专利名称：一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及建立一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法，同时还公开了该方法 涉及的转基因供体质粒和转座酶mRNA体外转录辅助质粒的构建方法，及其在斑马鱼和养 殖鱼类中的应用。本发明属于鱼类基因工程领域。
背景技术：
我国是水产养殖大国，长期以来，我国养殖产量占世界总产量的三分之二，目前我 国正在朝水产养殖强国快速迈进。我国水产养殖种类繁多，包括鱼、虾、贝、藻在内的养殖种 类多达200多种，目前，我国的水产业良种开发主要以选育、杂交、染色体工程等传统育种 技术为主，新品种开发速度缓慢，目前我国水产良种覆盖率仅为20%左右。以鱼类为主的水 产种类繁殖力强和体外受精、体外孵化等生理特点都十分有利于转基因操作，使鱼类成为 非常合适的转基因动物实验材料和遗传改良对象，转基因技术为我国众多水产对象的快速 育种带来机遇，是提高我国水产良种覆盖率的重要出路。我国上世纪八十年代即开发出快 速生长的转基因鲤和转基因大马哈鱼，转基因鱼研制的理论方法和取得的成果均具有世界 领先水平。转基因是将携带基因的DNA片段导入基因组中的方法。通过观察转基因生物体 目标性状的改变，发明人可以获得转基因突变体，以供新品种选育。在鱼类，最常用的转基 因方法是将线性化的携带外源基因的DNA通过脂质体、电穿孔或显微注射等手段导入细胞 中，使DNA通过至今仍未研究十分清楚的机制随机整合入基因组中。这种方法有很多缺点 1)整合效率低，难以有效在浮性卵、黏性卵鱼类、排卵量较少的鱼类和卵子较小的虾类中进 行转基因育种；2)畸形率高，该方法需要注射较大量的质粒，大量外源质粒拷贝的存在会 使得受精卵发育异常，导致大量畸形；3)多数情况下线性化的DNA会形成多拷贝的串联重 复，即多联体(concatamer)，其很难模拟内源基因的正常生理状况；4)多联体在传代时不 同转基因拷贝间易于发生重组而造成缺失(deletion)，或由于甲基化修饰影响转基因的稳 定表达；5)由于利用此方法很难确定转基因插入所在基因组中的位置，因此也无法对插入 位点附近的染色体环境作出评估。与单纯的线性化DNA相比，逆转录病毒载体能使转基因 更高效地整合入基因组，但其主要不足在于1)负载容量小，即所能携带外源DNA片段的长 度有限；2)宿主也会对病毒进行甲基化修饰，使转基因表达沉默；3)制备病毒操作繁琐；4) 虽然用于转基因的大多是复制缺陷型病毒，但安全性仍是一个需要警惕的问题。因此，在鱼 类中需要开发新的整合效率高、负载容量大和使用安全方便的转基因新方法。转座子是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位 置的过程被称为转座。根据转座方式的不同，转座子可分为DNA转座子和逆转录转座子两 大类。DNA转座子的转座遵循“切离_粘贴”机制，即在转座酶的催化下，DNA转座子从原始 位置切离并插入到新的基因组位置。转座子不仅能作为转基因工具，将外源基因导入受体 基因组，同时，其又因为能通过随机的插入诱变使内源基因失活而成为正向遗传学研究中的“宠儿”。DNA转座子的基因转移系统是新一代转基因技术，但有自主转座活性的DNA转座 子在脊椎动物中很少见。1996年，日本学者首次在白化青鏘(Oryziaslatipes)中发现具有 天然活性的脊椎动物hAT家族转座子，即青鏘Tol2转座子，该转座子已在模式生物斑马鱼 转基因、基因和启动子捕获方面进行了广泛应用。2008年，发明人发现一个新的具有天然 活性的Tgf2转座子在我国一些金鱼品种中广泛存在，金鱼Tgf2转座子是迄今发现的第二 例脊椎动物转座子。与青鏘Tol2转座子元件相同，金鱼Tgf2转座子含有末段倒位重复、亚 末端重复、中间倒位重复和活性转座酶基因，金鱼Tgf2与青鏘Tol2转座子在末段倒位重复 和转座酶基因编码上存在一定差异。本发明所涉及的鱼类高效转基因方法就是建立在金鱼 Tgf2转座子基础上。
发明内容
本发明就是为了解决上述问题，克服最常用的转基因方法是将线性化的携带外源 基因的DNA通过脂质体、电穿孔或显微注射等手段导入细胞中，整合效率低，难以有效在浮 性卵、黏性卵鱼类、排卵量较少的鱼类和卵子较小的虾类中进行转基因育种，畸形率高，多 数情况下线性化的DNA会形成多拷贝的串联重复，多联体在基因的表达的不稳定，难确定 转基因插入所在基因组中的位置。以及逆转录病毒载体负载容量小，宿主也会对病毒进行 甲基化修饰，使转基因表达沉默，制备病毒操作繁琐，安全性隐患的问题。因此，本发明旨在 构建一种基于转座子的鱼类高效转基因新方法。以来源于金鱼Tgf2转座子左右臂的转基 因供体质粒，并辅以Tgf2转座酶mRNA，共同注射入鱼类1-2细胞期受精卵，即可实现高效转 基因。在鱼类中需要开发新的整合效率高、负载容量大和使用安全方便的转基因新方法。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现。