专利名称：一种蛹虫草纤溶酶及其培制方法
技术领域：
本发明涉及一种蛹虫草纤溶酶，本发明还涉及一种该纤溶酶的培制方法。
背景技术：
生物溶栓法目前是治疗和预防血栓性疾病的主要手段，研制高效、快速、防止再栓 塞并能降低出血等不良反应的新型溶栓药物是现代医学的迫切需要。蛹虫草是一种珍贵的 中药和高级滋补品，能够提高免疫功能，护肝清肺、止咳化痰、抗疲劳、抗缺氧、抗病毒等功 效，具有重要的医用价值，是一种亟待开发的重要资源。近十余年的时间里，本申请人一直 在探讨蛹虫草在现代生物溶栓剂制备中的应用潜力，并于2006年成功地筛选到了一株具 有优良溶栓性能的蛹虫草菌株C. LSG-I，该菌株已由本申请人于2008年7月4日向中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC N0. 2577，其分 类学命名为Cordyc印s militaris。利用该菌株本申请人培养出了一种具有良好溶栓性能 的纤溶酶，并于2008年11月12日向国家知识产权局提交了申请号为200810137564.4的 发明专利申请。该发明申请中的纤溶酶酶分子相对分子量为21000，该纤溶酶酶分子能够直 接溶解血纤维蛋白，在适宜人体生理PH下溶栓性质稳定，本发明内容属于对该项目的继续 研究。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种蛹虫草纤溶酶，该纤溶酶不仅具有很好的溶栓性 能，而且使用上安全性好，相对分子量小，易于人体吸收，制备成本也很低廉。本发明的另一 个发明目的还在于提供一种该纤溶酶的培制方法。本发明产品是以保藏号为CGMCC Nq. 2577，其分类学命名为Cordyc^psmilitaris 的蛹虫草菌株C. LSG-I为菌种，经过斜面培养、平板培养、液体发酵培养、分离和提纯，最后 培制出本发明的纤溶酶产品。本发明培制的纤溶酶具有以下酶学性质该蛹虫草纤溶酶酶分子由单个亚基 组成，相对分子量约为28000 ；等电点为9. 3士0.2 ；蛹虫草纤溶酶为糖蛋白，总含糖量 约1.668% ；该酶不但可以直接降解血纤维蛋白，而且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶 共同参与溶栓的作用；可以顺次降解纤维蛋白α、β和Y链。最适作用温度为37°C， 最适PH分别为pH7. 2，在pH3 11之间较稳定；Ca2+对蛹虫草纤溶酶具有较高的保护作 用，而不同浓度Fe2+对纤溶酶表现出较强的抑制作用。质谱法测得三个肽段序列分别为 N-T-T-Y-F-Q-P-V-N-R ；L-L-Q-T-Y-G-L-T-L-V-G-R ；A-T-V-Q-G-G-D-A-Y-V-L-N-N-Q-F-R, Edman降解法测得N端十五个氨基酸序列为I-V-G-G-V-S-V-L-I-E-D_F-P-Y-Q。本发明的产品制备方法与申请号200810137564. 4发明专利申请技术方案对比， 原方案中纤溶酶色谱提纯方法包括Phenyl Sepharose HP疏水相互作用层析和SuperdeX75 预装柱凝胶过滤层析。本发明中纤溶酶色谱提纯方法增加了 Si^phadex G-25凝胶层析脱盐 和SP-S印harose HP强阳离子交换层析。
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本发明产品制备的具体步骤1、以蛹虫草C. LSG-I为菌种，经过斜面培养、平板培养、液体发酵培养生产蛹虫草 纤溶酶；2、培养方法斜面培养一平板培养一液体发酵培养；将蛹虫草菌株C. LSG-I接入斜面培养基葡萄糖1 %，琼脂2. 5 %，马铃薯汁20 %， 蛋白胨0. 5%, KH2PO4 0.1%, MgSO4 0. 05%, pH自然，23°C恒温培养IOd0将培养物转接入 同斜面培养基相同的平板培养基23°C恒温培养10d。发酵培养基含蔗糖1. 25 %，玉米蛋白 5 %，KH2PO4 0.01%、KCl 0.005 %、 MgSO4O. 001%,CuSO4 0. 001%,装液量为40mL/250mL三角瓶，发酵培养基的初始pH值自然。 液体发酵条件接菌量为直径Icm的菌苔圆片1片；21 28°C，ISOrpm/min发酵5天得液 体发酵培养物。3、粗提纯蛹虫草纤溶酶将液体发酵培养物10000rpm/min、4°C、离心lOmin，离心
