专利名称：一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒及其使用方法，更具体地涉及一种直接真菌检测鲎试剂盒 及方法。
背景技术：
目前诊断患者是否患有真菌感染，尤其是深部真菌感染或真菌脓毒血症仍然 是临床医师十分棘手的难题。现行临床上采用血液培养来诊断是否真菌感染，所需的时间 比较长，而且由于广谱抗生素的使用很多，有很多病人采用血液培养检测不出真菌。在这种 背景下，临床医师急需要一种能快速、准确判定是否为真菌感染的试剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法，该试剂盒 能快速、准确地定量人体血液及体液标本中的微量(1 一 3) — β — D —葡聚糖。本发明的直接真菌检测鲎试剂盒，所述试剂盒组成包括
(1)G试剂为鲎血球细胞溶解物与发色物质的混合物；
(2)缓冲液0.02 0. lmol/L Tris-HCl ；
(3)标准品(1- 3) - β —D —葡聚糖；
(4)重氮化试剂；
(5)血液处理液。所述试剂盒中的试剂配制如下
(1)所述发色物质为0.25 0. 8mg/ml Boc-LGR-pNA (购自日本生化学工业株式会社)， 配制为称取发色物质Boc-LGR-pNA 25 80mg，用无菌无热原水溶解并定容至IOOml ；
(2)所述缓冲液为0.02 0.lmol/L Tris-HCl, pH 7. 6 8. 2，配制为称取Tris碱 2. 42^12. llg，先加入500ml无菌无热原水溶解，接着加入37%浓盐酸调节pH 7. 6^8. 2，再定 容至 IOOOml ；
(3)所述洗脱液为四种不同盐浓度的洗脱液
①0. 01 0. 07mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2
称取干热灭菌后的氯化钠0. 585 4. 095g,接着用0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/ Ph7. 4 8· 2 定容到 1000ml ；
②0. 2 0. 28mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2
称取干热灭菌后的氯化钠11. 7 16. 38g，接着用0.005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；
③0. 45 0. 6mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2
称取干热灭菌后的氯化钠26. 325 35. lg，接着用0.005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；
④1. 8 2. lmol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2称取干热灭菌后的氯化钠105. 3 122. 85g，接着用0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；
(4)所述重氮化试剂为0. 01 0. 07%(重量比，下同)亚硝酸钠、0. 1 0. 45%氨基磺 酸铵以及0. 02 0. 2%萘基盐酸二氨基乙烯；分别配制如下
①0. 01 0. 07%亚硝酸钠
称取亚硝酸钠0. 0Γ0. 07g，用0. 35mol/L盐酸溶液定容至IOOml ；所述0. 35mol/L盐 酸溶液配制为量取37%浓盐酸3. 5ml，再用无菌无热原水定容至IOOml ；
②0.1 0. 45%氨基磺酸
称取氨基磺酸0. Γ0. 45g，用无菌无热原水定容至IOOml ；
③0.02 0. 2%萘基盐酸二氨基乙烯
称取萘基盐酸二氨基乙烯0. 02、. 2g，用无菌无热原水定容至100ml。(5)所述血液处理液为0. 4 0. 8mol/L KC1、0. 08 0. 15mol/L K0H,分别配制如下
①称取KCl29.8 59.68，在2501干热灭菌150min后，加入无菌无热原水定容至 IOOOml；
②称取KOH4. 48 8. 4g，用无菌无热原水定容至1000ml。所述G试剂的制备如下
(1)活鲎加抗凝剂采血后，于IOOOrpm离心，弃上清液，收集细胞；再加入3倍体积的 洗涤液洗涤，弃去上清液；所述洗涤液为0. 5 3. 5mol/L NaCl/0. θΓθ. 2mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 ；配制为称取干热灭菌后的氯化钠117g，接着用0. lmol/L Tris-HCl/pH8. 0定 容到 1000ml ；
