专利名称：一种污染物致dna去甲基化能力定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法。
背景技术：
有毒有害的污染物在人类生存环境中广泛存在。为了 了解各种污染物的健康危害 能力大小，为公众提供一个相对安全健康的生产生活环境，对食品、饮用水、空气中的污染 物的健康损害能力进行检测已经成为食品安全、饮用水安全、环境保护、公共卫生等相关领 域的重要内容。近年来研究发现污染物可以通过改变人体DNA的甲基化水平，进而影响关 键基因表达并导致白血病等各种严重的健康损害。污染物去甲基化能力越强，其导致人体 产生健康损害的风险就越大。对污染物的去甲基化能力进行定量检测已经成为多方关注的 内容。由于缺乏相关理论技术支持，目前尚没有成熟的检测技术可以用于评价污染物致DNA 去甲基化的能力强弱。目前污染物的健康危害检测方法主要包括一般毒性试验和致突变、致癌、致畸等 特殊毒性试验，其中基因突变等遗传学损伤能力评估是人们关注的重点。许多所谓“安全” 的污染物其实并不安全，一些通过现有安全性评价检测的污染物，没有发现存在明显的基 因突变、染色体畸变等损伤能力，却依然可以通过致人体DNA去甲基化的途径导致癌症等 健康危害。污染物的致DNA去甲基化的能力目前尚没有方法进行定量评价。国外有学者曾尝试利用分子重组技术来检测去甲基化污染物。但是无法对污染物 的去甲基化能力进行定量，也没有实际应用的报道(Okochi-Takada E, Ichimura S5Kaneda A, et al. Establishment of a detection system fordemethylating agents using an endogenous promoter CpG island. Mutat Res, 2004 ；568 (2) 187-94.) 我国有学者提出 可以在常规的动物实验中，进一步分析DNA的甲基化水平；但由于难以操作，截至目前仍没 有比较成熟的检测技术出现(杨建平，朱志良，袁建辉，等.DNA甲基化在毒理学中的应用前 景·环境与职业医学，2007 ；24 (5) 546-9.)。总体来说，目前的检测方法只关注了污染物导致人体健康损害能力的一个方面； 而对于污染物致人体DNA去甲基化的能力，目前由于缺乏相应的检测方法不能进行定量检 测。
发明内容
为了检测污染物致人体DNA去甲基化的能力，评估其进入人体后的健康损害风 险，本发明的目的在于创立一种快速、简易、可定量的污染物致人DNA去甲基化能力检测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括荧光质粒的人工甲基化处理方法； 高甲基化荧光质粒转染Hela细胞制备重组细胞株；污染物样品前处理；5-AZA标准系列与 重组细胞株的同步共培养；受试样品与重组细胞株的同步共培养；重组细胞株的荧光摄片 与荧光强度处理；污染物去甲基化能力检测标准曲线的绘制；受试样品污染物去甲基化能力的定量检测。具体步骤为1、荧光质粒的甲基化处理购买绿色荧光质粒EGFP-C3，以下简称C3质粒，采用 DNA甲基化酶Msss. I，对C3质粒进行人工甲基化处理，使C3质粒中的EGFP基因CMV启动 子区处于70 95%的高甲基化状态；2、高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株将制备获得的高甲基化的C3质粒转 染进入Hela细胞，制备Hela重组细胞株，然后将Hela重组细胞株传代于24孔板中；3、污染物样品前处理在各种污染物样品中加入硝酸，普通电热板上400°C消化1 小时，待液体变澄清后烘干得到结晶，加入水将烧杯中结晶溶解备用；4、5-甲基胞嘧啶与重组细胞株的同步共培养以5-甲基胞嘧啶，以下简称5-AZA， 配置标准系列，取10 μ 1的5-ΑΖΑ标准系列溶液分别加入到500 μ 1的细胞培养液中，与 Hela重组细胞株进行共培养18 36小时，使培养终浓度分别为0. 0016μΜ,0. 008 μ Μ, 0· 04μΜ，0· 2μΜ ；污染物样品与重组细胞株的同步共培养取步骤3中10 μ 1的上述污染物结晶溶 解液，加入到Hela重组细胞株培养液中，与5-ΑΖΑ标准系列进行同步共培养18 36小时；5、重组细胞株的荧光摄片与处理对24孔板中的受试细胞株进行荧光摄片，每个 细胞孔随机选取6-10个视野，每个视野摄片1次；对每个照片的荧光强度进行定量，获取每 个受试细胞孔的荧光强度；6、标准曲线的制备将标准系列细胞孔的5-ΑΖΑ浓度与其荧光强度进行回归拟 合，制备标准曲线；横坐标为5-ΑΖΑ的浓度，纵坐标为相应的荧光强度；7、污染物去甲基化能力的定量检测针对每个样品细胞孔中的摄片荧光强度具体 数值，依据标准曲线得到相应的5-ΑΖΑ的浓度当量；该当量表示其导致人DNA去甲基化的能 力的具体强度。