上清液经20%饱和度的硫酸铵盐析后为粗酶液。4、精提纯蛹虫草纤溶酶采用现代色谱技术对粗酶液进行精提纯，主要采用以下 方法得到色谱纯的纤溶酶A、Sephadex G-25 凝胶层析脱盐缓冲液为 0. 02mol/L PBS (pH 6. 0)；B, SP-Sepharose HP强阳离子交换层析按NaCl浓度递增方向用含0. 8mol/L NaCl的0. 02mol/L PBS缓冲液梯度洗脱；C.Phenyl Sepharose HP疏水相互作用层析采用梯度洗脱方式将样品盐饱和度 调到40%，上样后用40% O硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分；D、Superdex75 预装柱凝胶过滤层析用含 0. 3mol/LNaCl 的 0. 02mol/L PBS 缓冲 液(PH7. 4)洗脱，收集有纤溶活性组分。本发明的优点该蛹虫草纤溶酶分子量较小，适宜在人体生理pH下发挥作用，实 验证明具有很好的溶栓性能，不仅能独立溶栓，还能够激活纤溶酶原间接溶栓，且无明显的 急性毒性，因而具有在临床上开展试验、开发应用的前景，也为稀薄的纤溶酶家族增添了一 名新的成员。本发明所用菌株是经过严格筛选得到的高产纤溶酶蛹虫草C. LSG-I菌种，生 长条件比较粗放，产酶周期短，在产酶同时能收获大量蛹虫草菌丝体，是一株生产性能优良 的菌种。本发明的蛹虫草纤溶酶是一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化。由 于本发明产品是以来源广泛的玉米蛋白为主要培养基，不仅原料成本低廉，而且也为这些 原有资源的开发利用提供了新的途径。
图1为利用血纤维蛋白蛋白平板法证实本发明产品纤溶酶溶纤作用的图片图2为SDS-PAGE测定纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解图片本发明所使用的蛹虫草菌株C. LSG-I已由本申请人于2008年7月4日向中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCCNq. 2577，其分 类学命名为 Cordyceps militaris。具体实施例实施例1 1、菌种蛹虫草菌株C. LSG-1，保藏号为CGMCC N0. 25772、培养基及培养条件(1)斜面培养基葡萄糖1 %，琼脂2.5%，马铃薯汁20%，蛋白胨0.5%， KH2PO4O. 1 %, MgSO4 0. 05%，pH自然。培养条件23°C恒温培养IOd0 (20%马铃薯汁制备 称去皮马铃薯200g，切成碎块，加蒸馏水IOOOmL,煮沸30min，以双层纱布过滤取汁备用)(2)平板培养基葡萄糖1 %，琼脂2.5%，马铃薯汁20%，蛋白胨0.5%， KH2PO4O. 1 %, MgSO4 0. 05%，pH 自然。培养条件23°C恒温培养 IOd0(3)液体发酵培养基蔗糖 1. 25%，玉米蛋白 5%，KH2PO4 0.01%, KC10. 005%, MgSO4O. 001%,CuSO4 0. 001%,装液量为40mL/250mL三角瓶，发酵培养基的初始pH值自然。 液体发酵条件接菌量为直径Icm的菌苔圆片1片；21 28°C，ISOrpm/min发酵5天得液 体发酵培养物。实施例21、斜面培养同实施例12、液体发酵培养同实施例13、蛹虫草纤溶酶的分离纯化液体发酵产物经过20%饱和度硫酸铵盐析后，再经过a,Sephadex G_25凝胶过滤层析，使用pH6. O磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性 组分；b、SP-S印har离子交换层析，使用含O 0. 8mol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液 (ρΗ6. 0)梯洗，收集有纤溶活性组分；c,Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用层析，将样品盐饱和度调到40%，上样后用 40 0%硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分；d、Sephadex 75凝胶过滤层析用pH7. 4磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液含0. 3mol/ LNaCl，收集有纤溶活性组分。实施例31、斜面培养同实施例12、液体发酵培养同实施例13、纤溶酶分离纯化同实施例24、测定分离纯化后的纤溶酶的性质蛹虫草纤溶酶酶分子由单个亚基组成，相对 分子量约为28000 ；等电点为9. 3士0. 2 ；蛹虫草纤溶酶为糖蛋白，总含糖量约1. 668% ；该 酶不但可以直接降解血纤维蛋白，而且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶共同参与溶栓的作 用；可以顺次降解纤维蛋白α、β和Y链。最适作用温度为37°C，最适pH分别为ρΗ7.2; Ca2+对蛹虫草纤溶酶具有较高的保护作用，而不同浓度Fe2+对纤溶酶表现出较强的抑制作 用。质谱法测得三个肽段序列分别为N-T-T-Y-F-Q-P-V-N-R ；L-L-Q-T-Y-G-L-T-L-V-G-R ； A-T-V-Q-G-G-D-A-Y-V-L-N-N-Q-F-R, Edman降解法测得N端十五个氨基酸序列为 I-V-G-G-V-S-V-L-I-E-D-F-P-Y-Q。实施例4
