专利名称：大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质研究的制作方法
技术领域：
以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克 隆到大肠杆菌表达载体后诱导表达，亲和层析法纯化后得到纯酶，并对该酶进行了酶活测 定及酶学性质的相关研究，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布在动物组织、微生物和植物中。它是一种活性最强 的酶，根据亚细胞定位，苹果酸脱氢酶可分为5种类型，存在于乙醛酸体、线粒体、过氧化物 体、叶绿体、细胞浆以及锥虫甘油体内。MDH为多聚体酶，是由相同或相似亚基组成的二聚体 或四聚体，亚基的分子量为30-35kDa，MDH在医学方面也引起越来越多的关注如利用基因 工程疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向，通过牛带绦虫亚洲亚种MDH基因的 生物信息学分析，预测到胞浆型MDH是一个潜在的诊断抗原，这为带绦虫在诊断、药物及疫 苗研究中的应用前景提供了重要的线索，在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断， 例如用于诊断DIC(弥散性血管内凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品领域，苹果酸脱 氢酶用于有机酸含量的测定，如L-苹果酸、醋酸、柠檬酸等物质的测定，应用前景广泛。利 用MDH底物专一性，还可将其用于拆分D，L-苹果酸。总之，MDHs作为生物体中枢代谢途径的关键酶，国内外对其已进行了较为广泛的 研究，MDHs同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因 此深入了解MDHs的生理生化特性、结构及功能、催化机制，对于酶重组蛋白的表达、纯化及 免疫特性分析，探讨生物体中MDHs的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制有着重要的 意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。本发明通过分子生物学技术获得苹果酸脱氢酶基因，将其连与表达载体上并转化 大肠杆菌成功构建了基因工程菌。
发明内容
本发明的主要研究内容本发明利用分子技术克隆了来自大肠杆菌的苹果酸脱氢 酶基因，构建重组表达载体pET-28a(+)-mdh，并将其转化E. coli BL21(DE3)成功构建了基 因工程菌pET-28a-mdh/BL-21，利用亲和层析法对表达的MDH进行了纯化，得到了酶活可达 到112. 5U/mg的纯酶液，并对该酶的酶学性质进行了研究。以便为以后该酶的应用提供理 论基础。本发明的技术方案从大肠杆菌中抽提染色体DNA作为模板，根据预先设计好的 引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回 收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产 物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载 体和PCR产物用T4DNA连接酶连接过夜。取连接产物转入E. coliBL21 (DE3)的感受态细胞进行转化，挑去阳性转化子于IOml的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证 正确后，将菌液加入甘油于-20°C冰箱保存。取冻管保藏的菌种接入IOml的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日转接诱导表 达，将诱导液通过亲和层析纯化得到纯酶液。粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以 BSA为标准蛋白。经测定粗酶液比酶活是43U/mg，纯酶液比酶活是112. 5U/mg。纯酶液进行 酶学性质的初步研究。本发明的有益效果苹果酸脱氢酶在三羧酸循环中以NAD或NADH为辅因子，催化 草酰乙酸盐与苹果酸盐进行相互转化。它在生物细胞中广泛存在，但表达的量仅满足生物 本身生存的需要，苹果酸脱氢酶能够在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断，例如 用于诊断DIC(弥散性血管内凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。还可以用于食品中有机酸含 量的测定，如L-苹果酸、醋酸、柠檬酸等物质的测定，具有广泛的应用前景。鉴于苹果酸脱 氢酶的应用价值，获得该酶的高表达和高酶活一直以来是研究的热点。因此，通过基因工程 技术构建高表达载体达到苹果酸脱氢酶的高效表达和比较高的酶活水平具有重要意义。
