专利名称：水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑 桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的快速检测技术。
背景技术：
黄单胞菌属Xanthomonas种类繁多，致病性多样，第2版的《伯杰氏系统细菌学手 册》收录了 20个种，70个分类地位已经确定的致病变种和70个分类地位尚不确定的致病 变种。现行的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中收录了 14个检疫性黄 单胞菌。水稻白口十枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)禾口水稻细菌性条斑病菌 (X. oryzae pv. oryzicola，Xooc)是水稻上重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌可造成水 稻减产10 % 30 %，严重时可达50 %以上。水稻细菌性条斑病菌可造成水稻减产5 % 10%，严重时可达20%。柑桔溃疡病菌(X. axonopodis pv. citri,Xac)能够侵染为害绝大 多数柑桔栽培品种，是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病菌。以上三者都是我国重 要的检疫性细菌。甘蓝黑腐病菌(X. campestris pv. campestris, Xcc)是十字花科植物重 要的病原菌，在世界范围内，尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物如甘蓝、花椰菜和 大白菜等发生黑腐病，对蔬菜生产造成严重的经济损失。若要有效防止上述4种黄单胞菌进境，就必须要有快速准确的诊断方法。鉴定黄 单胞菌的方法主要有生理生化方法、基于PCR技术的分子生物学方法等。生理生化方法， 操作步骤繁琐，一股鉴定一种菌需要15天左右的时间，太耗时，而且相关人员需要丰富的 经验。基于PCR技术的分子生物学，对黄单胞菌检测主要有普通PCR、双重PCR、实时荧光 PCR和滚环扩增等方法；这些方法存在易污染、灵敏度低，而且每次只能检测一种致病菌等 不足。
发明内容
本发明的目的是克服以上技术缺陷，提供一种快速检测水稻白叶枯病菌、水稻细 菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌的方法。水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方 法，包括如下步骤a、提取DNA 提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；b、DNA模板PCR反应以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR 产物；其中，引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,
正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R :TACCGGAGCTGCGCGTT,引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病 菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物&p0D-F/)(rp0D-R能对水 稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌 和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水 稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，引物XrpoD-F/XrpoD-R 与引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互干扰；c、杂交将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针 Xoo-Sl、探针Xooc-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc_S2，分别具有如下序列探针Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探针Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探针X00-Sl是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得 到的PCR产物设计的，探针Xoo-Sl对应水稻白叶枯病菌；探针X00C-Sl是根据水稻细菌性 条斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-SI 对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-Al是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-Al对应柑桔溃疡病菌；探针XCC-S2是根据甘 蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc_S2对 应甘蓝黑腐病菌；d、采集杂交结果；e、分析判断根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈 阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病 菌。进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其具有如下序列，阳性定位点探针 Pos-ck :NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG ；步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针 AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列，互补链探针AntiPos-ck Cy5-CCAAATTGATCCCACCC ；步骤e还包括将探针Xoo-Sl、探针Xooc-Sl、探针Xac-Al、探针Xcc_S2杂交结果与 阳性定位点探针Pos-Ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其具有如下序列， 阴性质控探针 Neg-CK :NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGACo进一步地，步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。进一步地，步骤a之前还包括菌种的培养的步骤；具体地，菌种的培养是指30°C 下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。