利用本方法对各种样品的DNA去甲基化能力进行检测，具有以下特点1、本发明以人工改造的重组Hela细胞株为主要工具，按照全新的思路对污染物 的去甲基化能力进行定量检测，方法原理和技术路线为国内外首创，与此类似方法的报道 和专利尚未发现。2、本发明提出对污染物的DNA去甲基化能力进行定量检测，填补了国内外缺乏污 染物去甲基化能力检测方法的空白。3、本发明以细胞荧光为检测 应终点，方法操作简单，步骤简易。4、本发明以重组细胞株与污染物共培养为主要检测手段，主要工作可以在3天内 完成，属于快速生物检测方法。5、本发明以荧光显微镜为主要检测工具，在具有普通细胞培养条件的实验室就可 以进行，硬件设施要求较低，易于推广应用。
图1 污染物去甲基化能力检测原理。说明共培养化学物质A的去甲基化能力越强，则培养细胞内绿色荧光蛋白基因 启动子区甲基化水平越低，受试细胞发出的绿色荧光会增强(上)；共培养化学物质B的去 甲基化功能越弱，则培养细胞内绿色荧 蛋白基因启动子区甲基化水平几乎不变，受试细胞发出的绿色荧光相对越弱(下)。图2 本发明中所用重组细胞株绿色荧光质粒(EGFP-C3)组成示意图。说明其中CMV启动子区(来自于巨细胞病毒DNA的启动子序列)甲基化水平降 低时，可以导致下游绿色荧光蛋白(EGFP)表达量上升，可以观察到增强的绿色荧光。图3 本发明中所用5-甲基胞嘧啶(5-AZA)标准系列(AB⑶分别对应于 0. 0016 μ M，0. 008 μ Μ, 0. 04 μ Μ, 0. 2 μ Μ)的代表性细胞绿色荧光图片。图4 本发明中受试样品去甲基化能力定量所用的代表性标准曲线。说明其中χ代表细胞孔中5-甲基胞嘧啶(5-ΑΖΑ)的浓度，单位为μ M ;y代表细 胞孔的平均荧光强度，单位为流明。
具体实施例方式实施1下面以污染海岸可食水产品的去甲基化能力定量检测为例，对本发明做进一步的 详细说明。具体步骤如下(1)荧光质粒的甲基化处理购买美国Clontech公司的EGFP-C3质粒(以下简称C3质粒)。购买美国NEB公 司的DNA甲基化酶Msss. I。将C3质粒与DNA甲基化酶Msss. I等混合，37°C孵育3小时， 使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于高甲基化状态。具体反应体系组成4 μ 1的 缓冲液原液(10ΧΝΕ Buffer2),4y 1的S腺苷蛋氨酸原液(IOOXSAM)Ayl的C3质粒 DNA(1. 7μΜ)，6μ 1 的甲基化酶 Μ. SssI，补充 18 μ 1 的双蒸水到 40 μ 1(10 X NE Buffer2 缓 冲液原液，100XSAM腺苷蛋氨酸原液均随所购买的美国NEB公司DNA甲基化酶Msss. I试剂 盒免费提供，其具体组成在说明书中有详细说明)。依据测序结果计算出CMV启动子区DNA 的甲基化水平为70%。(2)高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株购买瑞士罗氏公司的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)。将制备获得的高甲基化 的C3质粒转染进入Hela细胞得到重组细胞株，每细胞孔需要加入的试剂如下将2. 5 μ 1 甲基化C3质粒预先加入到25 μ 1的专用优化培养基(optim-Mem)中，混勻。再加入FuGENE HD专用转染试剂(FuGENE HDTransfection Reagent) 2 μ 1后轻轻混勻，室温放置15min，逐 滴加入到平板细胞孔培养基中，缓慢混勻，放入细胞培养箱中，37°C、5% 二氧化碳(与空气 体积百分比)的条件下放置6小时(optim-Mem专用优化培养基随所购买的瑞士罗氏公司 的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)免费提供，其具体组成在说明书中有详细说明)。(3)污染水产品前处理采集污染海岸的19个新鲜水产品，分别编号为TJ01、TJ02........TJ19。4°C冷
