专利名称：特定长度的肝素寡糖的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一种用肝素酶生产肝素寡糖的方法。
背景技术：
心脑血管疾病是中老 年人的常见病和多发病，在许多国家和地区的疾病谱和死亡谱中均居于首位。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理学基础，因而防治AS是防治心脑血管疾病的根本措施。AS的发病过程漫长，病因和发病机制仍不十分清楚。近年来，随着细胞生物学、分子生物学、免疫学等学科的发展和相互渗透，对AS 的病因学有了新的认识和发展。AS的发生过程是多因素参与的，涉及动脉壁细胞、细胞外基质、血液成分、血流动力学、环境及遗传等诸多方面。肝素是一种粘多糖，自1916年发现其抗凝作用后，至今已有半个多世纪，肝素广泛用于抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏和降血脂等，有着广泛的应用前景。然而，肝素在临床应用时，人们发现其存在出血及肝素诱导的血小板减少等副作用，在某种程度上限制了肝素的临床应用，随着对肝素结构研究的不断深化，国内外药业公司在上世纪90年代相继开发了低分子量肝素，低分子量肝素是肝素经化学降解或酶降解而得到的平均分子量在 3000 7000道尔顿之间的片段，低分子量肝素不仅用于预防及治疗深静脉血栓，而且用于炎症等方面。但低分子量肝素仍为不同糖链长度的肝素寡糖的混合物，随着分离纯化技术的不断进步，制备特定糖链长度的肝素寡糖已经成为可能，而且肝素寡糖由于其糖链的长度不同可能呈现不同的生物学功能，因此以特定长度肝素寡糖为基础的药物设计、研究和开发将展示出诱人的前景。肝素酶是一种能够降解肝素类物质的裂合酶，降解肝素的主要特点是产生不饱和双键的糖醛酸和带有还原末段的葡萄糖胺.关于肝素酶来源的报道不多，目前，微生物来源的肝素酶有Calliher P.M. (1981)报道的肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum ATCC 13125)Watanabe M(1998)报道的解肝素普雷沃氏菌(Prevotella heparinolytica) Linhardt R. J (1986)报道的从瘤胃中分离得到的拟杆菌(Bacteroidessp)和Kim B. T. (2000)报道的从人肠道中分离出来的粪拟杆菌(Bacteroides stercoris HJ-15)及 Jigyodan S. (1991)发表专利(JP3247297)报道的芽孢杆菌(Bacillus sp. BH100).但是， 直到目前为止，肝素黄杆菌是商品肝素酶的唯一来源.肝素黄杆菌肝素酶也是目前唯一经系统研究的肝素酶.Yang V. C. (1985) Nader H. B. (1990)和lohse D. L. (1992)都分别报道了肝素黄杆菌肝素酶的纯化和性质研究结果.已从肝素黄杆菌中分离纯化出三个肝素酶，分别为肝素酶I II和III.这三种肝素酶的酶学特性各不相同，酶I II III的分子量分别为42.8KD，84. 1KD，70.8KD;等电点分别为 pH8. 5，ρΗ9. O, ρΗΙΟ.Ο ；最适作用温度分别为35°C，40°C，45°C ；最适作用pH分别为7. 15， 7.30，7.60。更重要的是它们的底物特异性和作用方式不同。肝素酶I是外切型的，具有连续外切肝素的活性，也含少量的内切酶的活性(< 10%)。肝素酶II是内切型的，但底物专一性不高，既能作用肝素又能作用硫酸乙酰肝素。肝素酶III是内切型的，但只能作用硫酸乙酰肝素，不能降解肝素。拟杆菌肝素酶虽然也进行了纯化，但性质研究不系统。肝素酶的用途又多种。可用于在体外循环中肝素的消除，制备活性肝素寡糖片段， 也是肝素精确结构的确定及其结构与功能关系研究不可缺少的工具酶。肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)和D-葡萄糖胺以1-4糖苷键连接起来的大分子的糖胺聚糖(GAG)，其分子结构极为复杂且不均一，至今其精确结构仍不清楚。 但是，已经发现与其复杂结构相对应的多种生物学功能。肝素作为抗凝剂和抗血栓药物在临床上已经应用60多年。