时，则该RsaI酶切位点不存在，RsaI酶切后检测结果只有1个片段，长度是440bp(定为等位基因A)；当存在T314—C314的转换时，其结果导致第314bp处一个RsaI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为314bp和128bp(定为等位基因8)，三种基因型4々^8、88，如图1所述。基因型与繁殖性状间关联结果利用SAS软件中的一般线性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序对基因型与性状进行关联分析，具体模型如下Yijk=U+Gi+CJ+Pk+BJ+eiJko其中Yijk是性状观察值，i!为总体均数，Gi为基因型效应，Cj为品种效应，Pk为父本效应，B」为批次效应，为随机误差，假定相互独立，服从N(0，o2)分布。本发明将为猪繁殖性状的分子标记，为标记辅助选择(MAS)奠定坚实的基础，进一步阐明繁殖性状的分子机制，将为改善猪繁殖提供理论依据，可提高养猪生产经济效益，并指导猪的育种实践。图1是本发明的NC0A1基因片段的序列，314bp处的多态位点用()标出表示，下划线部分为引物序列。图2是本发明猪NC0A1基因PCR-RFLP-RsaI电泳图，显示了PCR-RFLP-Rsal的三种基因型(AA、AB、BB)的电泳结果。其中M:100bpDNAMaker;1，3为PCR扩增产物；2，4，7，10为BB基因型；5，8，11为AA基因型；6，9，12为々8基因型。图3为PCR产物测序的彩峰图，上为AA型，下为BB型，突变位置用箭头表示。具体实施例方式PCR-RFLP技术检测NC0A1基因的RsaI多态性引物设计用人NCOAl基因cDNA(GenBank收录号NM_001130915)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80%以上的ESTs(片段长度大于IOObp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/ffeb/Search/index.html)查询相应序列，然后用DNASTAT程序中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物M-F和M-R，以猪的基因组DNA为模板扩增，序列如下NC0A1正向引物5'-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，(SEQIDNO:2)，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘(SEQIDNO3)。PCR扩增条件PCR反应总体积20μL，其中猪基因组DNAIOOng,含1XBuffer(Promega)、1.5mmol/LMgCl2、dNTP终浓度为1.50μmol/L、引物终浓度为0.4μmol/L、及2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是-MV3min。循环35次94°C30s,59°C30s，然后72°C20s,最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR-RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1XBuffer1μL，PCR产物35μL，限制性内切酶RsaI为0.3ML(10U)，用H2O补足10μL，将样品混勻后离心，37°C水浴4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照，结果如图2所示，表明RsaI过程后存在AA、AB和BB基因型。SNP的筛查运用正向引物和反向引物分离猪基因组片段，通过在不同猪种的基因组中扩增，回收进行产物测序，发现在该基因片段的第314位碱基处有一个T—C的碱基突变，导致PCR-RFLP-RsaI多态性，但不引起氨基酸的改变。结果PCR扩增产物纯化后克隆测序，测序结果显示扩增片断全长共440bp，见图1，序列如SEQIDNO:1所示。结果表明存在AA、AB和BB基因型，在NCOAl基因片断的314bp处存在T—C的突变，进一步证实了PCR产物中存在多态性，见图3。DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网立占的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与人NC0A1基因(GenBank收录号NM_001130915)的部分序列同源性达85%。为了进一步证明该分子遗传标记为稳定的分子标记，而非群体中存在的基因突变，本发明分析了PCR-RFLP-RsaI分子标记多态性在各猪品种中的分布情况。由下表1可知，在三个外来猪种中，长白猪、大白猪均有AA、AB、BB三种基因型；而在杜洛克猪中只检测到AA型纯合子，无AB、BB基因型。在这三个品种中，等位基因B的频率分别为0.2333,0.1719,0,A等位基因的频率分别为0.7667,0.8281、1，由以上结果可看出等位基因B在这三个外来猪种中的频率较低，而A等位基因的频率都有较高分布，同理，在这三个品种中基因型频率最高，BB基因型频率最低。