专利名称：微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物催化法制备2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，以及在生 产过程中用到的新菌株。
背景技术：
2-氨基-2，3- 二 甲基丁酰胺，英文名 2-amino_2，3_dimethylbutyamide，外观为白 色片状晶体，熔点为84°C，能溶于水和大多数有机溶剂。是咪唑啉酮类超高效除草剂如咪唑 乙烟酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草烟等的通用中间体，市场需求广阔。其中咪唑乙烟酸和咪唑 喹啉酸曾占据美国大豆除草剂市场主导地位达10年之久；而我国自从1990年大批量进口 咪唑乙烟酸并在黑龙江省大面积应用以来，用量持续增加。特别是在国内该除草剂产品问 世以后，由于其价格低廉，除草效果良好，故而被大范围使用，成为黑龙江与内蒙古地区大 豆田除草剂的主导品种。2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺目前主要通过化学法生产。其生产过程可分为两个部 分3_甲基-2-丁酮通过斯特雷克(Strecker)反应得到氨基腈，后者在酸或碱催化下水解
得到产物(见下式)。
NaCN
NH4Cl
H2SO4
NH4OH
NH2 O
NH7孙晓红等(西北大学学报，1994，24 (3) :227_234)报道了该氨基腈的合成方法，先 将氯化铵溶于水后，加入氰化钠和氨水，搅拌均勻后，加少量苄基三乙基氯化铵，滴加甲基 异丙基甲酮，搅拌回流4 6小时，用二氯甲烷提纯后，得无色透明液体，纯度为95%，收率 为 90%。Peter J.等(US 6339158)报道了由2_氨基_2，3_ 二甲基丁腈制备2_氨基_2， 3- 二甲基酰胺的方法，首先加入29. 7ml浓硫酸，慢慢加入11. Sg 2-氨基-2，3- 二甲基丁 腈，保证反应体系温度不超过25°C，加热至IOCTC并在该温度下反应lh，反应结束后冷却， 加入85ml浓氨水，过程中控制体系温度不超过75°C，然后用二氯甲烷萃取、结晶，最终得 到11.2g 2-氨基-2，3-二甲基酰胺，收率为81.7%。吕晓东等(辽宁化工，2001，30 (10) 455-456)报道将2-氨基-2，3- 二甲基丁腈在一定的温度下滴加入95%的浓硫酸中，升温， 反应数小时。反应完毕后，冷却至室温，滴加浓氨水中和至弱碱性，加萃取剂，搅拌一定时 间，过滤，滤出物用萃取剂洗涤，并将洗液合并入滤液。滤液相分离，有机层蒸出萃取剂，釜 底物加入石油醚，冷冻结晶，滤出的固体干燥后得到2-氨基-2，3-二甲基酰胺，最终收率为 95%，产物纯度达到96%。由上可知，化学法生产2-氨基-2，3_二甲基酰胺的主要缺点是反应需要高温、强 酸等条件，能耗原料消耗高，产品易受副产物污染，提纯步骤繁琐，周期长，收率低，产生大量含腈污水，不符合环保要求等。腈水合酶(Nitrile Hydratase)是一种在自然界中广泛存在的微生物酶，它可催 化多种腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍 生物的合成。1980 年，Asano 等(Agricultural andBiological Chemistry, 1982,46 (5) 1183-1189)首次发现微生物Rhodocococcus sp. N-774可降解有毒的乙腈，不久即被成功 地应用于工业生产丙烯酰胺。近年来，腈水合酶也被用于制备手性药物，如Gilligan等 (Applied Microbiology and Biotechnology，1993，39 :720_725)成功地用 Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2_苯基丙腈立体选择性水解，生成了非留体类 抗炎药S-(+)-2-苯基丙酸。现有的研究表明，腈水合酶催化的反应具有高选择性、高效性、 条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济和绿色化学的发展 方向，有着化学方法无可比拟的优越性，从而促进了精细化工产品和手性药物的研制和开 发。因此利用腈水合酶的高效性、高选择性和反应条件温和等特点来催化生产2-氨基-2， 3_ 二甲基丁酰胺，将可以提高产率和产品质量、降低生产成本和减小环境污染。据报道，α-氨基腈在水溶液中极不稳定，容易自发水解生产HCN和酮(醛)等物 质(Engineering in Life Sciences，2004. 4 :547_556)。这些副产物特别是 HCN 是腈水合 酶的强烈抑制剂，它通过与腈水合酶活性中心的金属离子Fe2+或Co2+络合而使腈水合酶失 活。Nagasawa 等(EuropeanJournal of Biochemistry，1991. 196 :581_589) 艮道，作为生 产丙烯酰胺的高效催化剂Rhodococcus rhodochrous Jl生产的腈水合酶，在氰离子浓度为 0. OlmM时即酶活损失62%。因此筛选得到耐受氰离子的腈水合酶，将有利于实现连续化生 产2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺，提高产物浓度。
发明内容
为克服上述化学合成法的缺陷，本发明提供了一种微生物催化水合2-氨基-2， 3_ 二甲基丁腈制备2-氨基-2，3-二甲基酰胺(ADBA)的方法，及制备过程中所用的新菌株。本发明采用的技术方案是一种微生物催化法制备2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在 以2-氨基-2，3-二甲基丁腈为底物，以庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii) CCTCC No :M 2010050、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC No :M 209214 或红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis)CCTCCNo =M 209244发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体 系中，于PH6.0 10.0、20 40°C下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基 丁酰胺。所述腈水合酶存在于菌体细胞中，具体制备时，可直接将发酵获得的含菌体细胞 的发酵液作为催化剂参与反应，也可以将菌体细胞分离后，作为催化剂参与反应，所述腈水 合酶用于催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈制备2-氨基-2，3- 二甲基酰胺的反应原理如下列