近些年来，发现肝素具有抗平滑肌细胞增生、抗炎、抗肿瘤和调节脂代谢等生物活性。因此，肝素可用于预防和治疗由外伤、器官移植、哮喘、高血压、充血性心力衰竭、肾小球肾炎等疾病引起的平滑肌细胞增生，防止血管狭窄；预防和治疗冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑栓塞患者经血管“搭桥术”、“球囊扩充术”、“按装支架术”和“心内或颅内分流术”后由于受到刺激的平滑肌细胞迅速增殖引起的血管再狭窄症；此外，小儿先天性心脏病患者由于血管平滑肌细胞延伸到肺的外周小动脉血管引起的不可逆性的肺动脉高压，不做手术有生命危险，手术后引起平滑肌细胞增生，使血管再狭窄，也是致命的。因此，广大患者迫切需求能抑制平滑肌细胞增生的药物。但是，由于肝素具有抗凝活性，使用量大会引起出血和血小板减少等副作用，限制了肝素在这方面的临床应用。Lippman Μ. M. (1977)报道的肝素的结构与功能研究结果表明，肝素的抗增生活性与抗凝活性无关，只与肝素片段的大小和所带电荷有关。目前，国内外均用化学方法制备保留抗凝活性的低分子肝素，Conrad H. E. (1995)发表了用化学方法制备具有抗平滑肌细胞增生活性肝素寡糖的专利，但至今没实际应用。由于化学法解聚肝素反应剧烈，使肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏，因而，某些生物活性功能也不同程度地降低或丧失。因此，采用酶法制备活性特定长度的肝素寡糖，成为当今有关的糖生物学研究工作者的研究热点。本发明中采用特殊制备方法将肝素酶I能够特异地作用肝素分子中起抗凝作用的不规则序列区域，保留可具有抗增生活性等生物活性的规则序列区域中高度硫酸化的部分。因此，本发明具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的产生肝素酶的菌种，进而利用该酶降解肝素、制备系列具有生物活性的肝素寡糖及其应用。本发明中的产酶菌种是从土壤中分离筛选出的一株产生新型肝素酶的菌种。通过外部形态、生理生化反应特征鉴定和根据以16s rRNA基因序列为基础的系统发育分析结果，确认该菌是未见报道的棒杆菌属的一个新种。现已从这个菌中分离纯化出三种肝素酶， 即为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。它们的酶学性质分子量分别为96. 8KD、68. 0KD、 70. IKD ；最适作用温度分别为37°C、45°C，49°C ；最适作用pH分别为7. 0,6. 5,7. 0 ；底物专一性、作用方式和终产物三种肝素酶都能作用肝素，酶I是外切型的，降解肝素的终产物是二糖，本发明可以用酶Π68. OKD或/和酶III70. IKD为催化剂，以用于素为底物制备肝素寡糖，酶II和酶III是内切型的，降解肝素的终产物为一系列的肝素寡糖，尤其是肝素酶 III能将肝素降解成比较大的寡糖，并且保持了肝素分子中具有抗增生活性的高度硫酸化区域的完整性，非常适用于具有抗增生活性肝素寡糖的制备。产酶菌种个产酶条件通过富集培养、平板分离、天青A测定的方法，从土壤中选育出一株新型肝素酶的菌种，经鉴定为棒杆菌属的一个新种。确定了培养基组成和培养条件棒杆菌每升含NaCL lg、K2HP04 2. 5g、MgS04 0 . 5g、肝素2g，pH至6. 5培养基的IOOOml三角瓶中，于30-33°C，200转/分的摇床上培养36小时。 棒杆菌肝素酶的纯化和酶学性质利用超声破碎细胞，得到的无细胞粗酶液先用 DEAE-纤维素吸附。将DEAE-纤维素用0. 2mol/L, pH6. 8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到粗酶液中吸附杂蛋白，通过离心收集上清液。然后再用羟基磷灰石吸附，将羟基磷灰石用 0. 2mol/L, pH6. 8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到经DEAE-纤维素处理后的酶液中，离心收集沉淀，被吸附的酶用含lmol/LNaCl的相同缓冲液一次洗脱，洗脱液超滤浓缩并脱盐，脱盐后的肝素酶液用0. 2mol/L,pH6. 8的磷酸缓冲液充分平衡的SP-S印haroseFF柱层析进一步纯化，以含0-0. 