专利名称：生物芯片高通量杂交的方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片，特别是涉及一种在毛细管内或微流控芯片上进行高通量核 酸杂交的方法。
背景技术：
生物芯片是将大量的生物分子或材料(如核酸片段、蛋白质、药物或受体、细胞或 组织等)按照预先设计的排列方式固定在载体表面，以此作为探针，与样品中待测物进行 特异性的吸附或反应，实现对样品信息的检测。成千上万的反应在一块芯片上同时进行，具 有大规模并行分析的能力。生物芯片一般加工在玻璃片、硅片、尼龙膜等载体材料上，探针 阵列的制作方法主要有点样法(Schena M, Shalon D, Davis R ff. et al. Science.，1995， 20 467-470)和原位合成法(Fodor S P A, Read J L,Pirrung M C, et al. Science, 1991, 251 :767-773)。将样品覆盖在探针阵列表面进行杂交反应，然后进行检测(范金坪，中国医 学物理杂志，2009，26 :1115-1117)。但生物芯片需要比较长的杂交反应时间，一般要几个小 时到十几个小时；一块芯片只用于一次杂交反应。毛细管成本低廉，用来进行生物芯片分析能够降低加工难度，有效减少成本。而 且常规生物芯片的杂交过程受扩散过程的控制，一般杂交反应需要十几个小时，而在毛细 管类似尺寸的微通道内进行杂交反应由于流动杂交过程促进混合而且扩散距离短，能够缩 短反应时间、增强检测信号、提高检测灵敏度(Benn J A, Hu J, Hogan B J, et al. Anal. Biochem.，2006，348 =284-293)。授权公告号为CN2483395Y的实用新型专利公开一种内设 有毛细纤维丝(条)的透明毛细管作为毛细管生物芯片装置，该装置将点样线、相应标记 物、阳性和阴性对照线制作在毛细纤维丝(条)上，然后插在毛细管内，分析时通过毛细管 的毛细作用将样品吸入到毛细管内并浸渍毛细纤维丝(条)，样品中的待测物与毛细纤维 丝(条)上的点样物和标记物发生杂交反应。这一方法，点样物和标记物是制作在毛细管 内的毛细纤维丝(条)上，而不是毛细管的管壁上。而且一般只是用于一次杂交反应，即只 用于检测一个样品。如要检测多个样品，需要加工多根毛细管芯片，降低了分析效率。微流控芯片是利用各种微加工技术在芯片材料(如玻璃、PDMS或PMMA等其他材 料)上加工出具有各种功能的微结构，实现反应、分离、检测等功能，最大限度地把实验室 的功能集成到便携的芯片上。自20世纪90年代初Manz和Widmer等(ManzA，GraberN， WidemerH M. Sens. Acturators, B，1990，B1 244)首次提出以来，微流控芯片技术得到了 快速发展，已经从单纯的化学分析扩展到各个方向，包括核酸分析、蛋白质分析和细胞分析 等。在微流控芯片上进行生物芯片分析，能够有效增强检测信号、提高灵敏度、减少试剂和 样品消耗、缩短分析时间等(Chen H, Wang L, Li P C H. Lab Chip, 2008,8 =826-829) 已 有报道在微流控芯片上进行核酸杂交分析(Wang L，Li P C H. J. Agric. Food Chem.，2007， 55 :10509-10516)，将杂交反应时间缩短到5min以内，但一般还只是用于一次杂交反应，即 只用于检测一个样品。如要检测多个样品，需要加工多块芯片，极大地降低了分析效率。
发明内容
本发明的目的在于针对上述方法存在的缺点，提供一种生物芯片高通量杂交的方 法。本发明包括以下步骤1)将溶液引入到微通道内；2)样品溶液进入微通道后，样品分子会由于序列互补或亲和作用而与特定的探针 产生特异性的结合而被保留在特定探针所在区域，根据探针的信息获得样品分子的相应信 息；3)样品分子已经条形码标记、荧光标记、量子点标记、光子晶体标记、拉曼标签标 记、红外光谱标记、电化学标记等中的至少一种进行标记，判断样品分子是否被保留在探针 区域以及保留所在位置等信息；4)检测完成后，利用变性将已结合在探针上的样品分子从探针上洗脱下来并清洗 干净，恢复探针阵列；5)恢复探针阵列后，加入另一种样品，进行杂交反应和检测，重复这一过程，实现 生物芯片高通量杂交。