专利名称：：一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法
技术领域：
：本发明属生物制剂检测
技术领域：
，具体涉及一种病毒制剂的定量检测方法。
背景技术：
：^K^MM^MW'M^(Ectropisobliquanucleopolyhedrovirus,EoNPV)Mff状病毒科，核型多角体病毒属，该病毒于1977年在我国首次发现。EoNPV是茶尺蠖的病原性天敌，通过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，EoNPV作为一种高效病毒杀虫剂在各省茶区广泛推广使用，对茶尺蠖进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进行检测。也就是说，用病毒产品喂饲茶尺蠖幼虫，看是否发病来确定，因为病毒是专一的，茶尺蠖病毒只能感染茶尺蠖幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在EoNPV病毒制剂的生产、使用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。为了快速有效检测出生物杀虫剂中EoNPV的含量，建立灵敏、特异而又简易的病毒检测方法至关重要。
发明内容鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明通过分子生物学的手段提供了一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法。即根据茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因序列设计一对引物，并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA，进行PCR扩增，将该基因片段与载体PMD18-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒，以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线，基于该标准曲线可以实时监测待测样品中病毒拷贝数，并求出样品中病毒的浓度，用于检测虫体内或生物药剂内EoNPV的绝对含量。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤1)根据茶尺蠖核型多角体病毒的plO基因设计一对引物，引物核苷酸序列如下EoNPVplOF5'-actgctctgcagcaacaagtcg-3‘；EoNPVplOR5'-gtcgttgacggtggtgctaatc-3，；2)从感染茶尺蠖核型多角体病毒的虫体中提取茶尺蠖核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物，PCR扩增得到plO基因片段；3)制备质粒标准品并测定其浓度将扩增获得的plO基因片段与载体pMDIS-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，挑单克隆菌株，摇菌；采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于-20°C冰箱中，备用；重组质粒序列如下5’-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacacc3aaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3’；4)荧光定量PCR反应建立标准曲线将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其实模板数的对数为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测尺蠖核型多角体病毒的标准曲线；5)样品检测提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，计算待测样品的浓度。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤2)中提取尺蠖核型多角体病毒基因组DNA的方法为以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复勻浆，缓冲液体积与虫尸体积比为10l，10000g离心lOmin,重复3次，上清液即为病毒粗提液；病毒粗提液经35000g离心2小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用1XPBS反复洗涤纯化的病毒粒子，至乳白色为止；加入裂解液0.lmol/LNa2C03，0.05mol/LNaCl,pHlO.3裂解多角体l_2h；3000g离心5min，去除其中未裂解的病毒粒子；先用等体积的苯酚氯仿异戊醇=25241的混合液抽提，然后用等体积的氯仿抽提，回收水层；加3mol/LNaAc至终浓度为0.3mol/L，加入2倍体积的冷无水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒将DNA缠出，70%乙醇洗涤，敞口65°C空气浴蒸发残余乙醇，溶于适量IXTE中，4°C保存备用。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤2)中PCR扩增的程序为先94°C预变性3min；然后94°C30s,62°C45s；循环35次，最后72°C延伸lOmin。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤4)中所述的荧光定量PCR反应采用20iiL体系质粒标准品模板2iiL，SYBRPremixExTaqTM(2X)10uL,ROXReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加灭菌双蒸水至20uL；反应程序为95°C10s；95°C5s,60°C34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤4)中所述的梯度为1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103拷贝/uLo上述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，通过采用荧光定量PCR，与血清学方法及传统PCR相比，在病毒检测上有如下优点(1)省时。荧光定量PCR无需PCR电泳检测，可以实时观察结果，同时由于扩增片段一般在100-200bp，缩短了反应时间，多数情况下在1.5h左右内完成。(2)灵敏度高。荧光定量PCR通过检测荧光信号使其具有较高的灵敏性，在本实验中，荧光定量方法比传统的血清学记数法的灵敏度高1000倍。(3)高通量。