反应式所示
所述反应在水或pH6. 0 10. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、 Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行。所述反应体系中底物初始浓度为0.03 0.3M。反应过程中，当底物浓度低于 0. OlM时，可以继续补入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈至浓度为0. 03 0. 3M，以达到连续 生产的效果。优选的，所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCC No =M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No =M 209214或红平红球菌CCTCC No =M 209244经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌 体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5 50g/L。所述含酶菌体细胞可由上述 三种菌株在适用于菌种庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌的培养基中，经发酵培养 获得。所述适用于本发明庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌培养基，可以是一些含有 可以被庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌利用的营养物质的常规培养基。培养基中 合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有蔗糖、葡萄糖、乳糖、 柠檬酸钠、淀粉；作为氮源的有酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉、玉米浆、铵盐等；另可 加入氨基酸类(如甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等)、维生素(如 VBi、VB2、VB12、Ve、VE、烟酸等)、核酸类(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用1. OM HCl或NaOH 溶液调节pH值为6. 0 8. 0。为提高产酶效率，可在培养基中添加诱导剂，所述诱导剂可为 下列之一谷氨酸钠、2，2_ 二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺、尿素。发酵培 养可以是摇瓶培养或通风搅拌培养；可以在摇瓶中进行也可以在发酵罐中进行。摇瓶培养在三角摇瓶中分别装入适量的种子培养基和产酶培养基(10 40%， ν/ν)，121°C灭菌20min。用接种环挑入一定量的斜面菌种，接入种子培养基中，于20 40°C 下培养24 48h，获得种子液；将种子液以2. 5%体积比接入含诱导剂的发酵培养基中，于 20 40°C，转速100 300rpm下培养48 96h，获得含腈水合酶的发酵液。发酵罐培养在5L种子罐中装入适量的发酵培养基(30 65%，v/v)，实罐消毒 后接入一定量的斜面菌种，在温度20 40°C，搅拌转速100 300rpm下培养24 48h， 得到种子液；在50L发酵罐中装入适量的产酶培养基(30 65%，ν/ν)，实罐消毒后接入 2. 5%体积比的种子液，在通气比0. 1 1.0 1(每分钟内通过的空气体积与培养液体积 之比)，温度20 40°C，搅拌转速100 300rpm的条件下进行发酵培养48 96h，获得含 腈水合酶的发酵液。得到菌体培养液后可采用离心或过滤等方式分离出菌体细胞，利用该湿菌体或固 定化细胞或从该细胞中破碎分离出的腈水合酶催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈制备2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺。发酵液在12000rpm、4°C条件下离心，弃上清，细胞用0. 9%生理盐水洗涤后再离 心收集菌体；或者发酵液用膜过滤系统进行过滤分离，并加入2倍发酵液体积的0. 9%生理 盐水洗涤，收集菌体。其中的膜过滤系统可以是中空纤维膜或卷式膜或陶瓷膜或超滤膜。优选的，所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到(1)将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCC No =M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No: M 209214或红平红球菌CCTCC No =M 209244接入种子培养基中，于20 40°C下培养24 48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉2 8. Og/L，蛋白胨 1 4. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L，NaCl 0. 5 3. Og/L,己内酰胺 0. 5 2. Og/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/ L，溶剂为水，pH 6.0 8.0 ；(2)将种子液以1 10%体积比接入产酶培养基中，于20 40°C下培养48 96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组 成如下蔗糖5. 0 10. Og/L,柠檬酸钠2. 0 5. Og/L,牛肉膏2. 0 8. Og/L,酵母粉2. 0 8. Og/L,氯化钠0. 5 2. 0g/L,磷酸二氢钾0. 5 2. 