在步骤1)中，所述将溶液引入到微通道内，可将微通道的入口插入到储液池或小 试管中将溶液通过入口引入到微通道内；所述微通道可为毛细管或微流控芯片等，所述毛 细管可为玻璃毛细管、石英毛细管或高聚物毛细管等，所述毛细管的管径可为lnm 5cm; 所述毛细管设有至少1根，多根毛细管可以并联或串联；所述微流控芯片可为玻璃微流控 芯片、石英微流控芯片、硅微流控芯片或高聚物微流控芯片等；所述微流控芯片的通道尺寸 可为lnm 5cm;所述微通道可以是不同的形状，如直形通道，也可以是盘管形通道，也可以 是矩形通道，也可以是螺旋形通道；所述通道可以是单根通道，也可以是多根平行通道。在步骤2)中，所述样品溶液进入微通道后，样品溶液在微通道内流动，所述流动 的驱动力可由电场、毛细作用、表面张力或者由连接在通道出口的注射泵、重力等提供。在步骤3)中，所述判断样品分子是否被保留在探针区域以及保留所在位置等信 息，可利用相应方法对这些标记进行检测，从而判断样品分子是否被保留在探针区域以及 保留所在位置等信息。在步骤4)中，所述变性包括热变性、极端pH值变性、离子强度变性、变性剂变性等。所述探针和样品可以是核酸\小分子化合物、多肽、蛋白质、抗原、多糖、配体、药 物、受体、细胞或组织等能产生亲和作用的生物、有机物质或无机物质。本发明的优点在于在样品消耗少的情况下，能简单有效地在封闭的微通道内进 行核酸杂交反应，对样品进行分析，然后利用变性技术，实现在毛细管或同一块芯片上进行 多个样品的高通量分析，降低对昂贵仪器的依赖，降低分析成本，加快分析速度。
图1是根据本发明的与固定有探针阵列的毛细管进行杂交反应的示意图。图2是根据本发明的与多根平行毛细管同时进行杂交反应的示意图。图3是根据本发明的采用注射器作为驱动力的杂交反应的示意图。
图4是根据本发明的两个不同样品与探针阵列杂交的荧光信号强度。在图4中， 横坐标为样品溶液浓度(nM)，纵坐标为荧光信号强度；其中a为CLN1 ’，b为CLN5’。图5是根据本发明的与固定有探针阵列的微流控芯片上进行杂交反应的示意图。图6是根据本发明的在多根平行通道同时进行杂交反应的示意图。图7是根据本发明的在螺旋通道的微流控芯片上进行杂交反应的示意图。图8是根据本发明的采用毛细管作为入口的微流控芯片上进行杂交反应的示意 图。图9是根据本发明的采用注射器作为驱动力的杂交反应的示意图。图10是根据本发明的两个不同样品与探针阵列杂交的荧光信号强度。在图10中， 横坐标为样品溶液浓度(P M)，纵坐标为荧光信号强度；其中a为ALN1，b为ALN5。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例1参见图1，毛细管1的入口插入到储液小试管A中，储液小试管A间隔排列分别装 有样品溶液2、清洗缓冲液3和变性剂4。毛细管1的出口与一水平储液池5相连，利用重 力驱动液体流动。探针阵列已经预先固定在毛细管内壁上7，让样品流经整个通道并发生杂 交反应，反应完成后清洗通道6并进行检测，然后再让变性剂流经通道对已杂交样品进行 变性，样品分子脱离探针并被清洗干净，恢复探针阵列。重复这一过程完成样品的高通量分 析。图4是两种不同浓度的样品溶液加入到毛细管内进行杂交反应得到的信号强度 图。实施例2参见图2，毛细管1为多根平行毛细管，每根毛细管均有一个入口和出口进行，多 个平行的生物芯片分析。在图2中，其它标记与图1相同。实施例3参见图3，毛细管1的出口连接有一根注射器5，用于驱动液体在微通道内的流动。 在图3中，其它标记与图1相同。实施例4参见图5，芯片1的微通道3呈盘管状，探针阵列8预先固定在微通道内表面，其入 口 2加工呈尖针状，插入到储液小试管B中。储液小试管B间隔排列分别装有样品溶液5、 清洗缓冲液6和变性剂7。出口与一水平储液池4相连，利用重力驱动液体流动，首先让样 品流经整个通道并发生杂交反应，反应完成后清洗通道9并进行检测，然后再让变性剂流 经通道对已杂交样品进行变性，样品分子脱离探针并被清洗干净，恢复探针阵列。重复这一 过程完成样品的高通量分析。图10是两种不同样品加入到微通道内进行杂交反应得到的信号强度图，其中探 针阵列分别是使用不同浓度的探针溶液在通道内表面进行固定反应得到。实施例5参见图6，芯片1的微通道3为一根或多根平行通道，每根通道均加工有一个入口和出口，进行多个平行的生物芯片分析。在图6中，其它标记与图5相同。实施例6参见图7，微通道3呈螺旋形，用于生物芯片分析。在图7中，其它标记与图5相 同。实施例7参见图8，其微通道入口由一小段石英毛细管代替，在芯片侧面对准微通道的位 置，利用钻头钻一小孔，插入一小段石英毛细管并用胶水固定作为通道入口。在图8中，其 它标记与图5相同。实施例8参见图9，其微通道出口处连接有一根注射器4，用于驱动液体在微通道内的流 动。在图9中，其它标记与图5相同。