本发明的再一目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、 柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物&p0D-F/&p0D-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病 菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物&p0D-F/)(rp0D-R能对水 稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增， 引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑 腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性 条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，引物XrpoD-F/XrpoD-R 与引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互干扰；特异性探针包括探针Xoo-Sl、探针Xooc-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc_S2，分别具有 如下序列探针Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探针Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探针X00-Sl是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得 到的PCR产物设计的，探针Xoo-Sl对应水稻白叶枯病菌；探针X00C-Sl是根据水稻细菌性 条斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-SI 对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-Al是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-Al对应柑桔溃疡病菌；探针XCC-S2是根据甘 蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc_S2对 应甘蓝黑腐病菌。本发明的第三目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物&p0D-F/&p0D-R 和探针Xoo-Sl，引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探针Xoo-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG ；引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设 计，引物&poD-F/)(rp0D-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-Sl是根据水 稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。本发明的第四目的是提供一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物&poD-F/ XrpoD-R和探针Xooc-Sl，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物&poD-F/&p0D-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-Sl是根 据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。本发明的第五目的是提供一种用于检测柑桔溃疡病菌的引物&p0D-F/&p0D-R 和探针Xac-Al，引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探针Xac-Al具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,引物&p0D-F/)(rp0D-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设 计，引物&p0D-F/&p0D-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-Al是根据柑桔 溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。本发明的第六目的是提供一种用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和 探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc_S2具有如下序列，正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG，反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,弓丨物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/ PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc_S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。本发明提供的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐 病菌的检测方法，通过采用弓I物&p0D-F/)(rp0D-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对弓|物同时对 检测样本潜在的4种病菌的DNA模板进行PCR反应，因此速度快。通过基因芯片上设置的 特异性探针与PCR产物杂交，能快捷准确得出反应结果阳性与否，这种杂交方法不易污染、 灵敏度高；采用基因芯片杂交结果判断检测结果，技术人员无需丰富的形态学知识和经验， 检测结果直观明确。
图1是基因芯片杂交结果一；图2是基因芯片杂交结果二 ；图3是基因芯片杂交结果三；图4是基因芯片杂交结果四；图5是基因芯片杂交结果五；图6是基因芯片杂交结果六。
具体实施例方式实施例1检测样本A是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤a、提取DNA 在30°C下、将检测样本A在营养琼脂培养基上培养2_3天；提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；细菌基因组DNA的提取是公知技术，本实施例中具体操作如下1) 1. 5mL菌液，室 温13000r/min离心5min，去上清；2)取沉淀加浓度为50g/L的溶菌酶100 μ L，悬浮菌液， 37° C，放置2h ;3)加入TE 385 μ L, 20% SDS 15 μ L，煮沸IOmin ;4)用等体积的酚氯仿抽 提，充分振荡混勻，4°C 13000r/min离心5min，将上清移至灭菌离心管；5)加ImL冰无水乙 醇，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ；6)4°C 13000r/min离心lOmin，弃上清，冰无水乙醇洗 涤1次，75%乙醇洗涤2次，溶解于100 μ L ddH20, _20°C保存备用。b、DNA模板PCR反应以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR 产物；其中，引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下 序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,