图1、重组质粒pET-28a_mdh的构建图2、质粒pET-28a_mdh酶切验证Lane IDNA Marker λ DNA/Hind III Lane 2pET-28a_mdh/Xho I +EcoR ILane 3pET-28a_mdh/EcoR ILane 4pET_28a/EcoR ILane 5mdh/EcoR ILane 6DNA Marker :DL_2000图3、苹果酸脱氢酶的表达Lane 1 supernatant of E.coli BL21 with recombinant ρ lasmi d pET-28a(+)-MDHLane 2supernatant ofE. coli BL21with plasmid pET~28a(+)Lane 3Protein markers(kDa)图4苹果酸脱氢酶的纯化Lane 1 Protein markers(kDa)Lane 2supernatant of E.coli BL21 with plasmid pET-28a(+)Lane 3 purified MDH Lane 4supernatant of E.coli BL21 with recombinant plasmid pET_28a (+)-MDH
具体实施例方式根据NCBI大肠杆菌的全基因组核酸序列中mdh基因序列，设计苹果酸脱氢酶的 PCR 引物 Pl :CCGGAATTCATGAAAGTCGCAGTCCTCG(EcoR I ) P2 :CCGCTCCGAGTTACTTATTAACG AACTC(Xho I )从大肠杆菌中抽提染色体DNA作为模板，抽提方法如下用接种环从新鲜的大肠 杆菌平板上挑取单落悬于0. 5ml的灭菌双菌水中，沸水煮5-10min，8000r离心lOmin，取上 清装入一只干净的1. 5ml的离心管中。以大肠杆菌总DNA为模板 ，PCR扩增条件为95°C，5min变性，94°C 90s, 58°C 90s,72°C 90s共35个循环最后72°C延伸lOmin。PCR扩增体系模板大肠杆菌染色体DNA 2ul， 上下游引物各 Iul，dNTPMIX 4ul, IOXBuffer 5ul，灭菌的双蒸水 41. 5ul, Extaq 酶 0. 5ul。 采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存 放在1. 5ml的离心管中，-20°C冰箱保存备用。
取纯化的PCR产物用EcoR I和Xho I酶切4h，50ul反应体系如下PCR产物25ul， Buffer 5ul，限制性内切酶各3ul，用灭菌的双蒸水补齐，37°C酶切4h。电泳检验酶切产物， 并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。取表达载体pET-28a的质粒25ul用限 制性内切酶EcoR I和Xho I各3ul，Buffer 5ul，加灭菌双蒸水到50ul体系，37°C酶切4h。 电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化盒回收。取纯化的PCR产物 7. 5ul和纯化的表达载体pET-28aO. 5ul，T4DNA连接酶Iul，酶切缓冲液Iul，16°C水浴连接 过夜。取连接产物转入E. coliBL21 (DE3)的感受态细胞进行转化，37°C水浴培养1. 5h后， 培养液涂布含卡那霉素的LB培养基平板，37°C培养箱中培养12h，挑去阳性转化子于IOml 的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-20°C 冰箱保存。取冻管保藏的菌种接入IOml的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日按接种 量转接，37°C培养至OD6c 约0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L，16°C过夜诱导表达， 8000r离心Imin后，收集菌体，加入IX SDS-PAG上样缓冲液，于沸水中煮15min，使其蛋白 质变性，于8000r离心lmin，上清进行SDS-PAGE检测(采用5%的浓缩胶及12%分离胶的 不连续垂直平板电泳进行蛋白分离，考马斯亮兰R-250染色)。以含空载体质粒的pET-28a 的E. coli BL21作为对照。将过夜诱导表达的菌液于8000r/min，4°C离心15min，用pH7. 4 的 PBS 缓冲液洗两次，用提取缓冲液(50mmo 1/LTris-Hc 1，PH8. 5，500mmol/LNaCl，10 % 甘 油，1 % TritionX-IOO)洗一次后超声波破碎菌体，12000r/min离心25min，取上清经Ni-NTA 柱纯化后得到纯的MDH。采用2ml的酶活测定体系(500umol/L0AA，0. 2mmol/LNADH, pH6. O 的缓冲液)，测得粗酶液比酶活为43U/mg，纯酶液比酶活为112. 5U/mg，纯化倍数达2. 62倍， 回收率为59%。粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。苹果酸脱氢酶酶学性质的初步研究(1)最适pH及pH稳定性配制pH2. 0-12. O的 反应缓冲液，37°C下将酶液分别与不同pH的缓冲液混合反应，测MDH在不同缓冲液中反应 时的酶活，观察酶反应的最适PH值。