权利要求
生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于包括以下步骤1)将溶液引入到微通道内；2)样品溶液进入微通道后，样品分子会由于序列互补或亲和作用而与特定的探针产生特异性的结合而被保留在特定探针所在区域，根据探针的信息获得样品分子的相应信息；3)样品分子已经条形码标记、荧光标记、量子点标记、光子晶体标记、拉曼标签标记、红外光谱标记、电化学标记等中的至少一种进行标记，判断样品分子是否被保留在探针区域以及保留所在位置等信息；4)检测完成后，利用变性将已结合在探针上的样品分子从探针上洗脱下来并清洗干净，恢复探针阵列；5)恢复探针阵列后，加入另一种样品，进行杂交反应和检测，重复这一过程，实现生物芯片高通量杂交。
2.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤1)中，所述将 溶液引入到微通道内，是将微通道的入口插入到储液池或小试管中将溶液通过入口引入到 微通道内。
3.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤1)中，所述微 通道为毛细管或微流控芯片。
4.如权利要求3所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤1)中，所述毛 细管为玻璃毛细管、石英毛细管或高聚物毛细管，所述毛细管的管径为Inm 5cm;所述毛 细管设有至少1根，多根毛细管为并联或串联；所述微流控芯片为玻璃微流控芯片、石英微 流控芯片、硅微流控芯片或高聚物微流控芯片；所述微流控芯片的通道尺寸为Inm 5cm。
5.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤1)中，所述微 通道为直形通道、盘管形通道、矩形通道或螺旋形通道。
6.如权利要求5所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤1)中，所述通 道为单根通道或多根平行通道。
7.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤2)中，所述样 品溶液进入微通道后，样品溶液在微通道内流动，所述流动的驱动力由电场、毛细作用、表 面张力或者由连接在通道出口的注射泵、重力提供。
8.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤3)中，所述判 断样品分子是否被保留在探针区域以及保留所在位置信息，是对所述标记进行检测，从而 判断样品分子是否被保留在探针区域以及保留所在位置信息。
9.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于在步骤4)中，所述变 性为热变性、极端PH值变性、离子强度变性或变性剂变性。
10.如权利要求1所述的生物芯片高通量杂交的方法，其特征在于所述探针和样品是 核酸\小分子化合物、多肽、蛋白质、抗原、多糖、配体、药物、受体、细胞或组织能产生亲和 作用的生物、有机物质或无机物质。
全文摘要
生物芯片高通量杂交的方法，涉及生物芯片。将溶液引入到微通道内；样品溶液进入微通道后，样品分子会由于序列互补或亲和作用而与特定的探针产生特异性的结合而被保留在特定探针所在区域，根据探针的信息获得样品分子的相应信息；样品分子已经条形码标记、荧光标记、量子点标记、光子晶体标记、拉曼标签标记、红外光谱标记、电化学标记等中的至少一种进行标记，判断样品分子是否被保留在探针区域以及保留所在位置等信息；检测完成后，利用变性将已结合在探针上的样品分子从探针上洗脱下来并清洗干净，恢复探针阵列；恢复探针阵列后，加入另一种样品，进行杂交反应和检测，重复这一过程，实现生物芯片高通量杂交。
文档编号C12Q1/02GK101851680SQ20101019392
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者瞿祥猛, 陈宏 申请人:厦门大学