蛹虫草纤溶酶纤溶活性证明采用血纤维蛋白平板法检验此酶对血纤维蛋白的溶解性。A血纤维蛋白平板法血纤维蛋白平板含有血纤维蛋白原(市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白) 和凝血酶，可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体自发缔结， 多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将纤溶酶液加到此平板凝胶表面，经过短时间培养后 该酶即将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈。见图1。B电泳法将纤溶酶和人血纤维蛋白原等体积混勻37°C反应，用SDS--PAGE检测脉孢霉纤溶 酶降解人血纤维蛋白原，降解图谱见图2(从右至左泳道依次为人血纤维蛋白原、蛹虫草纤 溶酶与纤维蛋白原混合后作用lmin、5min、30min、lh、2h、4h、6h、8h、12h)。Imin后α链就 开始降解，5min后α链和β链都完全降解，2h后γ链降解完毕，这一降解顺序与人纤溶 酶降解纤维蛋白原的情况相同。
权利要求
一种蛹虫草纤溶酶，该蛹虫草纤溶酶以保藏号为CGMCC NO.2577，分类学命名为Cordyceps militaris的蛹虫草菌株C.LSG 1为培养菌种，经发酵、分离和提纯制成；其相对分子量为28000，等电点9.3±0.2；该酶可以直接降解血纤维蛋白，且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶共同参与溶栓的作用；最适作用温度37℃，最适pH为7.2；能顺次降解人血纤维蛋白α、β和γ链；三个肽段序列分别为N T T Y F Q P V N R；L L Q T Y G L T L V G R；A T V Q G G D A Y V L N N Q F R，Edman降解法测得N端十五个氨基酸序列为I V G G V S V L I E D F P Y Q。
2.使用如权利要求1所述蛹虫草发酵制备纤溶酶方法，是以微生物蛹虫草菌株 C. LSG-I为菌种，经摇瓶发酵培养产生纤溶酶，将发酵物滤去菌体和固形物，收集滤过液，用 20% W/V饱和度硫酸铵盐析，得到粗酶液，再采用现代色谱分离技术进行纯化。
3.—种如权利要求2所述蛹虫草纤溶酶的培制方法，所述的粗酶液纯化方法如下a、SephadexG_25凝胶过滤层析，使用pH6. 0磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分；b、SP-Sephar离子交换层析，使用含0 0.8mol/L NaCl的pH6. 0的磷酸盐缓冲溶液 梯洗，收集有纤溶活性组分；c、Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析，将样品盐饱和度调到40%，上样后用 40 0% W/V硫酸铵溶液梯度洗脱，收集有纤溶活性组分；d、Sephadex75凝胶过滤层析用pH7. 4磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液含0. 3mol/LNaCl, 收集有纤溶活性组分。
全文摘要
本发明公开了一种蛹虫草纤溶酶及该纤溶酶的培制方法，该蛹虫草纤溶酶是以蛹虫草C.LSG-1为菌种，经培养发酵、分离和提纯制成；分子量为28000左右，等电点为9.3±0.2；最适作用温度为37℃，最适pH分别为7.2，在pH3～11之间较稳定。该蛹虫草纤溶酶具有很好的溶栓性能，且无明显的急性毒性。本发明所用菌株是经过严格筛选得到的高产纤溶酶蛹虫草C.LSG-1菌种，生长条件粗放，产酶周期短，性能优良，在产酶同时能收获大量蛹虫草菌丝体，因该酶是一种胞外酶，在制备中特别有利于后续的分离和纯化。由于本发明产品是以来源广泛的玉米蛋白为主要培养基，不仅原料成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提供了新的途径。
文档编号C12R1/645GK101962637SQ20101020447
公开日2011年2月2日 申请日期2010年6月4日 优先权日2009年12月4日
发明者刘晓兰, 时晰, 李巍巍, 李瑶, 艾瑞波, 郑喜群 申请人:齐齐哈尔大学