5g/L，氯化钴0. 005 0. 01g/L,氯化 铁0. 005 0. 01g/L,氯化锰0. 005 0. 01g/L,诱导剂1. 0 3. 0g/L,溶剂为水，pH 6. 0 8.0;所述诱导剂为下列之一谷氨酸钠、2，2_ 二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙 酰胺或尿素。所述方法如下将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或PH6.0 10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、TriS-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠 缓冲液中，加入底物2-氨基_2，3- 二甲基丁腈至底物浓度为0. 03 0. 3M，于15 40°C、 100 200rpm下反应10 60min ；反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2，
3_ 二甲基丁酰胺。优选的，所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化液12000rpm离心lOmin， 收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色 清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0. IMpa，水浴加热温度40 60°C、转速60 IOOrpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2，3-二 甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品溶于20 65°C的乙酸乙酯，加入体 积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烷，于0 4°C保温结晶；过滤，取滤渣用正己烷洗涤，干 燥得到2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺晶体。本发明还涉及制备过程中所用的3株新的菌株，该产生的腈水合酶均具有良好的 氰离子耐受性，在KCN浓度高达IOmM时，转化丙烯腈仍能保持80%以上的腈水合酶活力庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)ZJB-09153，保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo =M 2010050，保藏日期2010年 3月10日。小球诺卡氏菌(Nocardia globerula) ZJB-09141，保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo =M 209214，保藏日期2009年9 月27日。红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ZJB-0910，保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo =M 209244，保藏日期2009年 10月26日。该菌株已在在先中国专利申请201010107481. 8中作为新菌株予以保护。上述三个菌株均由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。酶活定义30°C下，每分钟催化生成1 μ mo 1的2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺所需的 酶量定义为一个酶活力单位(U)。腈水合酶的活力以每克干细胞所含有的酶活力单位表示 (U/g dew)ο本发明中2-氨基-2，3-二甲基丁腈和2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的含量通过气 相色谱法测定。本发明的有益效果主要体现在
(1)反应条件温和、时间短。化学水解法需要在100°C左右进行，必须配备加热和 温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高，耗费时间达数小时甚至数天；而生物 催化法在常温下进行，反应条件温和，反应在Ih之内即可完成；(2)废水产量少。用化学水解法会排放大量含酸废水，而且废水中还含有 (NH4)2SO4, Na2SO4等难处理的盐类；用腈水合酶生物催化法生产2-氨基_2，3-二甲基丁酰 胺，废水中难处理的杂质含量少，更利于实现清洁生产；(3)成本低。化学法的原料除了 2-氨基-2，3-二甲基丁腈外还有浓硫酸、浓氨水、 Na2CO3和NaOH等，所需原料多，成本高。而生物催化法一般只需2_氨基-2，3- 二甲基丁腈 作为原料和产腈水合酶细胞作为催化剂，转化率和产率都可达95%以上，原料简单易得，成 本低。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 小球诺卡氏菌ZJB-09141 (CCTCC No =M 209214)和红平红球菌 ZJB-0910(CCTCC No :M 209244)的摇瓶发酵培养配制种子培养基葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1. Og/L，K2HPO4 1. Og/L，NaCl 1. Og/L，己内酰胺 1. 0g/L，MgSO4O. lg/L，CoCl2O. 01g/L， FeSO4O. 01g/L，溶剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为7. 5，121°C灭菌20min。冷却 至室温后接入斜面菌种，在温度30°C，搅拌转速150rpm下培养24h，得到种子液。分别配制摇瓶产酶培养基A、B、C、D、E，其培养基成分如下A 蔗糖4. 0g/L,柠檬酸钠2. 0g/L,牛肉膏3. 0g/L,酵母粉3. 0g/L,己内酰胺0. 5g/ L,氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾0. 5g/L，氯化钴0. 005g/L,氯化铁0. 005g/L,氯化锰0. 