专利名称：结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治疗结核病药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，具体地说是结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷 酸合成酶，作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结核病及发病期结核病药物的应用。
二.
背景技术：
结核病是严重危害人类健康的传染病，由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，简称结核杆菌)慢性感染引起，是目前传染病中仅次于艾滋病的第二号杀 手。我国结核病的严重程度居世界第二位，据第四次结核病流行病学抽样调查，全国1/3人 口潜伏感染结核杆菌，总耐药率为27. 8%。目前一线抗结核药物均为上世纪五六十年代发 明，且都针对发病期活跃的结核杆菌，而对于潜伏感染的结核杆菌尚未发现有效药物。现有 的抗结核药物和治疗方案远不够理想，严峻的结核病回升形势迫切要求加速新型抗结核药 物靶标的发现和新药研发。人体在感染结核杆菌后，巨噬细胞通过产生趋化因子来募集单核细胞、淋巴细胞 和中性粒细胞，形成肉芽肿结构[Crevel R，0ttenhoff TH，Meer JW(2002). Clin Microbiol Revl5 294-308]，造成低氧、酸性pH和毒性脂肪酸等环境，使得绝大部分细菌被杀死，而部 分结核杆菌则可以进入潜伏态、以无症状和不传播的方式存在数十年。若人体免疫力强， 则可将感染控制在潜伏期，若免疫力下降，或因艾滋病、营养不良、衰老或其它因素，肉芽肿 中的结核杆菌则能恢复增殖，并逃逸和诱发形成急性肺结核。最新研究显示，结核杆菌三 元信号系统DosR/DosS/DosT与其潜伏感染相关，该系统通过感应外界低氧等不利环境、调 控约50个基因上调表达，从而促进结核杆菌进入潜伏态[Voskuil MI, Schnappinger D， ViscontiKC et al(2003). J Exp Med 198 705-713 ；Leistikow RL,Morton RA,Bartek IL et al(2010). JBacteriol 192:1662-1670]。Klein MR 等学者已经于 2008 年将该三元信 号系统申请了美国专利(专利号US2008/0311159A1)，以保护其作为潜伏期结核病治疗的 药物靶标。然而，我们的研究结果和其它动物实验证明该三元系统本身并不足以调控结核 杆菌潜伏感染的所有能力[Converse PJ, Karakousis PC, Klinkenberg LG er al (2009). Infect Immun 77 :1230-1237]，其潜伏感染还受其它基因调控，这些基因有望开发成为潜 伏期结核病治疗的新型药物靶标。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是近十余年发现的细菌胞内第二信使，由二分子cGMP通 过3' ,5'-磷酸二酯键连接而成。目前研究表明，c-di-GMP只存在于真细菌，而在人类、 哺乳动物和古细菌均没有合成酶编码基因及效应靶位。c-di-GMP在细胞内的水平分别受到 含GGDEF结构域(二鸟苷酸环化酶活性)和EAL结构域(磷酸二酯酶活性)蛋白的正向和 负向调节，调控细菌生物膜形成、耐药性或毒力因子表达等生理过程[RSmlingU，R0hde M， Olsen A et al(2000).Mol Microbiol 36 10-23 ；Hoffman LR,D'Argenio DA,MacCoss MJ et al (2005). Nature 436:1171-1175 ；Brouillette E,Hyodo M,Hayakawa Y et al(2005). AntimicrobAgents Chemother 49 3109-3113 ；Karaolis DKR,Rashid MH,Chythanya R et
3al(2005). Antimicrob Agents Chemother 49:1029-1038.]。序列分析表明，在数十株已 测序的结核杆菌菌株基因组上，均有一个c-di-GMP合成酶基因，编码蛋白含有GAF、GGDEF 和EAL共3个结构域，并与分枝杆菌属其它种的相关基因具有高度相似性。2008年，印 度学者通过将快速生长的非致病型分枝杆菌耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 的c-di-GMP合成酶基因进行缺失突变，发现突变菌株在饥饿条件下的长期生存能力减弱 [Kumar M, Chatter ji D. Microbiology 2008,154:2942-2955]。然而，c-di-GMP 作为信号 分子在结核杆菌及其它致病性分枝杆菌中的生理作用尚未见报道，c-di-GMP及其衍生物作 为新型药物分子用于治疗结核病的可能性尚未被探索。
三.