该方法可实现96个样本的同时检测。(4)可重复性好。由于荧光定量PCR仪的闭管操作的方式，大大降低了污染和假阳性出现的机率。本方案不仅能够使EoNPV的流行病学的研究微观化、精确化，还解决了我国在茶尺蠖病毒研究及应用中依赖于单一传统生物测定的问题，实现了病毒制剂加工和使用的全程监控，有效的规范茶园生物农药市场，保护茶农利益。图1为plO基因PCR扩增产物图1中:1-DL2000Marker；2-plO基因PCR扩增产物；图2为重组质粒pMD18T_plO的PCR扩增产物图；图2中1_DL2000Marker；2-重组质粒pMD18T_plO的PCR扩增产物；图3为EoNPVplO基因扩增的熔解曲线图；图4为EoNPVPCR扩增产物的熔解曲线图；图5为EoNPVplO基因不同稀释梯度的荧光定量PCR标准曲线图。具体实施例方式现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。实施例1、EoNPV病毒样品的获得及其基因组DNA的提取以茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)感染茶尺蠖幼虫，收集100头染毒虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复勻浆，缓冲液体积与虫尸的体积比为10l，10000g离心lOmin，重复3次，去除沉淀，上清液即为病毒粗提液；病毒粗提液经35000g离心12小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用1XPBS反复洗涤纯化的病毒粒子，至乳白色为止；加入0.lmol/LNa2C03,0.05mol/LNaCl,pHlO.3的裂解液5mL，裂解茶尺蠖核型多角体病毒粒子多角体病毒粒子l-2h;3000g离心5min，吸取上清液，去除其中未裂解的茶尺蠖核型多角体病毒粒子；先用等体积的苯酚氯仿异戊醇=25241的混合液抽提，然后用等体积的氯仿抽提，回收水层；加3mol/LNaAc至终浓度为0.3mol/L,加入2倍体积的冷无水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒将DNA缠出，70%乙醇洗涤，敞口65°C空气浴蒸发残余乙醇，溶于适量IXTE中，4°C保存备用。实施例2、目的片段PCR扩增根据EoNPV基因组序列(NC_008586.1)的plO基因，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物EoNPVplOF和EoNPVplOR，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列分别为5’-actgctctgcagcaacaagtcg-3’(见序列表SEQNo.1)和5，-gtcgttgacggtggtgctaatc-3，(见序列表SEQNo.2)，扩增plO,PCR反应采用25iiL体系(模板21^，10\131^作『2.5uL,dNTP2yL，正反引物各0.5yL，Tag酶0.25yL，加灭菌双蒸水至25yL)，PCR扩增使用两步法，程序如下先94°C预变性3min；然后94°C30s,62°C45s；循环35次，最后72°C延伸lOmin。取PCR产物10ul于琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，与预计大小相一致。最后，用琼脂糖凝胶DNA试剂盒纯化回收扩增片段，按说明书操作进行。实施例3、质粒标准的制备及其浓度测定将实施例2中扩增的plO基因片段与载体pMDIS-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，挑单克隆菌株，摇菌。使用试剂盒抽提单菌落质粒DNA，进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒送至上海生工生物技术有限公司测序。与参考序列进行比较，确认构建结果，构建完毕后用紫外分光光度计测定其浓度，将1PL阳性质粒稀释100倍测定其0D26(i和0D28(i值，计算重组质粒浓度及0D26(i/0D28Q比例，将重组质粒稀释至10,拷贝/yL，保存于-20°C冰箱中。重组质粒PCR鉴定结果见图2，片段大小为120bp，与预期结果相符。重组质粒的测序结果如下5，-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacaccaaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3，。实施例4、荧光定量PCR反应采用20iiL体系模板2iiL，SYBRPremixExTaq(2X)10uL,ROXReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加灭菌双蒸水至20iiL。反应程序为95°C10s；95°C5s,60°C34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。荧光定量实验中的SYBRPremixExTaq(2X)和ROXReferenceDyeII均为Takara公司产品，荧光定量PCR仪型号为ABIPRISM7500。实施例5、标准曲线的建立及其灵敏性将含有目的片段的质粒标准品按10倍系列稀释成1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.OX105、1.OX104、1.OX103拷贝/yL的模板，将各浓度标准重组质粒的扩增产物进行定量PCR熔解曲线分析，结果见图3，与预期完全相符，均为单峰，无非特异性扩增，说明反应特异，表明该方法有良好的特异性。将以上各浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，扩增的荧光曲线见图4，表明该方法检测灵敏度可达到1.0X103拷贝/i!L。反应结束后取PCR反应液，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。实验结束后，使用excel进行数据分析，以其实模板数的对数为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测EoNPV的标准曲线，标准曲线见图5，斜率为-2.9369，截距为38.948，R2=0.989，从而可以得出标准曲线为y=-2.9369x+38.948。通过标准曲线，可以求出待测样品的拷贝数。实施例6、FQ-PCR重复性将质粒标准品稀释成3个浓度，模板DNA含量为1.0X108、1.0X107、1.0X106拷贝/PL，对每个浓度的样品经荧光定量PCR进行定量分析，分别重复3次检测，批内和批间重复性通过计算CT值的标准差(SD)和变异系数(CV)进行评价。实验结果见表1，浓度为1.0X108、1.0X107、1.0X106拷贝/yL的质粒标准品其平均CT值分别为15.30、17.43、20.44。