5mol/L NaCl线性梯度的相同缓冲盐进行梯度洗脱，分离纯化出三种肝素酶，分别为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，再分别超滤浓缩得到浓缩的肝素酶。抗平滑肌细胞增生活性肝素寡酶的制备和分离纯化本发明所述的一种肝素酶产生肝素寡糖的方法是指以商品肝素为原料，用部分纯化的肝素酶I，在一定条件下降解肝素，制备肝素寡糖。用0. 05mol/L,pH7. 0的磷酸缓冲配制2%的肝素溶液，每克肝素用酶量为0. 1单位，于20-30°C反应，当A232为0. 55-0. 65时终止反应。得到的反应混合物经截留分子量小于IOKD的滤膜超滤除去大分子的肝素和酶蛋白，浓缩并脱盐，得到肝素寡糖混合物。混合肝素寡糖通过Si^phadex G-50柱进行分级分离，然后通过浓缩、冻干提取一系列部分纯化的肝素寡糖。
具体实施例方式下面以实施例对本发明做进一步的说明。实施例1棒杆菌制备每升含NaCL lg、K2HP04 2. 5g、MgS04 0. 5g、肝素 2g，pH 至 6· 5 培养基的1000ml三角瓶中，于30-33°C，200转/分的摇床上培养36小时。实施例2肝素酶制备利用超声破碎细胞，得到的无细胞粗酶液先用DEAE-纤维素吸附。 将DEAE-纤维素用0. 2mol/L, pH6. 8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到粗酶液中吸附杂蛋白， 通过离心收集上清液。然后再用羟基磷灰石吸附，将羟基磷灰石用0.2mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到经DEAE-纤维素处理后的酶液中，离心收集沉淀，被吸附的酶用含lmol/L NaCl的相同缓冲液一次洗脱，洗脱液超滤浓缩并脱盐，脱盐后的肝素酶液用0. 2mol/L, pH6. 8的磷酸缓冲液充分平衡的SP-S印haroseFF柱层析进一步纯化，以含 0-0. 5mol/L NaCl线性梯度的相同缓冲盐进行梯度洗脱，分离纯化出三种肝素酶，分别为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，再分别超滤浓缩得到浓缩的肝素酶。实施例3抗平滑肌细胞增生活性肝素寡酶的制备和分离纯化本发明所述的一种肝素酶产生肝素寡糖的方法是指以商品肝素为原料，用部分纯化的肝素酶I，在一定条件下降解肝素，制备肝素寡糖。用0. 05mol/L,pH7. 0的磷酸缓冲配制2%的肝素溶液，每克肝素用酶量为0. 1单位，于20-30°C反应，当A232为0. 55-0. 65时终止反应。得到的反应混合物经截留分子量小于IOKD的滤膜超滤除去大分子的肝素和酶蛋白，浓缩并脱盐，得到肝素寡糖混合物。混合 肝素寡糖通过Si^phadex G-50柱进行分级分离，然后通过浓缩、冻干提取一系列部分纯化的肝素寡糖。
权利要求
1.一种用微生物肝素酶生产肝素寡糖的方法该方法涉及如下步骤一种用于生产肝素酶的棒杆菌，培养后制备肝素酶I，取肝素钠使用反应缓冲液进行溶解，30°c恒温水浴 lOmin，加入肝素酶I进行恒温酶解反应。控制反应在32小时左右，于100°C的沸水中煮沸 4分钟，灭活肝素酶I终止反应，得到肝素寡糖的反应液。经超滤得分子量小于IOkD的低分子肝素，采用Bio-GelP6凝胶色谱柱分离，收集所需分子量的肝素寡糖合并浓缩，经脱盐后，采用制备高效液相进行纯化，收集，冻干，制成肝素寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养棒杆菌的培养基组成为每升含NaCL lg、K2HPO4 2. 5g、MgSO4 0. 5g、肝素 2g，pH 至 6. 5。
3.根据权利要求1所述的方法，在制备肝素寡糖中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种特定长度的肝素寡糖制备方法及用途，本发明将肝素经过肝素酶降解后，利用超滤、凝胶层析、高效液相层析等技术制备特定糖链长度的肝素寡糖。
文档编号C12R1/15GK102277396SQ20101019954
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者黄欣 申请人:黄欣