(2)收集的细胞按6倍体积加入崩解液进行细胞崩解；之后进行离心，收集上清液；所 述崩解液为 0. 01 0. 25mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8. 2，配制为 称取干热灭菌后的氯化钠0. 585 14. 625g，接着用0. 005 0. 035mol/L Tris_HCl/Ph7. 4 8. 2 定容到IOOOml0(3)收集的上清液进亲和层析柱，所述亲和层析柱的固定相为Dextran Sulfate Sepharose C1-6B，用洗脱液洗柱，收集不同盐浓度洗脱液；
(4)对洗脱液用标准蛋白做参照进行电泳鉴别后，将相同分子量的成分的洗脱液进行 合并，用冷冻干燥机进行低温浓缩，在0 _40°C下浓缩至原体积的8% 15% ；
(5)浓缩液用无菌无热原水重新复溶，用Si^phadexG-50柱进行脱盐，并收集不含盐的 洗脱液；
(6)再进行低温浓缩；
(7)将浓缩液加入发色物质使其浓度达到0.65mg/ml，混合均勻后，进行分装、冻干，即 得到G试剂。
本发明的直接真菌检测鲎试剂盒的使用方法，依次包括以下步骤
(1)样品、标准品处理样品各取100μ 1分装入小试管中，各加入血液处理液(含 有体积比 1 1 的 0. 4 0. 8mol/L KCl 和 0. 08 0. 15mol/L Κ0Η) 100 μ 1，37°C水浴 IOmin ；将 (1-3)- β 一 D—葡聚糖稀释成系列浓度，分装入小试管中，每管200μ1 ；所述样品为人 的血清；
(2)配制G试剂溶液0. 5ml 1. 5ml G试剂用0. 5ml 1. 5ml缓冲液溶解，用灭菌锡箔纸盖上，并用手轻轻摇动溶解后放入冰水浴中冷却；由于G试剂灵敏度高，尽可能一 次性使用完；
(3)分装G试剂溶液将G试剂溶液分装于步骤1所述装有处理后的样品与(1 -3) — β — D—葡聚糖的小试管中，每支各200μ1，并置旋涡混合器中振动混勻；
(4)加温将步骤3小试管置37°C恒温水浴20 60分钟；
(5)终止反应恒温水浴后移至冰水浴中，每支小试管中加入重氮化试剂，分别按 顺序加入配制好的亚硝酸钠溶液200 μ 1，氨基磺酸铵溶液200 μ 1，萘基盐酸二氨基乙烯溶 液200 μ 1，并在漩涡混合器上混合；
(6)测定吸光值加入重氮化试剂反应后，在545nm处测定吸光度，以水作为空白 对照；
(7)计算作出标准曲线，计算样品中的(1 一 3) — β 一 D—葡聚糖含量。根据(1 一 3) — β — D —葡聚糖的量来确诊病人是否为真菌感染。(1 一 3) — β -D 一葡聚糖临床参考值为健康人群小于20pg/ml ；临床观察期20-60pg/ml ；真菌感染 大于 60pg/mlo本发明的显著优点
本发明能快速、准确地(只需1小时就可出结果)定量人体血液及体液标本中的微量 (1-3)- β -D 一葡聚糖，临床医生可根据结果有针对性使用抗真菌类药物。
图1为(1 一 3) — β — D —葡聚糖的标准曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施例子，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1 1、试剂配制
1)0. 05mol/L 缓冲液(Tris-HCl/pH 8. 0):称取 Tris 碱 6. 057g，先加入 500ml
无菌无热原水溶解，接着加入37%浓盐酸60ml调节PH在8. 0左右，再定容至IOOOml。2)洗涤液2mol/L NaCl/0. lmol/L Tris-HCl/pH8. 0，称取干热灭菌后的 氯化钠 117g，接着用 0. lmol/L Tris_HCl/pH8. 0 定容到 1000ml。3)崩解液0. lmol/L NaCl/0. lmol/L Tris_HCl/pH8. 0，配制称取干热 灭菌后的氯化钠5. 85g，接着用0. lmol/L Tris_HCl/Ph8. 0定容到1000ml ；
4)洗脱液
① 0. 03mol/L NaCl/0. 015mol/L Tris-HCl/pH8. 0
称取干热灭菌后的氯化钠1. 755g,接着用0. 015mol/L Tris-HCl/pH8. 0定容到 1000ml。②0. 2mol/L NaCl/0. 015mol/L Tris_HCl/pH7. 4 8. 2
称取干热灭菌后的氯化钠11. 7g，接着用0. 015mol/L Tris_HCl/pH8. 0定容到1000ml。③0. 45mol/L NaClO. 015mol/L Tris_HCl/pH8. 0
称取干热灭菌后的氯化钠26. 325g，接着用0. 015mol/L Tris_HCl/pH8. 0定容到1000ml。④1. 9mol/L NaCl/0. 015mol/L Tris_HCl/pH8. 0