正向引物 PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT ；引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病 菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物&p0D-F/)(rp0D-R能对水 稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌 和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水 稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；引物XrpoD-F/XrpoD-R 与引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互干扰；PCR 反应体系为0· 25mmol/L IOXBuffer (Mg2+free)(大连宝生物)、2· Ommol/ L MgCl2 (大连宝生物)、0· 2mmol/L CY5_dNTPs (Amersham Biosciences 公司)、正向引物 (XrpoD-F, PSRG-F)和反向引物(XrpoD-R，PSRG-R)各 0. 2 μ mol/L、IU Taq 酶(大连宝生 物)、模板DNA 10 20ng，总体积25 μ L。标记PCR扩增在T3PCR仪(德国Biometra公司) 上进行，扩增条件为94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，共 30 个循环；72°C IOmin0c、杂交将PCR产物、互补链探针AntiPos-ck与基因芯片上的特异性探针杂 交；其中，基因芯片上的探针包括特异性探针Xoo-Sl、特异性探针Xooc-Sl、特异性探针 Xac-Al、特异性探针Xcc-S2、阳性定位点探针Pos-ck和阴性质控探针Neg_CK，各探针分别 具有如下序列互补链探针AntiPos-ck Cy5-CCAAATTGATCCCACCC ；探针Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探针Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,阳性定位点探针 Pos-ck NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG,阴性质控探针 Neg-CK NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC,互补链探针AntiPos-ck是阳性定位点探针Pos-ck的互补链探针，该探针可与阳性定位点探针Pos-ck杂交并使得阳性定位点探针Pos-ck显示阳性；探针Xoo-Sl是根 据水稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探 针Xoo-Sl对应水稻白叶枯病菌；探针X00c-Sl是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物 XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-SI对应水稻细菌性条斑病 菌；探针Xac-Al是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下扩增得到的PCR 产物设计的，探针Xac-Al对应柑桔溃疡病菌；探针XCC-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc_S2对应甘蓝黑腐病菌；基因芯片上还设置有空白对照，基因芯片上各特异性探针、阳性定位点探针、阴性 质控探针和空白对照具有表1所示的布局表 1
Pos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckXoo-SlXoo-SlXoo-SlXoo-SlXoo-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlPos-ckXac-AlXac-AlXac-AlXac-AlXac-AlXcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Pos- ckNeg-CKNeg-CKNeg-CKNeg-CKNeg-CK空白对 照空白对 照空白对 照空白对 照空白对 照芯片基片选择晶芯光学级醛基基片(北京博奥生物有限公司)；探针用TE缓冲液 (pH 8.0)稀释至终浓度40 μ mol/L，将50% DMSO加入384孔板中，再加入等量的探针溶液， 轻轻混勻，并按表1设计的探针顺序，用芯片点样仪(德国GeSim公司)将探针点至基片 上；点样后基片经37°C水合12h，用0. 2% SDS溶液漂洗5min ；去离子水分别漂洗3次，每 次2min ；再将基片放入0. 2% NaBH4封闭液中漂洗15min，前5min搅拌，中间5min静置，后 5min搅拌；去离子水漂洗3次，每次2min ；2000r/min室温离心2min，4°C避光保存；用激光 共聚焦扫描仪GenePix 4200A(美国Axon公司)对基片进行预扫描质检；杂交过程如下分别取杂交液7 μ L (2 % SDS和5 % SSPE等体积混合)、PCR产物 6 μ L和互补链探针AntiPos-Ck 1 μ L，混勻后95°C变性5min，立即于冰水中放置5min。将 变性后的混合物加入基因芯片点样区，盖上盖玻片置于湿盒中50°C避光杂交3h。杂交后的 基因芯片依次在洗液I (0.3X SSC，0.2% SDS)和洗液II (0. 06X SSC)中各清洗2min，室温 2000r/min 离心 2min。d、采集杂交结果；用激光共聚焦扫描仪扫描基因芯片，用GenePix 5. 0软件分析 扫描得到的图像，杂交结果如图1所示。e、分析判断根据采集到的杂交结果，同时参照基因芯片上的阳性定位点探针 Pos-Ck杂交结果、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，判断探针X00-S1、探针Xooc-S 1、探针 Xac-Al和探针Xcc-S2的杂交结果阳性与否，来判断检测样本A中是否含有探针Xoo-Sl、探 针X00c-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc-S2对应的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔 溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病 菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。在本实施例中探针Xoo-Sl、探针Xooc-Sl、探针Xac-ΑΙ和探针Xcc_S2均为阳性， 因此检测样本A含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌。实施例2检测样本B是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图2所示，即探针 Xoo-Sl为阳性，因此检测样本B含有水稻白叶枯病菌，不含水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡 病菌和甘蓝黑腐病菌。实施例3检测样本C是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图3所示，即探针 Xooc-Sl为阳性，因此检测样本C含有水稻细菌性条斑病菌，不含水稻白叶枯病菌、柑桔溃 疡病菌和甘蓝黑腐病菌。实施例4检测样本D是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图4所示，即探针 Xac-Al为阳性，因此检测样本D含有柑桔溃疡病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑 病菌和甘蓝黑腐病菌。实施例5检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图5所示，即探针 Xcc-S2为阳性，因此检测样本E含有甘蓝黑腐病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑 病菌和柑桔溃疡病菌。实施例6检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图6所示，即探针 Xoo-Sl、探针X00c-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc_S2均为阴性，因此检测样本F不含有水稻白 叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种病菌。实施例7用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌 的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对 引物，分别具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT。引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病 菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物&p0D-F/)(rp0D-R能对水 稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增； 引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑 腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性
