一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD的制作方法

专利名称：一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可溶性融合蛋白，尤其是人Notch配体Delta-likel(hDlll)的截 短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序R⑶和氨基末端融合的TrxHis表达标签的一种血管靶 向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，属于医药技术领域。
背景技术：
Notch信号途径广泛存在于多种生物体内，且进化上高度保守，在胚胎发育、血细 胞发育及肿瘤形成等多种病理生理过程中发挥重要作用。现已在哺乳动物中发现了四种Notch同源分子，即Notch 1-4，并发现了五种 Notch配体，分别是Jaggedl、2和Delta-likel、3、4。这些配体都是I型跨膜蛋白，N端有一 个结合Notch受体必需的DSL结构域，由含6个半胱氨酸、3个甘氨酸的45个氨基酸组成； 配体胞外区还含有数量不等的EGF样重复区；胞浆区很短，只有70-215个氨基酸残基，保守 性差。其中，hDlll属于果蝇Delta配体在人的同源物，由723个氨基酸组成，其胞外段中 有 1 个 DSL 结构域和 8 个 EGF 样重复区(Radtke F 等，EMB0 reports, 2005,6 1120-1125 ； PfisterS 等，J. Mol. Biol.，2003，333 :229_35 ；Ascano JM 等，J. Biol. Chem.，2003，278 8771-8779)。Notch受体和配体都属于EGF样超家族分子。其细胞外区包含的多个EGF样重 复序列可以参与邻近细胞表面的Notch配体和Notch受体之间相互作用。如Notchl的第 11-12个EGF样重复序列可以与配体DSL结构域相互作用，从而激活Notch信号途径(Rebay I等，Cell, 1991，67 :687_699)。Notch信号的激活对细胞具有广泛而复杂的作用。在干细 胞系统，Notch信号激活的主要作用是通过促进干细胞的增殖和存活、抑制干细胞的分化促 使干细胞维持在低分化状态；在细胞的分化过程中，Notch信号途径的作用主要是辅助细 胞在双向分化时选择其中的一个分化方向而抑制向另一个方向的分化，或者在细胞成熟过 程中抑制细胞的成熟；在分化的细胞，Notch信号的激活可以影响细胞的功能状态。此外， Notch信号还参与多种复杂的病理过程，如肿瘤。研究发现，随着细胞所处状态不一，Notch 信号激活可以抑制肿瘤或者促进肿瘤；Notch信号还是维持肿瘤干细胞的重要因素；此外， Notch信号途径对肿瘤微环境的形成和维持具有关键作用Notch信号阻断可以破坏肿瘤 新生血管的完整性，从而引起肿瘤组织缺氧而抑制肿瘤生长，Notch信号的激活还是巨噬细 胞和树突状细胞发挥其抗肿瘤活性的关键因素。综上所述，建立激活或者阻断Notch信号 途径的人工手段，具有重要的应用价值。研究发现，Notch配体从N末端到DSL结构域的片段足以激活Notch信号途径 (FitzgeraldK 等，Development，1995，121 4275 ；Henderson ST 等，Mol. Biol. Cell.，1997， 8 1751 ；ParksAL等，Genetics，2006，174 1947-1961)。这些结果提示，如果能够在大肠杆 菌中表达生产Notch配体的DSL结构域片段，有可能提供一种人工的刺激Notch信号途径 的手段，用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血 管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。因此，近年来有多个研究组先后利用真核表达系统和原核表达系统，表达了不同的Notch配体的DSL结构域片段。但是活性分 析的结果却不一致有些表达产物可以激活Notch信号，有些则没有激活活性，有些甚至有 抑制Notch信号激活的活性。总体来说，激活活性不佳，无法在实验研究中获得稳定结果， 不能应用于体内。可溶性Notch配体对Notch信号的激活活性不佳的主要原因是在Notch受体的激 活过程中，在Notch受体的跨膜区附近要发生多个步骤的蛋白酶裂解反应。当Notch配体 和Notch受体结合后，Notch跨膜区的S2位点暴露，并收到ADAM金属蛋白酶家族的TACE 或Kuz的酶切。这时，切割产生的游离的胞外区必需在锚定于细胞表面的Notch配体的作 用下，被表达Notch配体的细胞内吞(Endocytosis)。然后，在、分泌酶的作用下，残存在 细胞膜上Notch受体片段在跨膜区内发生裂解，向细胞内释放出Notch受体胞内段，引起 Notch信号途径的激活。由这一过程可以看出，必需将Notch配体固定于固体(如细胞、塑 料培养皿等)表面，才能有效地激活Notch受体。血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)_门冬氨酸(D)为 核心的多肽，可以特异识别血管内皮细胞表面的整合素分子，从而将与之融合的其他蛋白 分子锚定于血管内皮细胞表面。

发明内容
本发明的目的是提供一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，该蛋白可 以结合于血管内皮细胞表面，有效地刺激细胞的Notch受体的激活。本发明的技术方案是一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是它是由人Delta-likel即hDlll蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序R⑶和融合 的TrxHis表达标签组成；其中hDlll蛋白截短体是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部 分上游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列编码Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccct&ctgc&c&g&gccg&tctgccg&gg&g&ttgcgg&gttcg&t&t0所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列编码No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi ；
No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
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accgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列编码No5 :RGD基序的氨基酸序列crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat。 所述氨基末端融合的TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸 序列编码
7
N。7TrXHi S的氨基酸序列
msclkiihltddSfdtdVlkadgailVdfWaeWCgpCkmiapildeiadeyqgkltVaklnidqnpgtapkygirg
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N。8TrXHiS的核酸序列
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所述血管靶向可溶性融合蛋白TrXHiS—hDll卜RGD是在大肠杆菌BL2l中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对HiS标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrXHiS—hDlll—RGD蛋白。