称取干热灭菌后的氯化钠111. 15g,接着用0. 015mol/L Tris-HCl/pH8. 0定容到 1000ml。5)重氮化试剂
① 0. 05%亚硝酸钠
称取亚硝酸钠0. 05g，用0. 35mol/L盐酸溶液定容至IOOml ；所述0. 35mol/L盐酸溶液 配制为
量取37%浓盐酸3. 5ml，再用无菌无热原水定容至100ml。②0. 3%氨基磺酸
称取氨基磺酸0. 3g，用无菌无热原水定容至100ml。③0. 1%萘基盐酸二氨基乙烯
称取萘基盐酸二氨基乙烯0. lg，用无菌无热原水定容至100ml。6)发色物质0· 65mg/ml Boc-LGR-pNA
称取发色物质(Boc-LGR-pNA) 65mg，用无菌无热原水溶解并定容到100ml。7)血液处理液0. 6mol/L KC1、0. 125mol/L Κ0Η，分别配制如下
①称取KCl44. 7g，在250°C干热灭菌150min后，加入无菌无热原水定容至IOOOml ；
②称取KOH7g，用无菌无热原水定容至IOOOml ；
将①和②按体积比1 :1混合，即取IOOOml①与IOOOml的②进行混合均勻为血液处理液。2、G试剂的制备如下
(1)活鲎加抗凝剂采血后，于IOOOrpm离心，弃上清液，收集细胞；再加入3倍体积的洗 涤液洗涤，弃去上清液；
(2)收集的细胞按6倍体积加入崩解液进行细胞崩解；之后进行离心，收集上清液；
(3)收集的上清液进亲和层析柱，所述亲和层析柱的固定相为DextranSulfate Sepharose C1-6B，用洗脱液洗柱，收集不同盐浓度洗脱液；
(4)对洗脱液用标准蛋白(所述标准蛋白包含牛血清白蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核 糖核酸酶、细胞色素C、伴刀豆球蛋白Con. A)做参照进行电泳鉴别后，将相同分子量的成分 的洗脱液进行合并，用冷冻干燥机进行低温浓缩；
(5)浓缩液用无菌无热原水重新复溶，用Si^phadexG-50柱进行脱盐，并收集不含盐的 洗脱液；
(6)再进行低温浓缩。
(7)将浓缩液加入发色物质使其浓度达到0.65mg/ml，混合均勻后，进行分装、冻干，即 得到G试剂。
3、直接真菌检测鲎试剂盒的使用方法 所述使用方法依次包括以下步骤
1)将(1 一 3)— β — D —葡聚糖稀释成系列浓度为10pg/ml、20pg/ml、40pg/
ml、80pg/ml、160pg/ml，分装入小试管中，每管200 μ 1 ；患者和正常人的血液各取100 μ 1分 装入小试管中，各加入血液处理液100μ 1，37°C水浴IOmin备用；2)配制G试剂溶液取0. 5ml G试剂用缓冲液0. 5ml溶解，用灭菌锡箔纸盖上， 并用手轻轻摇动溶解后放入冰水浴中冷却；由于G试剂灵敏度高，尽可能一次性使用完；
3)分装G试剂溶液将G试剂溶液分装于步骤1所述装有样品与(1 一 3) — β -D 一葡聚糖的小试管中，每支各200 μ 1，并置旋涡混合器中振动混勻；
4)加温将步骤3小试管置恒温水浴37°C 30分钟。5)终止反应恒温水浴后移至冰水浴中，每支小试管中加入重氮化试剂(分 别按顺序加入配制好的亚硝酸钠溶液200μ 1，氨基磺酸铵溶液200 μ 1，萘基盐酸二氨基乙 烯溶液200 μ 1)，并在漩涡混合器上混合。
6)加入重氮化试剂反应后，在545nm处测定吸光度，以水作为空白对照，具体的 检测数据见表1和表2 ；
7)作出标准曲线，如图1所示，计算样品中的(1 一 3) — β 一 D—葡聚糖含量。 样品中(1 一 3) — β — D—葡聚糖含量计算结果结表2。表1 (1 一 3) — β — D —葡聚糖标准曲线
注Δ指样品的吸光度与空白的差值。
如表2的检测结果所示，健康人的血液中(1 一 3)— β — D —葡聚糖含量均低于 20pg/ml;而患者血液中(1 一 3) — β 一 D—葡聚糖含量均比较高，结合临床症状分析，其 中患者1还处在临床观察阶段，取其血液进行真菌培养后显示呈阳性，说明有真菌感染，而 患者2和患者3结合真菌培养法也都检测出真菌，说明均有真菌感染。这些结果均与(1 -3) — β — D—葡聚糖临床参考值相吻合，即健康人群的参考值小于20pg/ml;临床观察期 参考值20-60pg/ml ；真菌感染参考值大于60pg/ml。
实施例2 直接真菌检测鲎试剂盒(G试剂)的临床评价
按照实施例1所述方法对123例标本进行检测，与传统真菌培养法进行比较。结
果见表3。表3真菌检测方法结果比较
注X2=400，P<0. 05，差异有显著性