005g/ L,溶剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为6. 0 ；B 蔗糖5. 0g/L，柠檬酸钠2. 5g/L，牛肉膏4. 0g/L，酵母粉4. 0g/L,己内酰胺1. Og/ L，氯化钠1. 0g/L，磷酸二氢钾1. 0g/L，氯化钴0. 01g/L，氯化铁0. 01g/L，氯化锰0. 01g/L，溶 剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为6. 5 ；C 蔗糖6. 0g/L，柠檬酸钠3. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，酵母粉5. 0g/L,己内酰胺1. 5g/ L，氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾1. 5g/L，氯化钴0. 015g/L,氯化铁0. 015g/L,氯化锰0. 015g/ L,溶剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为7. 0 ；D 蔗糖7. 0g/L，柠檬酸钠3. 5g/L，牛肉膏6. 0g/L，酵母粉6. 0g/L,己内酰胺2. Og/ L，氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾2. 0g/L,氯化钴0. 02g/L,氯化铁0. 02g/L,氯化锰0. 02g/L,溶 剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为7. 5 ；E 蔗糖8. 0g/L，柠檬酸钠4. 0g/L，牛肉膏7. 0g/L，酵母粉7. 0g/L,己内酰胺2. 5g/ L,氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾2. 5g/L，氯化钴0. 025g/L,氯化铁0. 025g/L,氯化锰0. 025g/ L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为8.0。分别将上述配制好的培养基以40ml/瓶倒入5个250ml摇瓶中，121°C灭菌20min。 冷却至室温后分别以2. 5%的体积比接入上述种子液，于30°C，150rpm转速下培养72h。发 酵培养结束后，分别收集发酵液，SOOOrpm离心收集菌体。分别称取0. 05g湿菌体悬浮于5ml去离子水中，于30°C ISOrpm转速下预热5min后加入2-氨基-2，3-二甲基丁腈(终浓度为 0. 1M)开始反应，20min后取样1000 μ 1，加入30 μ 1 5Μ HCl终止反应。通过气相色谱法测 定转化液中的2-氨基_2，3-二甲基丁酰胺含量，计算酶活，结果如表1所示表1 摇瓶发酵培养液的酶活 实施例2 庆笙红球菌ZJB-09153(CCTCC No =M 2010050)的发酵罐发酵培养配制种子培养基葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1. Og/L，K2HPO4 1. 0g/L，NaCl 1. Og/L，己内酰胺 1. Og/L, MgSO4O. lg/L，CoCl2 0. 01g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7. 5。在5L发酵罐中加入3L种子 培养基，实罐消毒后接入菌种，在温度30°C，搅拌转速150rpm的条件下培养24h，得到种子 液。分别配制发酵罐产酶培养基A、B、C、D、E，其培养基成分如下A 蔗糖4. 0g/L,柠檬酸钠2. 0g/L,牛肉膏3. 0g/L,酵母粉3. 0g/L,己内酰胺0. 5g/ L,氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾0. 5g/L，氯化钴0. 005g/L,氯化铁0. 005g/L,氯化锰0. 005g/ L,溶剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为6. 0 ；B 蔗糖5. 0g/L，柠檬酸钠2. 5g/L，牛肉膏4. 0g/L，酵母粉4. 0g/L,己内酰胺1. Og/ L，氯化钠1. 0g/L，磷酸二氢钾1. 0g/L，氯化钴0. 01g/L，氯化铁0. 01g/L，氯化锰0. 01g/L，溶 剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为6. 5 ；C 蔗糖6. 0g/L，柠檬酸钠3. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，酵母粉5. 0g/L,己内酰胺1. 5g/ L，氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾1. 5g/L，氯化钴0. 015g/L,氯化铁0. 015g/L,氯化锰0. 015g/ L,溶剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为7. 0 ；D 蔗糖7. 0g/L，柠檬酸钠3. 5g/L，牛肉膏6. 0g/L，酵母粉6. 0g/L,己内酰胺2. Og/ L，氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾2. 0g/L,氯化钴0. 02g/L,氯化铁0. 02g/L,氯化锰0. 02g/L,溶 剂为水，用1. OM HCl或NaOH溶液调节pH为7. 5 ；E 蔗糖8. 0g/L，柠檬酸钠4. 0g/L，牛肉膏7. 0g/L，酵母粉7. 0g/L,己内酰胺2. 5g/ L,氯化钠1. 0g/L,磷酸二氢钾2. 5g/L，氯化钴0. 025g/L,氯化铁0. 025g/L,氯化锰0. 025g/ L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为8.0。在50L发酵罐中分别加入以上各组产酶培养基30L，实罐消毒，冷却至室温后分别 以2. 5%的体积比接入上述种子液。在温度30°C，搅拌转速150rpm，通气比0.5 1，罐压 0. 06MPa的条件下培养。培养36h后，每隔12h分别收集发酵液，SOOOrpm离心收集菌体。按 实施例1的方法测定酶活，结果如表2所示表2 发酵罐发酵培养液的酶活