本发明的特点是TrXHiS—hDll卜RGD在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他细胞提供针对N。tCh受体的激活型刺激，可应用于在体外和体内研究N。tCh信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。


图l、融合蛋白的结构、构建和作用模式 图2、目的基因(hDll卜RGD)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
图3、表达载体pET32a—hDll卜RGD的结构示意 图4、表达载体pET32a—hDll卜RGD的酶切鉴定 图5、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白表达的蛋白电泳 图6、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白的纯化的电泳图及免疫印迹检测；
图7、TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白与血管内皮细胞系的结合；
图8、游离的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白对Raji细胞N。tCh信号的激活作用；
图9、游离的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白对Raji细胞N。tCh信号的激活作用；
图lo、与血管内皮细胞系结合的TrXHiS—hDll卜RGD融合蛋白对Raji细胞N。tCh信号的激活作用；图11、与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch 信号的激活作用。
具体实施例方式以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。1、构建表达载体。图1是融合蛋白的结构、构建和作用模式图。根据hDlll的序 列、RGD九肽的序列(CRGDCGVRY)和其对照DGR九肽的序列(CDGRCGVRY)设计引物，P1 :5’ -CGGGATCCCTCCACACAGATTCTCCTG-3‘ ；P2 5-CGGAATTCATATCGAACTCCGCAATCTCCTCGGCAGATCG GCTCTGTGCAGTAG-3’ ；P3 :5’ -CGGAATTCATATCGAACTCCGCATCGTCCATCGCAGATCGGCTCTGTGCAGTA G-3，。以pET32a-hDlll(127-225)(Shi ZX等，Protein Expr Purif. ，2008，59 242~248)为 模板，聚合酶链反应扩增编码hDlll-RGD和对照hDlll-DGR氨基酸的多核苷酸序列(其中 hDlll为其氨基酸的127-225位)(图2)，琼脂糖电泳回收后与pMD18_T载体16°C连接 2小时，热休克转化大肠杆菌XL10，扩增后将目的片段亚克隆至表达载体pET32a (+)，构建 pET32a-hDlll-RGD(图 3)和 pET32a-hDlll_DGR，限制性酶切(图 4)、测序鉴定。图1、融合蛋白的结构、构建和作用模式图。图2为目的基因(hDlll-RGD)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，1道(M)是分子 量标志(DL2000)，2和3道(PCR)分别是扩增hDlll的127-225位氨基酸片段融合DGR基 序(hDlll-DGR)和hDlll的127-225位氨基酸片段融合R⑶基序(hDlll-RGD)，箭头所指为 扩增片段。图3、表达载体pET32a-hDlll_RGD的结构示意图。图4为表达载体pET32a-hDlll_RGD的酶切鉴定图；(质粒分别用限制性内切酶 EcoRI+NotI和EcoRI+BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。M道是marker DL2000,1-5 道分别是不同克隆的酶切结果)2、诱导表达融合蛋白。将表达载体 pET32a(+)、pET32a_hDlll、pET32a-hDlll_DGR 和pET32a-hDlll-RGD分别以热休克法转化大肠杆菌BL21，涂布含100 y g/ml氨苄青霉素 LB平板，37°C培养12小时后挑取单克隆接种到含100 u g/ml氨苄青霉素LB液体培养基， 200rpm，37°C培养12h，以转接到新鲜LB(+)培养基中，200rpm，37°C培养3h后，加入终 浓度 1. OmM 的 IPTG，200rpm, 28_30°C培养 24h。3、获得TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis_hDlll_DGR的包涵体蛋白。离心收集细菌， 200 u 1/ml培养基PBS重悬细菌，超声裂菌，加入1 % Triton-X100,混勻，4°C静置30分钟， 4°C离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测发现，TrxHis-hDlll能以可溶形式存在于裂解上 清中，而TrxHis-hDlll-RGD和TrxHis-hDlll-DGR蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中 (图 5)。图5为TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白表达的蛋白电泳图。将质粒pET32a(+)、 pET32a-hDl 11、pET32a_hDl 11-DGR 和 pET32a_hDl 11-RGD 分别转化大肠杆菌 BL21，小体积培 养后IPTG诱导融合蛋白的表达，然后取全细菌裂解物、裂解上清(可溶性组分)和裂解沉 淀(即包涵体)分别进行SDS-PAGE分析。M是分子量标志(由上到下分别是250KD，150KD, 100KD,75KD,50KD,37KD,25KD,20KD)
4、纯化包涵体蛋白。pET32a(+)空载体蛋白TrxHis从细菌裂解上清中纯化， TrxHis-hDlll-DGR和 TrxHis-hDlll-RGD 以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)纯化包 涵体蛋白，为了减小误差，将TrxHis-hDlll也从包涵体中纯化，所有纯化步骤以ProBondTM 纯化手册操作。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，然后用抗His标签抗体进行免疫印迹实验 (Immuno-blot)，见在 TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR、TrxHis-hDlll-RGD 都可检测到大 小正确的蛋白条带(图6)。图6为TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白的纯化及免疫印迹检测。从转化有质粒 pET32a-hDlll、pET32a-hDlll-DGR 和 pET32a_hDlll_RGD 的转化大肠杆菌 BL21 的裂解上清 或过复性上清用镍金属螯合柱纯化含有His标签的蛋白，进行SDS-PAGE分析。M道是蛋白 分子量标志。下图是融合蛋白免疫印迹检测结果，一抗是抗His标签抗体。5、蛋白活性测定。A.ECV304细胞爬片的免疫荧光染色。24孔板底部铺一片圆形盖玻片，然后 接种1 X 105ECV304,分别在各孔加入5 ii g/ml表达的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll、 TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD, 48h 后弃去培养基，4% 多聚甲醛固定，抗 His 的单抗染色过夜，第二天用PBS洗涤后，抗小鼠IgG-FITC染色两小时，之后PBS洗涤， Hoechst染色10min，PBS洗涤，50%甘油封片，荧光显微镜下观察并采集图像。见只有加入 TrxHis-hDlll-RGD的细胞呈现绿色荧光信号，且定位于细胞表面(图7)。图7为TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白与血管内皮细胞系的结合。体外培养 内皮细胞系 ECV304，加入纯化的蛋白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis-hDlll-RGD，48h后用抗His抗体进行免疫荧光染色，Hoechst染色细胞核，荧光 显微镜观察。