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供结核分枝杆菌胞内二级信 使环二鸟苷酸合成酶作为治疗潜伏期结核病及急性结核病的新型基因靶标，该合成酶在结 核分枝杆菌H37Ra菌株中的基因编号为MRA 1362，根据蛋白功能命名为DGC (以下将环二 鸟苷酸合成酶简称为DGC)，其蛋白氨基酸序列在所有结核杆菌及其它分枝杆菌中具有保守 性，其基因编码的蛋白由GAF、GGDEF和EAL三个公知的蛋白结构域组成，由623氨基酸组 成，分子量67. 7kDa;该基因的功能可拓展至其它结核杆菌中的同源基因、突变基因。涉及结核病(Tuberculosis)致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的胞内二级信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)和c-di-GMP合成蛋白(DGC)在氧 气感应和潜伏感染方面的生理功能。通过异源表达该蛋白、体外性质分析，发现DGC蛋白的 GAF结构域结合有可感应02/N0/C0气体的血红素，同时GGDEF结构域能够将GTP转化生成 c-di-GMP ；通过基因敲除和生理学实验等，发现DGC主要调控与结核杆菌潜伏感染能力相 关的系列基因，敲除突变菌株在低氧条件下的胞内还原力水平和生长恢复能力等均弱于野 生型菌株。这些结果表明，c-di-GMP合成基因调控了结核杆菌在低氧状态下的潜伏能力， 该基因可作为潜伏期感染结核病治疗的新型药物靶标，也可作为发病期结核病治疗的药物 靶标，其效应分子为一氧化氮(N0)、一氧化碳(C0)供体和c-di-GMP及其衍生物、类似物。本发明提供了 GAF结构域的功能，该结构域结合了血红素，通过血红素络合的铁 离子感应外界低氧、N0/C0环境，作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结核病及发病期结核病 药物的应用。本发明提供了 GGDEF结构域的功能，该结构域具有环二鸟苷酸环化酶活性，能将 GTP转化形成c-di-GMP，作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结核病及发病期结核病药物的应用。本发明提供了 DGC感应外界低氧、N0/C0环境，进而通过c-di-GMP信号转导调控结 核杆菌潜伏干扰能力的生理学功能，DGC缺失不影响细菌的生长，但能导致结核杆菌在低氧 环境下生长时氧气过快消耗，导致低氧环境下细胞内辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水 平低于野生型菌株，导致低氧环境下与结核杆菌潜伏能力相关基因下调表达，导致低氧环 境下的存活力下降，导致结核杆菌从低氧环境进入氧气充足环境恢复生长的能力下降。本发明的优点是目前人们对结核杆菌DGC蛋白感应外界环境、进而通过 c-di-GMP信号转导调控潜伏感染能力的认识和了解仅限于本发明所作的科学研究。DGC蛋 白的GAF结构域结合有可感应02/N0/C0气体的血红素，同时GGDEF结构域能够将GTP转化
4生成c-di-GMP ；通过基因敲除和生理学实验等，发现DGC主要调控与结核杆菌潜伏感染能 力相关的系列基因，敲除突变菌株在低氧条件下的胞内还原力水平和生长恢复能力等均弱 于野生型菌株。这些结果表明，c-di-GMP合成基因调控了结核杆菌在低氧状态下的潜伏能 力，该基因可作为潜伏期感染结核病治疗的新型药物靶标，也可作为发病期结核病治疗的 药物靶标，其效应分子为一氧化氮(NO)供体、一氧化碳(CO)供体、c-di-GMP和c-di-GMP衍 生物。
四.
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。图1为本发明DGC的结构域特征。图2为本发明DGC基因敲除的自杀性质粒pNK-DGC示意图。图3为本发明DGC基因敲除菌株的PCR验证电泳图谱。图4为本发明DGC基因回补质粒pUC-DGC-INT示意图。图5为快速耗氧模型中ADGC和WT菌株的生长曲线。图6为快速耗氧模型中A DGC和WT菌株的NAD、NADH水平及NAD/NADH比率。图7为实时荧光定量RT-PCR检测三种菌株与结核杆菌潜伏能力相关基因的转录 表达水平。图8a、8b为本发明DGC蛋白的可见光谱吸收曲线。图 9a、9b 为 DGC 将 GTP 转化为 c-di-GMP。
五.