实施例3 含酶细胞的收集取按照实施例1和2中C培养基发酵得到的发酵液1L，按以下固液分离方式进行 处理A 低温高速离心，在4°C，12000rpm转速下离心IOmin ；B 卷式膜过滤，流量 120ml/min，压力 12Kg/cm2 ；C 陶瓷膜过滤，流量120ml/min，压力4Kg/cm2 ；D 中空纤维膜过滤，流量120ml/min，压力1. OKg/cm2 ；E 平板超滤膜过滤，流量120ml/min，压力3Kg/cm2。然后用3L 0. 9%的生理盐水洗涤细胞，收集湿菌体，按实施例1的方法测定酶活， 结果如表3所示表3 不同方式分离细胞后的细胞酶活 实施例4:按照实施例3中低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌、卷式膜过滤方法获得 的红平红球菌和低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，分别取湿菌体0. 05g悬浮于5ml pH8. 9的Tris-HCl缓冲液中，加入底物终浓度为0. 09M的2-氨基_2，3-二甲基丁腈，分别 在15、20、25、30、35、40、451，转速150rpm条件下转化。按实施例1的方法测定酶活，结果 如表4所示
表4 静息细胞在不同温度下的催化活性 实施例5 按照实施例3低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌、卷式膜过滤方法获得的红 平红球菌和低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，分别取湿菌体0. 05g悬浮于5ml不同pH 值的缓冲液中。缓冲液的PH值和类型如表5所示表5 缓冲液的pH值和类型 加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使2-氨基_2，3_ 二甲基丁腈的终浓度为 0. 09M。按实施例1的方法测定酶活，结果如表6所示表6 静息细胞在不同pH条件下的催化活性 实施例6 按照实施例3低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌，取湿菌体3. Og悬浮于 180ml pH7. 8的磷酸盐缓冲液中，在30°C，转速180rpm的条件下预热5min，加入底物2-氨 基-2，3- 二甲基丁腈，使其终浓度达到0. 2M,反应40min，取样气相测定转化液中产物2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺浓度0. 191M，产率为 95. 5%。实施例7 按照实施例3卷式膜过滤方法获得的红平红球菌，取湿菌体3. Og悬浮于200ml pH7. 2的磷酸盐缓冲液中，在35°C，转速150rpm的条件下预热5min，加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使其终浓度达到0. 15M，反应60min，取样气相测定转化液中产物2-氨 基-2，3- 二甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺浓度0. 133M，2-氨 基-2，3-二甲基点酰胺产率为88. 67%。实施例8 按照实施例3低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，取湿菌体20g悬浮于IL去离 子水或缓冲液，装入2L的三口反应瓶中，加入IOml底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈，使其终 浓度约为0. 075M，在10°C，转速180rpm的条件下反应。每隔20min添加IOml 2-氨基-2， 3- 二甲基丁腈，累计加入10次。反应结束后取样气相检测转化液中产物2-氨基-2，3- 二 甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺浓度0. 638M，产率为85. 1%。实施例9 按照实施例8的方法获得的含有2-氨基-2，3_ 二甲基丁酰胺的转化液， 12000rpm离心lOmin，收集含ADBA的上清液；加入粉末活性炭(0. 5%，m/v)，加热搅拌脱 色30min ；转入真空抽滤装置抽滤，得到含ADBA脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真 空度-0. IMpa,水浴加热温度40 60°C，转速60 IOOrpm减压蒸发除去底物2-氨基-2， 3_ 二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品。该粗品溶于热的乙酸乙 酯，加入10% (ν/ν)盐析剂正己烷，于O 4°C保温结晶；过滤，正己烷洗涤，干燥得到2-氨 基-2，3-二甲基丁酰胺晶体(收率90.5%，纯度98.5%)。所得晶体做1H NMR、红外光谱 和质谱分析结果如下FT-IR 3521/3372/1602 (vNH)，2973 (vCH)，1675 (acyl, Vc = 0)，1399 (vc_N)， 708 (amino，vNH)；1H NMR δ H (500MHz ；CDCl3) 0. 86 (3H, d, Me) ,0. 90 (3H, d, Me)，1. 3 (3H, s, Me)， 2.2(lH，m，CH)，5.5(lH，br s, NH) ,7. 4(1H, br s，NH) ；ESI—MS :m/z 283(100%, [2M+Na].)， 261 (82，[2M+H]+)，131 (6. 4，M+)。
权利要求