B.实时定量检测重组蛋白TrxHis-hDll 1-RGD激活Notch下游基因Hes 的表达。六孔板接种lX106Raji细胞，分别在各孔加入5iig表达的蛋白TrxHis和 TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反转录成cDNA后，实时定量PCR检测Notch下 游基因Hesl和Hes5的表达变化。结果显示TrxHis-hDlll-RGD可以有效地刺激Hotch信 号下游基因Hesl和Hes5的表达(图8，图9)，提示具有激活Notch信号的活性。图8为游离的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。 培养Raji细胞，向培养基中加入纯化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收获细 胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hesl的表达水平P < 0. 05)。图9为游离的TrxHis-hDlll-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。 培养Raji细胞，向培养基中加入纯化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDlll-RGD，12h后收获细 胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hes5的表达水平P < 0. 05)。为了更进一步确定表达的TrxHis-hDlll-R⑶事结合于整合素分子，并且能更 好的激活Notch信号，将培养皿接2X105ECV304细胞，48h后加入终浓度为10 y g/ml的 丝裂霉素作用2. 5h后弃去培养液，PBS洗一遍后，换新的培养液，接种1X106ECV304细 胞，分别在各孔加入 5 ii g/ml 表达的蛋白TrxHis、TrxHis-hDlll, TrxHis-hDlll-DGR ^P TrxHis-hDlll-RGD, 12h后TRzol法提取RNA，反转录成cDNA后，实时定量PCR检测Notch 下游基因Hesl和Hes5的表达变化。结果显示与非细胞表面锚定的TrxHis-hDlll相比， TrxHis-hDlll-RGD可以更有效地有效地刺激Notch信号下游基因Hesl和Hes5的表达(图 10，图11)，提示具有激活Notch信号的活性。
图10为与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白对Raji细胞Notch 信号的激活作用。培养ECV304细胞，用丝裂霉素C抑制细胞增殖，向培养液加入纯化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后换液，在加入 Raji细胞，培养12h后收获Raji细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基 因Hesl的表达水平(* P < 0. 05)。图11为与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDlll-R⑶融合蛋白对Raji细胞Notch 信号的激活作用。培养ECV304细胞，用丝裂霉素C抑制细胞增殖，向培养液加入纯化的蛋 白 TrxHis、TrxHis-hDlll、TrxHis-hDlll-DGR 和 TrxHis_hDlll_RGD，2. 5h 后换液，再加入 Raji细胞，培养12h后收获Raji细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基 因Hes5的表达水平< 0. 01)。由以上可制得本发明这种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，它是由人 Delta-likel即hDlll蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和融合的TrxHis表 达标签组成；其中hDlll蛋白截短体是hDlll第127-225位氨基酸。所述的hDlll第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部 分上游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端； 所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol， 并由No2的核酸序列编码Nol TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ；No2 TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacg acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa agggccctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No3的氨基酸序列，并由 No4的核酸序列编码No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr ddafghftc
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No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
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tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg gccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-R⑶具有No5的氨基酸序列，并由 No6的核酸序列编码
列编码

kygirg rqhmdsp
No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；
No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序 No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakdwfe
dlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg
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12
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc0所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大肠杆菌BL21中用低温 诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。本发明的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD在体外可以通过基因 工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他 细胞提供针对Notch受体的激活型剌激，还可应用于在体外和体内研究Notch信号对细胞 增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。序列表序列号Nol :TrxHis-hDlll-RGD的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap kygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq hmdspdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvc dehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry序列号No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggt atcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaa gagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccag aaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagc ggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttt tctgccgtcc agggcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaa
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat 序列号No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrpr
ddafghftc
cagaggc accgct
gergekvcnpgwkgpyctepi
序列号No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacc acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcg
gccacttca

kygirg hmdsp
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc
序列号No5 :RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry
序列号No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat 序列号No7 :TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtap iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferq
dlgtddddkamadigs 序列号No8 :TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcg atcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaa tatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttga aagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtg ccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgac gacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc
权利要求
一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis hDll1 RGD，其特征是它是由人Delta like1即hDll1蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和融合的TrxHis表达标签组成；其中hDll1蛋白截短体是hDll1第127 225位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的hDlll第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部分上 游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述 的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由 No2的核酸序列编码Nol :TrxHis-hDlll-RGD 的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry ； No2 :TrxHis-hDlll-RGD 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctg ccgtccccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
3.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码No3 :hDlll的DSL和上游片段的氨基酸序列lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddaf ghftcgergekvcnpgwkgpyctepi ；No4 :hDlll的DSL和上游片段的核酸序列ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggcca cttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatco
4.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6 的核酸序列编码No5 :RGD基序的氨基酸序列 crgdcgvry ；No6 :RGD基序的核酸序列 tgccgaggagattgcggagttcgatat0
5.根据权利要求2所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特征 是所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列编 码No7 :TrxHis的氨基酸序列msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsPdlgtddddkamadigs ； No8 :TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcc tcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatc agggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcc cgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccac3gcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatcc。
6.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD，其特 征是所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDlll-RGD是在大肠杆菌BL21中用低温诱 导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的 TrxHis-hDlll-RGD 蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，它由人Delta-like1蛋白截短体即hDll1第127-225位氨基酸、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和TrxHis表达标签组成；表达载体是pET32a/hDll1-RGD。转化大肠杆菌BL21后采取28-30℃低温诱导24h实现与TrxHis可溶性融合表达，用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。TrxHis-hDll1-RGD在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，还可应用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。
文档编号C12N15/62GK101891824SQ20101022147
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者何飞, 赵星成, 韩骅 申请人:中国人民解放军第四军医大学