具体实施例方式1. c-di-GMP合成酶DGC基因敲除质粒构建⑴利用高保真聚合酶PCR扩增DGC的5’ -和3’ -侧翼序列各约lkb， 引物为AAGCTTGGTCTGGGAGAACCACTTGA、CTCCACTCGGATGCTATCTGTG、AGCCTTCCAGACGCATAACT 和 CCGCACAGATAGCATCCGAGTGGAGGTGCCGTAACGGCAA。PCR 拼接后，形成剔除 DGC 开放读码框 (0RF，见DGC的基因序列、DGC基因所编码的蛋白序列、附图1)的2kb片段；(2)此片段通过Hindlll和Kpnl双酶切，连接入plNIL载体，形成pN_DGC质粒。(3)将pG0AL19质粒用PacI酶切，回收含sacB-lacZ-hyg共3个筛选基因的片段， 插入到同样处理的PN-DGC上，获得最终的基因敲除质粒pNK-DGC(见附图2)。感受态细胞制备结核分枝杆菌H37Ra在公知的7H9液体培养基(BD公司)中于 37士2°C (以下实验均同)培养6d，至菌悬液终0D6QQ为0.4-1.0，室温下500(^离心收集细 胞，用等体积10%甘油洗涤2次以上，制成0D为3-5的感受态细胞。转化、筛选与验证(1) pNK-DGC质粒1-4 ii g加入到200 ill感受态细胞中，利用电转仪电击转化，电压 25kV、电阻 1000、电容 25 u F。(2)电转物于l_2ml 7H9液体中孵育至少20h，然后涂布于含50 ii g/ml X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷)和50-100 u g/ml潮霉素(Hyg)的公知的 7H10固体培养基(BD公司)平板上，37°C静置培养2_5周至出现蓝色克隆(为pNK_DGC单
5交换插入到基因组上形成的转化子)。(3)挑取蓝色克隆于7H9液体或7H10平板上培养8d以上，然后将这些菌涂布于含 X-gal和2%蔗糖的7H10平板上培养数周至克隆出现。(4)挑取白色克隆(舍弃蓝色克隆)进行PCR检验，引物为 GATCTTTCATGGGCTATTGGG 和 CAGCCTTCCAGACGCATAACT，目标敲除菌株 A DGC 和野生型菌株 WT 的片段大小分别为2. 3kb和4. 2kb，与理论大小吻合(见附图3)。(5)2. 3kb片段克隆到pUC19载体上，进行测序验证，结果表明ADGC菌株中不含有 DGC 0RF 序列。2.DGC基因回补将DGC的0RF及其启动子序列连接到pUC-INT载体中，形成基因回补质粒 pUC-DGC-INT (见附图4)，该质粒能够通过噬菌体整合酶介导插入基因组的特定位点，形成 单拷贝克隆。将该质粒电击转化ADGC感受态细胞，电转物于含20i!g/ml庆大霉素的7H10 平板上培养，筛选基因回补菌株ADGC: :DGC(命名为Com-DGC)。3.体外快速耗氧模型150ml血清瓶中加入60ml公知的DTA培养液(BD公司)，以对数期种子接种到培养 液至终0D = 0.02，培养物与顶空空气比为1 1.5，瓶口用丁基胶塞和铝盖封紧，于37°C、 220rpm快速振摇培养。随着细菌生长，顶空氧气快速消耗，从而造成低氧/缺氧状态。不同 天数培养物用注射器取样，以进行以下各种数据分析。4. DGC缺失不影响生长速率通过测定0D_评估细菌生长速度，结果显示，快速耗氧条件下A DGC的生长速率 与WT无明显差异，6d后达到高峰，终0D约为0. 85 (见附图5)。5. DGC缺失导致生长时氧气过快消耗快速耗氧条件下，培养液中加入0. g/1亚甲基蓝，用于指示氧气消耗程度。实 验条件下，ADGC在160h时指示剂蓝色消失，表明氧气几乎耗尽；WT菌株在172h时蓝色消失。6. DGC缺失导致胞内NAD水平降低在低氧条件下(约培养6d后)，ADGC的胞内NAD水平低于WT菌株，而两者的NADH 水平基本相近(见附图6)。第20d时，几乎无法检测到ADGC的NAD。NAD的检测参考文献 [Leistikow RL et al. J Biotechnol 2010，192 :1662—1670]。7. DGC缺失使得已知与结核杆菌潜伏相关的部分基因下调表达在亚甲基蓝褪色后3h取样，用Trizol抽提RNA。50ng总RNA用逆转录试剂盒 (TAKARA公司)进行逆转录形成cDNA第一链模板，该模板用One step PrimeScript RT-PCR 试剂盒(TAKARA)配制反应液，然后用ABI StepOne实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量 RT-PCR，检测已知与结核杆菌潜伏相关的部分基因的mRNA表达水平。以16S RNA基因为内 参，发现ADGC中NarK2和OtsBl的表达水平低于WT菌株(见附图7)。16S RNA基因的引 物为 GGGCGATACGGGCAGACTAGAG 和 CGTTTACGGCGTGGACTACCAG (扩增长度 184bp)，Ostbl 基因 的引物为 TCGGTCACGCTGGAAAAGGTC 和 GGTATGCGGCGAAATGGTCTG (扩增长度 246bp)，NarK2 基 因的引物为 ATGGTCGTGCTTCGTGATGC 和 TGATGTAGGTGGGCAGGTAGTTG (扩增长度 166bp)。8. DGC缺失引起生长恢复能力缺陷