一种微生物催化法制备2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈为底物，以庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii)CCTCC NoM 2010050、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM 209214或红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCNoM 209244发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～10.0、20～40℃下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应在水或pH6.O 10. O的柠檬酸-柠 檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为0.03 0. 3M。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCCNo =M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No :M 209214或红平红球菌CCTCC No :M 209244经发酵获得 的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5 50g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到(1)将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCCNo =M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No =M 209214或红平红球菌CCTCC No =M 209244接入种子培养基中，于20 40°C下培养24 48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉2 8. Og/L，蛋白 胨 1 4. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L, NaCl 0. 5 3. 0g/L,己内酰胺 0. 5 2. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L，溶剂为 水，pH 6. 0 8. 0 ；(2)将种子液以1 10%体积比接入产酶培养基中，于20 40°C下培养48 96h，培 养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下 蔗糖5. 0 10. 0g/L,柠檬酸钠2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L, 氯化钠0. 5 2. 0g/L,磷酸二氢钾0. 5 2. 5g/L，氯化钴0. 005 0. 01g/L,氯化铁0. 005 0. 01g/L，氯化锰0. 005 0. 01g/L，诱导剂1. 0 3. 0g/L，溶剂为水，pH 6. 0 8. 0 ；所述诱 导剂为下列之一谷氨酸钠、2，2_ 二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下将所述含酶菌体细胞用 生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6. 0 10. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、 Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈至底物 浓度为0. 03 0. 3M，于15 40°C、100 200rpm下反应10 60min ；反应结束后，转化液 经分离纯化得到所述2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化 液12000rpm离心lOmin，收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽 滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0. IMpa，水浴加热温度 40 60°C、转速60 IOOrpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈和水，冷 却得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺粗品；将2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺粗品溶于20 65°C的乙酸乙酯，加入体积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烷，于0 4°C保温结晶；过滤， 取滤渣用正己烷洗涤，干燥得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺晶体。
8.庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii)ZJB_09153，保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo =M 2010050，保藏日期2010年3月10日。
9.小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)ZJB_09141，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo =M 209214，保藏日期2009年9月27曰。
全文摘要
本发明公开了一种微生物法生产咪唑啉酮类超高效除草剂中间体2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法及其过程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2，3-二甲基丁腈为原料，以通过发酵培养微生物庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)CCTCC NoM 2010050、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM 209214或红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC NoM 209244生产的腈水合酶为催化剂生产2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。本方法反应条件温和，废水排放少，环境友好；产率高，转化时间短，成本低，易于实现工业化生产。
文档编号C12P13/02GK101886096SQ20101020453
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者林志坚, 沈寅初, 郑仁朝, 郑裕国 申请人:浙江工业大学