经过数据分析得知，标准差(SD)分别为0.26、0.18,0.34，变异系数(CV)分别为1.7%、1.65%、1.01%，证明此方法批间的重复性良好。表1阳性质粒的重复检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例7、病毒制剂样本检测以实施例5中建立的标准曲线为检测依据，对实验室保存的经血清学方法检测的EoNPV-BT混合生物农药进行检测，首先将其稀释成1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.OX104PIB/ml，分别提取基因组，以该基因组为模板按实施例4中的荧光定量PCR方法进行扩增。对4种不同浓度的EoNPV-BT样品进行荧光定量PCR检测，结果所测的CT值呈明显的梯度分布，分别为14.8,17.2,21.0,24.8，按所建标准曲线计算得到病毒浓度分别为107_2、106_3、105、1038PIB/ml。血清学方法所测病毒浓度为1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104PIB/ml。两组病毒样品检测数据的变异系数在1.4%3.6%，小于5%。表明用本方案的荧光定量PCR方法与传统血清学方法所测结果基本一致，可用于检测茶尺蠖核型多角体病毒制剂的EoNPV含量。表2EoNPV病毒样品检测结果血清学方法检测荧光定量PCR检测标准差变异系数样品号(Log病毒数)(Log病毒数)SD(CV%)17.07.20.142.0%26.06.30.213.4%35.05.10.071.4%44.03.80.143.6%权利要求一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤1)根据茶尺蠖核型多角体病毒的p10基因设计一对引物，引物核苷酸序列如下EoNPVp10F5’-actgctctgcagcaacaagtcg-3’；EoNPVp10R5’-gtcgttgacggtggtgctaatc-3’；2)从感染茶尺蠖核型多角体病毒的虫体中提取茶尺蠖核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物，PCR扩增得到p10基因片段；3)制备质粒标准品并测定其浓度将扩增获得的p10基因片段与载体pMD18-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，挑单克隆菌株，摇菌；采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于-20℃冰箱中，备用；重组质粒序列如下5’-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacaccaaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3’；4)荧光定量PCR反应建立标准曲线将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其实模板数的对数为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测尺蠖核型多角体病毒的标准曲线；5)样品检测提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，计算待测样品的浓度。2.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤2)中提取尺蠖核型多角体病毒基因组DNA的方法为以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复勻浆，缓冲液体积与虫尸体积比为101，10000g离心lOmin，重复3次，上清液即为病毒粗提液；病毒粗提液经35000g离心2小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用1XPBS反复洗涤纯化的病毒粒子，至乳白色为止；加入裂解液0.lmol/LNa2C03，0.05mol/LNaCl，pH10.3裂解多角体l_2h；3000g离心5min，去除其中未裂解的病毒粒子；先用等体积的苯酚氯仿异戊醇=25241的混合液抽提，然后用等体积的氯仿抽提，回收水层；加3mol/LNaAc至终浓度为0.3mol/L，加入2倍体积的冷无水乙醇，混勻后于-20°C放置30min；用玻璃棒将DNA缠出，70%乙醇洗涤，敞口65°C空气浴蒸发残余乙醇，溶于适量1XTE中，4°C保存备用。3.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤2)中PCR扩增的程序为先94°C预变性3min；然后94°C30s,62°C45s；循环35次，最后72°C延伸lOmin。4.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤4)中所述的荧光定量PCR反应采用20yL体系质粒标准品模板2uL，SYBRPremixExTaqTM(2X)10uL,R0XReferenceDyeII0.4iiL，正反引物各0.4iiL，加灭菌双蒸水至20iiL；反应程序为95°C10s；95°C5s,60°C34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。5.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于步骤4)中所述的梯度为1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103拷贝/yLo全文摘要一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，属生物制剂检测
技术领域：
，其特征在于包括以下步骤根据茶尺蠖核型多角体病毒基因序列设计一对引物，并从感染该病毒的虫体中提取茶尺蠖核型多角体病毒基因组DNA，进行PCR扩增，将该基因片段与载体pMD18-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒，以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好，相关系数为0.989，检测范围为103～108拷贝/μL，特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数，为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。文档编号C12Q1/68GK101831508SQ201010185410公开日2010年9月15日申请日期2010年5月27日优先权日2010年5月27日发明者付建玉,唐美君,杜军利,肖强申请人:中国农业科学院茶叶研究所