10条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；并且引物&p0D-F/)(rp0D-R与引物PSRG-F/ PSRG-R不相互干扰。 特异性探针包括探针Xoo-Sl、探针Xooc-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc_S2，分别具有 如下序列探针Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探针Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探针X00-Sl是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得 到的PCR产物设计的，探针Xoo-Sl对应水稻白叶枯病菌；探针X00C-Sl是根据水稻细菌性 条斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-SI 对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-Al是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-Al对应柑桔溃疡病菌；探针XCC-S2是根据甘 蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc_S2对 应甘蓝黑腐病菌。实施例8用于检测水稻白叶枯病菌的引物&poD-F/)(rp0D-R和探针Χοο-Sl，引物&p0D_F/ XrpoD-R和探针Xoo-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAGo引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设 计，引物&poD-F/)(rp0D-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-Sl是根据水 稻白叶枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。实施例9用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探针Xooc-S 1，引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xooc-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAGo引物&p0D-F/)(rp0D-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设 计，引物&poD-F/&p0D-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-Sl是根 据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。实施例10用于检测柑桔溃疡病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探针Xac_Al，引物&p0D_F/ XrpoD-R和探针Xac-Al具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探针Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,
引物&p0D-F/)(rp0D-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设 计，引物&p0D-F/&p0D-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-Al是根据柑桔 溃疡病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。实施例11用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc_S2，引物PSRG-F/ PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，探针Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC 弓丨物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/ PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc_S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。实施例12 28采用已知样本病菌作为检测样本，并采用实施例1完全相同的检 测方法进行检测，以验证引物、探针的有效性和特异性；各实施例具体数据如表2所示。表2
实 施例检测样 本序号样本名称来源检测结果结论12G水稻白叶枯病 菌南京农业大学探针Xoo-Sl呈阳性探针Xoo-Sl及引物对 样本病菌有效13H水稻白叶枯病 菌南京农业大学探针Xoo-Sl呈阳性探针Xoo-Sl及引物对 样本病菌有效14I水稻白叶枯病 菌中国检验检疫科学 研究院探针Xoo-Sl呈阳性探针Xoo-Sl及引物对 样本病菌有效15J水稻细菌性条 斑 病菌南京农业大学探针Xooc-Sl呈阳性探针Xooc-Sl及引物 对样本病菌有效16K水稻细菌性条 斑 病菌南京农业大学探针Xooc-Sl呈阳性探针Xooc-Sl及引物 对样本病菌有效17L水稻细菌性条 斑 病菌中国检验检疫科学 研究院探针Xooc-Sl呈阳性探针Xooc-Sl及引物 对样本病菌有效18M柑桔溃疡病菌南京农业大学探针Xac-Al呈阳性探针Xac-Al及引物对 样本病菌有效19N柑桔溃疡病菌中国检验检疫科学 研究院探针Xac-Al呈阳性探针Xac-Al及引物对 样本病菌有效200甘蓝黑腐病菌南京农业大学探针Xcc-S2呈阳性探针Xcc-S2及引物对 样本病菌有效21P甘蓝黑腐病菌中国检验检疫科学 研究院探针Xcc-S2呈阳性探针Xcc-S2及引物对 样本病菌有效22Q玉米细菌性枯 萎 病菌深圳出入境检验检 疫局动植中心探针X。。-Si、探针X。。c-Si、探针 Xac-Al、探针Xcc-S2均阴性探针相对样本病菌具 有特异性23R西瓜果斑病菌中国农业大学种子 健康检测中心同上探针相对样本病菌具 有特异性24S洋葱腐烂病菌中国农业大学种子 健康检测中心同上探针相对样本病菌具 有特异性
12 由表1可知，引物&p0D-F/)(rp0D-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌有效扩增，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶 枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌三种黄单胞菌有效扩增，探针Xoo-Sl、探针 Xooc-Sl、探针Xac-Al、探针Xcc_S2具有特异性。 实施例1 6、12 28均设置了用于质控杂交、方便判断杂交结果阳性与否的阳 性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照；阳性定位点探针Pos-Ck、阴性质 控探针Neg-CK和空白对照，不是本发明中所必需的，熟练的检测人员可以在不设置阳性定 位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照的情况下做好杂交质控、判断杂交结果 阳性与否。