杜洛克猪群的基因型分布有一个特殊的现象，只检测到AA—种基因型，等位基因B的频率为0，这与大白猪和长白猪的基因型分布差异极显著(P<0.01)。总之，除杜洛克猪外，RsaI酶切位点存在多态现象，均存在三种基因型AA、AB、BB。三个猪种之间基因型分布差异极为显著(P<0.01)，长白与大白之间基因型分布存在显著差异(P<0.05)，杜洛克与大白、长白之间基因型分布差异极为显著(P<0.01)。经卡方检验，杜洛克、长白猪、大白猪的基因型分布均符合哈代-温伯格平衡定律。并且整个正虹猪群的基因型分布符合哈代-温伯格平衡定律(x2(a(l5,2)=5.59)。表1不同品种NCOAl基因T312C位点的Hardy-Weinberg平衡检验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的分子标记在猪繁殖性状标记性状关联分析中的应用本发明所用样本全部来自正虹种猪场，涉及3个纯种(大白、长白和杜洛克)共454个样品，其中长白母猪(Landrace，L)224头；大白母猪(LargeWhiet，W)105头；杜洛克母猪(DurOC，D)125头。繁殖性状记录包括每头母猪的各胎次总产仔数和产活仔数。大白、长白两品种NCOAl各基因型头胎与经产胎的总产仔数、产活仔数均数及标准差，统计结果列于表2。表2NC0A1基因型母猪的平均仔数比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注各列中肩标相同者表示差异不显著，肩标不同字母的表示差异显著。由下表3表明，母猪胎次对其产仔数有显著影响，头胎总产仔数、产活仔数均低于经产胎，如大白猪AA型头胎平均总产仔数为10.16，而经产胎为12.33，经产胎比头胎高2.17头(P<0.01)。对头胎总产仔数和产活仔数的分析表明大白猪AA基因型比BB基因型的总产仔数和产活仔数分别高1.66头和1.37头，差异达到显著水平(P<0.05)；而在长白猪群中，头胎产仔数和产活仔数在各基因型之间的差异不显著(P>0.05)。对经产胎次总产仔数和产活仔数的分析则表明大白猪AA基因型比AB、BB基因型的总产仔数和产活仔数分别高2.66头和2.71头，差异达到极显著水平(P<0.01)；长白猪AA基因型比BB基因型的总产仔数和产活仔数分别高2.42头和2.07头，差异达到极显著水平(P<0.01)。总之，胎次对产仔性状有显著影响，经产胎次产仔数显著高于头胎；并且他们在总产仔数还是产活仔数上都有上有按AA、AB、BB递减的趋势，AA型的产仔数和产活仔数均高于AB和BB型。表3NC0A1各基因型初产与经产母猪的产仔数比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注各列中肩标字母相同者表示差异不显著，肩标字母不相同者表示差异显著。权利要求一种猪繁殖性状相关基因NCOA1，其DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。2.根据权利要求1所述的猪繁殖性状相关基因NC0A1，其特征在于所述序列表SEQIDNO1的第314bp处有一个T314—C314的碱基突变，导致PCR-RFLP-RsaI多态性。3.根据权利要求2所述的猪繁殖性状相关基因NC0A1，其特征在于所述NC0A1基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的NC0A1基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，利用限制性内切酶RsaI对PCR产物进行酶切鉴定，检测在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp处是否存在T—C的突变。4.根据权利要求3所述的猪繁殖性状相关基因NC0A1，其特征在于所述克隆及检测NC0A1基因突变所用的引物为正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。5.根据权利要求1-5中任一项所述的猪繁殖性状相关基因NC0A1在猪分子标记辅助选择中的应用。全文摘要一种猪繁殖性状相关基因NCOA1及其在猪标记辅助选择中的应用，测定出作为猪标记辅助选择应用与猪繁殖性状相关的分子标记，该分子标记由NCOA1基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNo1所述，该序列全长440bp，在序列的第314bp处有一个T314→C314的碱基突变，导致PCR-RFLP-RsaI多态性。本发明还公开了扩增NCOA1基因DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本发明为猪繁殖性状标记辅助选择提供了新的分子标记。文档编号C12Q1/68GK101824417SQ201010169799公开日2010年9月8日申请日期2010年5月12日优先权日2010年5月12日发明者伍小松,李永辉,柳小春,蒋隽,马海明申请人:湖南农业大学