培养3d后，每天取样涂布平板(氧气充分条件下生长)，发现ADGC在平板上恢复 生长形成肉眼可见克隆的时间比WT菌株至少延迟6d，说明DGC缺失减弱了结核杆菌从低氧 状态进入氧气充足状态恢复生长的能力。另一方面，低氧状态培养40d时，ADGC在平板上 几乎不能恢复生长，说明经低氧处理后，细菌在实验条件下已经失去生长恢复能力。9. DGC是血红素结合蛋白DGC连接到pET28a载体上，转化大肠杆菌DH5 a，转化子在LB液体培养基中37°C 培养至0D = 0. 5-0. 8，加入0. 1-l.OmM的异丙基-3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，同 时加入10iiM的高铁血红素(Hemin)，温度降至16_30°C，10h后收集菌体，超声破碎细胞。 破碎液离心去除碎片，上清液在25mM Tris-Cl(pH8. 0)中透析，然后用镍柱纯化蛋白。分离纯化获得的蛋白质溶液呈红色，波长扫描分析表明，蛋白溶液在530nm和 560nm处有小的吸收峰，为血红素螯合铁的典型吸收峰，同时在410nm处具有典型的血红素 结合蛋白尖锐吸收峰，表明血红素与Fe有6个配位键(见附图8)。因此，DGC是血红素结 合蛋白，其中GAF结构域是血红素结合区，而已知的GAF结构域多为cAMP/cGMP/GTP结合部 位。该结果有力阐释了 DGC为什么能够响应外部缺氧环境，即通过GAF结构域中的血红素 “感知”外部环境中氧气浓度的变化。10. DGC 是 c-di-GMP 合成酶将15iiM蛋白与lOOiiM GTP在25mM Tris-Cl缓冲液中于37°C反应30min以上， 反应液加热失活，然后进行反向C18柱高效液相色谱分析，流动相为3%乙腈溶液。以GTP 和c-di-GMP标样为对照。结果表明，DGC蛋白能将GTP转化为c-di-GMP (见附图9)，催化 活性所在区域为GGDEF结构域。上述低氧模型和体外酶学数据表明，DGC可能感应体外低氧环境，进而通过 c-di-GMP信号转导调控结核杆菌在低氧条件下存活、及从低氧进入氧气充足状态快速恢复 生长的能力，有望成为治疗结核杆菌潜伏感染的新型药物靶标，c-di-GMP类似物分子有望 开发成为治疗结核杆菌潜伏感染的新型药物分子。
权利要求
结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治疗结核病药物筛选中的应用，所述合成酶基因编码的蛋白由GAF、GGDEF和EAL三个结构域组成，其特征在于作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结核病及发病期结核病的药物。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治疗结核 病药物筛选中的应用，其特征在于所述GAF结构域作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结 核病及发病期结核病的药物。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治疗结核 病药物筛选中的应用，其特征在于所述GGDEF结构域作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期 结核病及发病期结核病的药物。
4.根据权利要求1或2或3所述的结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治 疗结核病药物筛选中的应用，其特征在于作为药物靶标的效应分子为一氧化氮供体、一氧 化碳供体、c-di-GMP和c-di-GMP的衍生物。
全文摘要
本发明公开了结核分枝杆菌胞内二级信使环二鸟苷酸合成酶在治疗结核病药物筛选中的应用，其基因编码的蛋白由GAF、GGDEF和EAL三个结构域组成，通过感应外界低氧、NO/CO环境，进而通过c-di-GMP信号转导调控结核杆菌潜伏感染能力的生理学功能，环二鸟苷酸合成酶缺失不影响细菌的生长，但能导致结核杆菌在低氧环境下生长时氧气过快消耗，导致低氧环境下细胞内辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水平低于野生型菌株，导致低氧环境下与结核杆菌潜伏能力相关基因下调表达，导致低氧环境下的存活力下降，导致结核杆菌从低氧环境进入氧气充足环境恢复生长的能力下降。因而，它可以作为药物靶标用于筛选治疗潜伏期结核病及发病期结核病的药物。
文档编号C12Q1/25GK101864474SQ201010197539
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者于丹, 周小丹, 孙宝林, 方海红, 朱峰, 洪宇植 申请人:中国科学技术大学