权利要求
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤a、提取DNA提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；b、DNA模板PCR反应以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，引物包括引物XrpoD F/XrpoD R和引物PSRG F/PSRG R两对引物，分别具有如下序列，正向引物XrpoD FCGGCTTCAACGACCTGATY，反向引物XrpoD RGAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，正向引物PSRG FGAATATCAGCATCGGCAACAG，反向引物PSRG RTACCGGAGCTGCGCGTT；c、杂交将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo S1、探针Xooc S1、探针Xac A1和探针Xcc S2，分别具有如下序列探针Xoo S1NH2 TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，探针Xooc S1NH2 TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，探针Xac A1NH2 TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，探针Xcc S2NH2 TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，探针Xoo S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc S2对应甘蓝黑腐病菌；d、采集杂交结果；e、分析判断根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
2.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌 和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针 Pos-ck，其具有如下序列，阳性定位点探针 Pos-ck :NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG ； 步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针 AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列， 互补链探针 AntiPos-ck :Cy5_CCAAATTGATCCCACCC ；步骤e还包括将探针Xoo-S 1、探针Xooc-S 1、探针Xac-Al、探针Xcc_S2杂交结果与阳性 定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
3.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK， 其具有如下序列，阴性质控探针 Neg-CK :NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGACo
4.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
5.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘 蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是步骤a之前还包括培养检测样本的步骤。
6.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是培养检测样本是指30°C下、将检测样本在营养琼脂培 养基上培养2-3天。
7.用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌 的PCR引物和特异探针，其特征是PCR引物包括引物&p0D-F/)(rp0D-R和引物PSRG-F/ PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R :GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 正向引物 PSRG-F :GAATATCAGCATCGGCAACAG, 反向引物 PSRG-R :TACCGGAGCTGCGCGTT ；特异性探针包括探针Xoo-Sl、探针X00c-Sl、探针Xac-Al和探针Xcc_S2，分别具有如下 序列探针 Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG, 探针 Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG, 探针 Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC, 探针 Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探针Xoo-Sl对应水稻白叶枯病菌；探针X00C-Sl对应水稻细菌性条斑病菌；探针 Xac-Al对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
8.用于检测水稻白叶枯病菌的引物&poD-F/)(rp0D-R和探针Xoo-Sl，其特征是引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探针 Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAGo
9.用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探针Xooc-Sl，其特征是 引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探针Xooc-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探针 Xooc-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAGo
10.用于检测柑桔溃疡病菌的引物&p0D-F/&p0D-R和探针Xac-Al，其特征是引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-Al具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探针 Xac-Al :NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGACo
全文摘要
本发明公开了水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，本方法通过两对引物同时对检测样本的DNA模板进行PCR反应扩增得到PCR产物，然后PCR产物与基因芯片上设置的特异性探针杂交，根据杂交结果阳性与否，来判断出检测样本是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌或甘蓝黑腐病菌；本发明能一次性对4种细菌完成检测，检测速度快，并且检测结果直观明了，容易判断。
文档编号C12Q1/68GK101921843SQ201010218670
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者李一农, 李芳荣, 郑耘, 龙海 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心;深圳市检验检疫科学研究院