如表3所示，血浆葡聚糖检测法阳性例数是81例，这81例同样用传统真菌培养法检测 则阳性例数为73例，另有8例是阴性；血浆葡聚糖检测法阴性数是42例，这些同样用传统 真菌培养法检测结果显示有1例是阳性，另外41例是阴性。由表3可见在123例标本中，用传统方法培养真菌阳性74例，阳性率为60. 2% ； 用血浆葡聚糖检测法测定真菌的阳性为81例，阳性率为65. 9%。采用两种方法对临床123 例标本的检测结果发现两种方法同时阳性的有73例，传统真菌培养法检测是阴性而用血 浆葡聚糖检测法测定是阳性的8例，经跟踪，多次采集标本进行培养，这8例患者均有不同 程度的真菌感染。按照实施例1所述方法对68例标本进行检测，与传统真菌培养法、直接涂片法进 行比较，结果见表4。表4三种试验方法对诊断真菌感染的比较
注P<0. 05，差异有显著性
如表4所示，在68例标本中，用血浆葡聚糖检测法实验敏感度为88. 8%，实验特异性达 到96. 1% ；用传统真菌培养方法实验敏感度相对比较低才60. 9%，实验特异性也相对低一些 为86. 5% ；而直接涂片方法不管是实验敏感度还是实验特异性在三种方法中均是最低的， 敏感度才达到50%，实验特异性也才达到80. 7%。 从上述实验结果说明血浆(1 一 3) — β — D —葡聚糖的含量检测用于临床诊断 真菌感染，具有敏感性高、特异性强、快速准确等特点。
权利要求
一种直接真菌检测鲎试剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括(1)G试剂为鲎血球细胞溶解物与发色物质的混合物；(2)缓冲液0.02~0.1mol/L Tris-HCl； (3)标准品(1－3)－β－D－葡聚糖；(4)重氮化试剂；(5)血液处理液。
2.根据权利要求1所述的直接真菌检测鲎试剂盒，其特征在于试剂盒中的试剂配制 如下(1)所述发色物质为0.25 0. 8mg/ml Boc-LGR-pNA,配制为称取发色物质 Boc-LGR-pNA 25 80mg，用无菌无热原水溶解并定容至IOOml ；(2)所述缓冲液为0.02 0.lmol/L Tris-HCl, pH 7. 6 8. 2，配制为称取Tris碱 2. 42^12. llg，先加入500ml无菌无热原水溶解，接着加入37%浓盐酸调节pH 7. 6^8. 2，再定 容至 IOOOml ；(3)所述洗脱液为四种不同盐浓度的洗脱液①0. 01 0. 07mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2称取干热灭菌后的氯化钠0. 585 4. 095g,接着用0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/ Ph7. 4 8· 2 定容到 1000ml ；②0. 2 0. 28mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2称取干热灭菌后的氯化钠11. 7 16. 38g，接着用0.005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；③0. 45 0. 6mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2称取干热灭菌后的氯化钠26. 325 35. Ig,接着用0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；④1. 8 2. lmol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8. 2称取干热灭菌后的氯化钠105. 3 122. 85g，接着用0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 定容到 1000ml ；(4)所述重氮化试剂为0.01 0. 07%(重量比，下同)亚硝酸钠、0. 1 0. 45%氨基磺 酸铵以及0. 02 0. 2%萘基盐酸二氨基乙烯；分别配制如下①0. 01 0. 07%亚硝酸钠称取亚硝酸钠0. 0Γ0. 07g，用0. 35mol/L盐酸溶液定容至IOOrnl ；所述0. 35mol/L盐 酸溶液配制为量取37%浓盐酸3. 5ml，再用无菌无热原水定容至100ml ；②0.1 0. 45%氨基磺酸称取氨基磺酸0. Γ0. 45g，用无菌无热原水定容至100ml ；③0.02 0. 2%萘基盐酸二氨基乙烯称取萘基盐酸二氨基乙烯0. 02、. 2g，用无菌无热原水定容至100ml ；(5)所述血液处理液为体积比1:1的0.4 0. 8mol/L KCl和0. 08、. 15mol/L Κ0Η，分别 配制如下①称取KCl 29.8 59.68，在2501干热灭菌150min后，加入无菌无热原水定容至 1000ml ；②称取KOH 4. 48 8. 4g，用无菌无热原水定容至1000ml。