藏带回实验室。剪刀剪碎，120°C烘箱中过夜烘干，研钵研成粉末。分别称取0.5克的粉末 到干净烧杯中，加入70%硝酸10ml，电热板上400°C消化1小时，待液体变澄清后烘干得到 白色结晶，加入1.0ml的水将烧杯中白色结晶溶解备用。(4) 5-AZA标准系列制备与重组细胞株的共培养5-甲基胞嘧啶(5-AZA)是具有明确去甲基化作用的药物。从美国Sigma公司购 买5-甲基胞嘧啶(5-AZA)制备5-AZA标准品，以细胞培养基为稀释液，制备5-AZA标准品梯度系列，每个剂量梯度做3个平行对照细胞孔，每孔中分别加入相应剂量梯度的5-AZA溶 液10 μ 1，混勻，使5-ΑΖΑ终浓度分别为0,0. 0016,0. 008,0. 04,0. 2 μ M0 37°C常规细胞培养 箱中培养24小时。(5)受试样品与重组细胞株的同步共培养将19个细胞孔依次标记为TJ01、TJ02........TJ19，分别加入相应编号的污染水
产提取溶液 ο μ 1，混勻，37°C常规细胞培养箱中同步培养24小时。(6) 5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔的荧光摄片与处理通过Olympus荧光显微镜分别对24孔板中5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔 进行摄片，每孔随机选取6个视野，每个视野摄取照片1次；运用Image Pro PLUS软件的直 方图功能对每张图片的绿色荧光强度进行定量。(7)标准曲线的制备将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其平均荧光强度进行拟合，得到标准曲线方程 为Y = 0. 242Ln(x)+41. 143。其中χ代表细胞孔中5-AZA的浓度，单位为μ M ;y代表细胞 孔的平均荧光强度，单位为流明。(8)水产品去甲基化能力的定量依据标准曲线和荧光强度计算受试水产品的去甲基化能力。发现9种水产的 去甲基化能力较强，分别相当于 0. 0064,0. 007,0. 0074,0. 0082,0. 0183,0. 0202,0. 0203、 0. 0326,0. 0387μΜ的5-AZA。占总体19个受试样品的47%，毒性最强的水产品去甲基化能 力相当于的0. 0387 μ M的5-ΑΖΑ。实施2下面以地下水样品的去甲基化能力定量检测为例，对本发明做进一步的详细说 明。具体步骤如下(1)荧光质粒的甲基化处理购买美国Clontech公司的EGFP-C3质粒(以下简称C3质粒)。购买美国NEB公 司的DNA甲基化酶Msss. I。将C3质粒与DNA甲基化酶Msss. I等混合，37°C孵育3小时， 使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于高甲基化状态。具体反应体系组成4 μ 1的 缓冲液原液(10ΧΝΕ Buffer2),4y 1的S腺苷蛋氨酸原液(IOOXSAM)Ayl的C3质粒 DNA(1. 7μΜ)，6μ 1 的甲基化酶 Μ. SssI，补充 18 μ 1 的双蒸水到 40 μ 1(10 X NE Buffer2 缓 冲液原液，100XSAM腺苷蛋氨酸原液均随所购买的美国NEB公司DNA甲基化酶Msss. I试剂 盒免费提供，其具体组成在试剂盒说明书中有详细说明)。依据测序结果计算出CMV启动子 区DNA的甲基化水平为80 %。(2)高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株购买瑞士罗氏公司的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)。将制备获得的高甲基化 的C3质粒转染进入Hela细胞得到重组细胞株，每细胞孔需要加入的试剂如下将2. 5 μ 1 甲基化C3质粒预先加入到25 μ 1的专用优化培养基(optim-Mem)中，混勻。再加入FuGENE HD专用转染试剂(FuGENE HDTransfection Reagent) 2 μ 1后轻轻混勻，室温放置15min，逐 滴加入到平板细胞孔培养基中，缓慢混勻，放入细胞培养箱中，37°C、5% 二氧化碳(与空气 体积百分比)的条件下放置6小时(optim-Mem专用优化培养基随所购买的瑞士罗氏公司 的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)免费提供，其具体组成在说明书中有详细说明)。
(3)地下水样品前处理采集淮河流域某地的地下水8个，分别编号为DX1、DX2........DXS0 4°C冷藏带