再将一定量的酶液加入到上面不同pH值的缓冲液(不 含底物)中，在37°C中保温lh，测剩余酶活力，观察MDH在不同pH值下的稳定性。(2)最 适温度和热稳定性采用PH值为6. O的反应液，分别在25°C、30°C、37°C、42°C、55°C、65°C、 70°C、80°C温度下测酶活。观察不同温度对酶促反应的影响。在酶液置于以上不同的温度 下保温lh，测定剩余酶活，观察MDH在不同温度下的稳定性。(3)不同金属离子对酶活的影 响选择酶的最适温度和PH值的条件下，在反应体系中分别加入终浓度为2. Ommol/L的K+、 Na+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+，37°C 下测定 MDH 的酶活，以不加上述离子的酶 活为100%，测定不同金属离子对酶促反应的影响。(幻版值及乂！！！狀的测定配制日。!!!!!“/!、 100umol/L、150umol/L、200umol/L、300umol/L、400umol/L、600umol/L 的不同草酰乙酸的底 物溶液分别与酶液在37°C、pH6. O条件下反应，采用双倒数作图法确定MDH的Km及Vmax。 其中反应最适pH值为6. 0，在pH值2. 0-6. O的酸性范围内稳定，反应最适温度为37°C，在 42°C以下酶的稳定性较好。k+对酶有明显的激活作用，Ni2+、Co2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对 酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用，酶活基本没有。酶动力学 参数以草酰乙酸为底物的Km为0. 235mmol/L, Vmax为0. 47umol/L. min。
权利要求
构建重组质粒pET-28a-mdh，其特征是以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-mdh。(1)mdh基因的克隆根据mdh基因的特异性设计引物用该引物特定条件下扩增mdh基因得到939bp的特异型条带。(2)重组质粒pET-28a-mdh转化大肠杆菌BL21(DE3)根据权利要求1所述方法得到重组质粒pET-28a-mdh转化大肠杆菌BL21(DE3)；其特征是将含mdh基因的重组质粒pET-28a-mdh通过转化大肠杆菌感受态细胞转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-mdh。
2.苹果酸脱氢酶的诱导表达及检测根据权利要求(2)得到的重组菌对其进行诱导表达，超声波破碎后测定MDH的酶活力， 并与对照菌株进行比较。其特征是确定了重组菌E. coli BL21(DE3)/pET-28a-mdh的酶活 力相对较高。经测定其粗酶的比酶活可达43U/mg。
3.苹果酸脱氢酶的纯化和酶活检测将过夜诱导表达的菌液于8000r/min，4°C离心15min，用pH7. 4的PBS缓冲液洗两次， 用提取缓冲液洗一次后超声波破碎菌体，12000r/min离心25min，取上清经Ni-NTA柱纯化 后得到纯的MDH。MDH在催化草酰乙酸转化为苹果酸的同时，将NADH氧化为NAD，使得NADH 在340nm处的吸光度不断降低，连续测定酶反应过程中340nm处吸光度的变化即可算出酶 活。酶活力单位(U)定义为在25°C，pH 7.5下，每分钟氧化14!1101的NADH所需的酶量。酶活计算公式如下酶活力单位(U/mL) = (VTX AA340/minXK)/( ε XVs)其中，VT 反应液总体积；Vs 酶液体积；ΔΑ 每分钟吸光度变化值；K 样品稀释倍数。ε 34o nadh = 6. 22 X 106。根据酶活的定义和计算公式，重组菌苹果酸脱氢酶粗酶酶活是43U/mg，纯化后 纯酶酶活是112. 5U/mg。
全文摘要
以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，在E.coliBL21(DE3)中用IPTG诱导表达，利用表达载体pET-28a上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)。粗酶的比酶活为43U/mg，纯化后比酶活达到112.5U/mg，纯化倍数达2.62倍，回收率为59％。并对该酶的酶学性质进行了初步研究，其中反应最适pH值为6.0，在pH值2.0-6.0的酸性范围内稳定，反应最适温度为37℃，在42℃以下酶的稳定性较好。k+对酶有明显的激活作用，Ni2+、Co2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用，酶活基本没有。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235mmol/L，Vmax为0.47umol/L.min。酶学性质的研究为MDH的应用打下了良好的理论基础。
文档编号C12Q1/32GK101864448SQ20101017633
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者夏海锋, 徐美娟, 李倩, 饶志明 申请人:江南大学