3.根据权利要求1所述的直接真菌检测鲎试剂盒，其特征在于所述G试剂的制备如下(1)活鲎加抗凝剂采血后，于IOOOrpm离心，弃上清液，收集细胞；再加入3倍体积的 洗涤液洗涤，弃去上清液；所述洗涤液为0. 5 3. 5mol/L NaCl/0. θΓθ. 2mol/L Tris-HCl/ ρΗ7· 4 8· 2 ；(2)收集的细胞按6倍体积加入崩解液进行细胞崩解；之后进行离心，收集上清液；所 述崩解液为 0. 01 0. 25mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/pH7. 4 8· 2 ；(3)收集的上清液进亲和层析柱，所述亲和层析柱的固定相为DextranSulfate Sepharose C1-6B，用洗脱液洗柱，收集不同盐浓度洗脱液；(4)对洗脱液用标准蛋白做参照进行电泳鉴别后，将相同分子量的成分的洗脱液进行 合并，用冷冻干燥机进行低温浓缩；所述的标准蛋白包含牛血清白蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白 酶、核糖核酸酶、细胞色素C和伴刀豆球蛋白Con. A ；(5)浓缩液用无菌无热原水重新复溶，用Si^phadexG-50柱进行脱盐，并收集不含盐的 洗脱液；(6)再进行低温浓缩；(7)将浓缩液加入发色物质使其浓度达到0.65mg/ml，混合均勻后，进行分装、冻干，即 得到G试剂。
4.根据权利要求3所述的直接真菌检测鲎试剂盒，其特征在于步骤(4)所述的标准蛋 白包含牛血清白蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶、细胞色素C和伴刀豆球蛋白Con. A0
5.根据权利要求3所述的直接真菌检测鲎试剂盒，其特征在于所述洗涤液为 0. 5 3. 5mol/L NaCl/0. θΓθ. 2mol/L Tris_HCl/pH7. 4 8. 2，配制为称取干热灭菌后的 氯化钠117g，接着用0. lmol/L Tris_HCl/pH8. 0定容到1000ml ；所述崩解液为0.01 0. 25mol/L NaCl/0. 005 0. 035mol/L Tris_HCl/pH7. 4 8. 2，配制为称取干热灭菌后的氯 化钠 0. 585 14. 625g，接着用 0. 005 0. 035mol/L Tris-HCl/Ph7. 4 8. 2 定容到 1000ml。
6.一种如权利要求1、2、3、4或5所述的直接真菌检测鲎试剂盒的使用方法，其特征在 于依次包括以下步骤(1)样品、标准品处理样品各取100μ 1分装入小试管中，各加入血液处理液 ΙΟΟμ 1，37°C水浴IOmin备用；将(1 一 3) — β -D 一葡聚糖稀释成系列浓度，分装入小试 管中，每管200μ 1 ；(2)配制G试剂溶液0. 5ml 1. 5ml G试剂用0. 5ml 1. 5ml缓冲液溶解，用灭 菌锡箔纸盖上，并用手轻轻摇动溶解后放入冰水浴中冷却；由于G试剂灵敏度高，尽可能一 次性使用完；(3)分装G试剂溶液将G试剂溶液分装于步骤1所述装有样品与(1 一 3) — β -D 一葡聚糖的小试管中，每支各200 μ 1，并置旋涡混合器中振动混勻；(4 ) 加温将步骤(3 )小试管置37 °C恒温水浴20 60分钟；(5) 终止反应恒温水浴后移至冰水浴中，每支小试管中加入重氮化试剂，分别按 顺序加入配制好的亚硝酸钠溶液200 μ 1，氨基磺酸铵溶液200 μ 1，萘基盐酸二氨基乙烯溶液200 μ 1，并在漩涡混合器上混合；(6)测定吸光值加入重氮化试剂反应后，在545nm处测定吸光度，以水作为空白 对照；(7)计算作出标准曲线，计算样品中的(1 一 3) — β 一 D—葡聚糖含量。
7.根据权利要求6所述的直接真菌检测鲎试剂盒的使用方法，其特征在于·.所述样品 为人的血清。
全文摘要
本发明提供了一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法，所述试剂盒组成包括(1)G试剂为鲎血球细胞溶解物与发色物质的混合物；(2)缓冲液0.02~0.1mol/LTris-HCl；(3)标准品(1－3)－β－D－葡聚糖；(4)重氮化试剂；(5)血液处理液。通过对样品、标准品进行处理，配制G试剂溶液，分装、加温、终止，然后测定吸光值，作出标准曲线，计算样品中的(1－3)－β－D－葡聚糖含量。该试剂盒能快速、准确地定量人体血液及体液标本中的微量(1－3)－β－D－葡聚糖。
文档编号C12Q1/04GK101880706SQ20101022140
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者丁友玲, 廖招连 申请人:丁友玲