回实验室。取0. 5ml的地下水样品到干净烧杯中，加入70%硝酸10ml，电热板上400°C消化 1小时，待液体变澄清后烘干得到白色结晶，加入1.0ml的水将烧杯中白色结晶溶解备用。(4) 5-AZA标准系列制备与重组细胞株的共培养5-甲基胞嘧啶(5-AZA)是具有明确去甲基化作用的药物。从美国Sigma公司购 买5-甲基胞嘧啶(5-AZA)制备5-AZA标准品，以细胞培养基为稀释液，制备5-AZA标准品 梯度系列，每个剂量梯度做3个平行对照细胞孔，每孔中分别加入相应剂量梯度的5-AZA溶 液10 μ 1，混勻，使5-ΑΖΑ终浓度分别为0,0. 0016,0. 008,0. 04,0. 2 μ M0 37°C常规细胞培养 箱中培养18小时。(5)受试样品与重组细胞株的同步共培养将8个细胞孔依次标记为DX01、DX02........DX8，分别加入相应编号的地下水样
品提取溶液IOy 1，混勻，37°C常规细胞培养箱中同步培养18小时。(6) 5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔的荧光摄片与处理通过Olympus荧光显微镜分别对24孔板中5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔 进行摄片，每孔随机选取6个视野，每个视野摄取照片1次；运用Image Pro PLUS软件的直 方图功能对每张图片的绿色荧光强度进行定量。(7)标准曲线的制备将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其平均荧光强度进行拟合，得到标准曲线方程 为Y = 0. 287Ln(x)+42. 596。其中χ代表细胞孔中5-AZA的浓度，单位为μ M ;y代表细胞 孔的平均荧光强度，单位为流明。(8)地下水样品去甲基化能力的定量依据标准曲线和荧光强度计算受试地下水样品的去甲基化能力。发现2种地下水 样品的去甲基化能力较强，分别相当于0. 0067 μ M和0. 0196 μ M的5-ΑΖΑ。占总体8个受试 样品的25%。实施3下面以地表水样品的去甲基化能力定量检测为例，对本发明做进一步的详细说 明。具体步骤如下(1)荧光质粒的甲基化处理购买美国Clontech公司的EGFP-C3质粒(以下简称C3质粒)。购买美国NEB公 司的DNA甲基化酶Msss. I。将C3质粒与DNA甲基化酶Msss. I等混合，37°C孵育3小时， 使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于高甲基化状态。具体反应体系组成4 μ 1的 缓冲液原液(10ΧΝΕ Buffer2),4y 1的S腺苷蛋氨酸原液(IOOXSAM)Ayl的C3质粒 DNA(1. 7μΜ)，6μ 1 的甲基化酶 Μ. SssI，补充 18 μ 1 的双蒸水到 40 μ 1(10 X NE Buffer2 缓 冲液原液，100X SAM腺苷蛋氨酸原液均随所购买的美国NEB公司DNA甲基化酶Msss. I试剂 盒免费提供，其具体组成在说明书中有详细说明)。依据测序结果计算出CMV启动子区DNA 的甲基化水平为95%。(2)高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株购买瑞士罗氏公司的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)。将制备获得的高甲基化的C3质粒转染进入Hela细胞得到重组细胞株，每细胞孔需要加入的试剂如下将2. 5 μ 1 甲基化C3质粒预先加入到25 μ 1的专用优化培养基(optim-Mem)中，混勻。再加入FuGENE HD专用转染试剂(FuGENE HDTransfection Reagent) 2 μ 1后轻轻混勻，室温放置15min，逐 滴加入到平板细胞孔培养基中，缓慢混勻，放入细胞培养箱中，37°C、5% 二氧化碳(与空气 体积百分比)的条件下放置6小时(optim-Mem专用优化培养基随所购买的瑞士罗氏公司 的专用质粒转染试剂盒(FuGENE HD)免费提供，其具体组成在说明书中有详细说明)。(3)地表水样品前处理采集淮河流域某地的地表水12个，分别编号为DB1、DB2........DB12。4°C冷藏
带回实验室。取地表水IOml过滤，去除悬浮物杂质；然后取0. 5ml的地表水样品到干净烧 杯中，加入70%硝酸IOml，电热板上400°C消化1小时，待液体变澄清后烘干得到白色结晶， 加入1. Oml的水将烧杯中白色结晶溶解备用。(4) 5-AZA标准系列制备与重组细胞株的共培养5-甲基胞嘧啶(5-AZA)是具有明确去甲基化作用的药物。从美国Sigma公司购 买5-甲基胞嘧啶(5-AZA)制备5-AZA标准品，以细胞培养基为稀释液，制备5-AZA标准品 梯度系列，每个剂量梯度做3个平行对照细胞孔，每孔中分别加入相应剂量梯度的5-AZA溶 液10 μ 1，混勻，使5-ΑΖΑ终浓度分别为0,0. 0016,0. 008,0. 04,0. 2 μ M0 37°C常规细胞培养 箱中培养36小时。(5)受试样品与重组细胞株的同步共培养将12个细胞孔依次标记为DB01、DB02........DB12,分别加入相应编号的污染地
表水样品提取溶液IOy 1，混勻，37°C常规细胞培养箱中同步培养36小时。(6) 5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔的荧光摄片与处理通过Olympus荧光显微镜分别对24孔板中5-AZA标准系列细胞孔和样品细胞孔 进行摄片，每孔随机选取6个视野，每个视野摄取照片1次；运用Image Pro PLUS软件的直 方图功能对每张图片的绿色荧光强度进行定量。(7)标准曲线的制备将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其平均荧光强度进行拟合，得到标准曲线方程 为Y = 0. 318Ln(x)+38. 125。其中χ代表细胞孔中5-AZA的浓度，单位为μ M ;y代表细胞 孔的平均荧光强度，单位为流明。(8)地表水样品去甲基化能力的定量依据标准曲线和荧光强度计算受试的去甲基化能力。发现5种地表水样品的去 甲基化能力较强，分别相当于 0. 0196μΜ、0· 0196μΜ、0· 0067μΜ、0· 0196μΜ、0· 0196 μ Μ、的 5-ΑΖΑ。占总体12个受试样品的42 %。
权利要求
一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法，其特征在于，步骤为1)、荧光质粒的甲基化处理购买绿色荧光质粒EGFP-C3，以下简称C3质粒，采用DNA甲基化酶Msss.I，对C3质粒进行人工甲基化处理，使C3质粒中的EGFP基因CMV启动子区处于70～95％的高甲基化状态；2)、高甲基化荧光质粒转染Hela重组细胞株将制备获得的高甲基化的C3质粒转染进入Hela细胞，制备Hela重组细胞株，然后将Hela重组细胞株传代于24孔板中；3)、污染物样品前处理在各种污染物样品中加入硝酸，普通电热板上400℃消化1小时，待液体变澄清后烘干得到结晶，加入水将烧杯中结晶溶解备用；4)、5-甲基胞嘧啶与重组细胞株的同步共培养以5-甲基胞嘧啶，以下简称5-AZA，配置标准系列，取10μl的5-AZA标准系列溶液分别加入到500μl的细胞培养液中，与Hela重组细胞株进行共培养18～36小时，使培养终浓度分别为0.0016μM，0.008μM，0.04μM，0.2μM；污染物样品与重组细胞株的同步共培养取步骤3)中10μl的上述污染物结晶溶解液，加入到Hela重组细胞株培养液中，与5-AZA标准系列进行同步共培养18～36小时；5)、重组细胞株的荧光摄片与处理对24孔板中的受试细胞株进行荧光摄片，每个细胞孔随机选取6-10个视野，每个视野摄片1次；对每个照片的荧光强度进行定量，获取每个受试细胞孔的荧光强度；6)、标准曲线的制备将标准系列细胞孔的5-AZA浓度与其荧光强度进行回归拟合，制备标准曲线；横坐标为5-AZA的浓度，纵坐标为相应的荧光强度；7)、污染物去甲基化能力的定量检测针对每个样品细胞孔中的摄片荧光强度具体数值，依据标准曲线得到相应的5-AZA的浓度当量；该当量表示其导致人DNA去甲基化的能力的具体强度。
全文摘要
一种污染物致DNA去甲基化能力定量检测方法属于污染物健康损害能力检测方法领域，目前尚没有成熟的检测技术可以用于评价污染物致DNA去甲基化的能力强弱。本发明步骤荧光质粒的人工甲基化处理；高甲基化荧光质粒转染Hela细胞制备重组细胞株；污染物样品前处理；5-甲基胞嘧啶标准系列与重组细胞株的共培养及受试样品与重组细胞株的同步共培养；重组细胞株的荧光摄片与荧光强度处理；污染物去甲基化能力检测标准曲线的绘制；受试样品污染物去甲基化能力的定量检测。受试细胞发出的绿色荧光会越亮，表示污染物去甲基化能力越强，导致人体产生健康损害的风险就越大。本发明创立一种快速、简易、可定量的检测方法，用于评价污染物致人DNA去甲基化能力。
文档编号C12Q1/68GK101886130SQ20101021939
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者王先良 申请人:中国环境科学研究院