作为本发明的第一方面，一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法，其特征在于， 是通过载体将目的基因注射入鱼类，所述载体包括转基因供体质粒和鱼类Tgf2转座酶5’ 加帽mRNA，将转基因供体质粒，辅以鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA共同注射入鱼类1_2细 胞期受精卵，即实现高效转基因。作为本发明的第二方面，一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征 在于，所述载体包括转基因供体质粒和鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA ；所述转基因供体质粒包括鱼类Tgf2转座子左右臂、鱼类启动子DNA序列和目的 基因；进一步，所述鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA是Tgf2转座酶mRNA体外转录辅助质 粒，再由辅助质粒体外转录获得。进一步，所述鱼类Tgf2转座子左右臂来自金鱼Tgf2转座子。进一步，所述鱼类启动子DNA序列为斑马鱼β -actin启动子。进一步，所述目的基因为水母绿色荧光蛋白(eGFP)基因。进一步，所述体外转录辅助质粒的构建是将Tgf2转座酶mRNA读码框DNA序列与 SP6启动子连接，构建表达转座酶的辅助质粒。作为本发明的第三方面，一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体的制备方法，其特征在于，(1)转基因供体质粒的构建运用PCR技术分别克隆斑马鱼β-actin启动子序 列；构建水母绿色荧光蛋白(eGFP)的基因表达盒；通过基因克隆技术将所述目的基因表达 盒克隆入Tgf2转座子的左右臂序列之间，构建鱼类转基因供体质粒；(2) Tgf2转座酶5’加帽mRNA :Tgf2转座酶mRNA读码框DNA序列与Sp6启动子连 接，构建能表达转座酶的辅助质粒，再采用Sp6 mMessagemMachine kit (Ambion)试剂盒进 行Tgf2转座酶5’加帽mRNA的体外转录。为了实现将目的基因稳定整合到鱼类基因组中，本发明转基因供体质粒包含Tgf2 转座子的左右臂，包含反向重复序列和亚末端重复序列，可由转座酶识别，促进左右臂间 DNA片段的转座。本发明利用DNA重组技术，将目的基因表达盒克隆入Tgf2转座子的左右 臂序列之间，构建了鱼类转基因的供体质粒。转座子发生转座除需Tgf2转座子的左右臂序列之外，还需要Tgf2转座酶5’加帽 mRNA的参与。转座酶识别左右臂内的顺式元件，并实现左右臂序列及其内部的DNA片段发 生转座，为实现转座的基因稳定整合到鱼类基因组中，本发明将Tgf2转座酶基因克隆入另 一载体中，并在其上游加上SP6启动子，从而构建能进行Tgf2转座酶体外表达的辅助质粒， 再体外转录获得Tgf2转座酶5’加帽mRNA。这种基于Tgf2转座子，通过转基因供体质粒，辅以鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA， 共同注射入鱼类1-2细胞期受精卵，不但可以在鱼类中实现高效转基因，而且保证了转基 因整合的遗传稳定性。本发明的有益效果本发明由Tgf2转座子转基因供体质粒和Tgf2转座酶mRNA 二者共同构成的鱼类 高效转基因方法，确保外源目的基因在鱼类基因组中的高效整合。本发明与现有技术相比， 具有安全、高效和通用特点，其效率是传统质粒注射方法的近10倍，为鱼类基因功能研究 和转基因育种提供了新途径。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。图 1 是 pT2-EFla_eGFP 质粒图谱。图 2 是 pTgf2-EFla_eGFP 质粒图谱。图3是pTgf2_zf β -actin-eGFP转基因供体质粒图谱。图4是Tgf 2转座酶mRNA的体外转录辅助质粒pCS2_CMV-gfTP图谱。图5是注射pTgf2_zf β -actin-eGFP+Tgf2转座酶mRNA的斑马鱼胚胎受精36小 时的可见光透射照片。图6是注射pTgf2_zf β -actin_eGFP+Tgf2转座酶mRNA的斑马鱼胚胎受精36小 时的可见光透射照片。图7是注射pTgf2_zf β -actin-eGFP+Tgf2转座酶mRNA的银鲫胚胎受精后6天的 的可见光透射照片。图8是注射pTgf2_zf β -actin-eGFP+Tgf2转座酶mRNA的银鲫胚胎受精后6天的 可见光透射照片。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具 体图示，进一步阐述本发明。下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，未详细说明的技术为常规技术。实施例1、鱼类Tgf2转座子左右臂的克隆实验用琉金金鱼(Carassius auratus var.)品系取自上海南汇丰桥观赏鱼养殖 场。剪取0. Ig左右新鲜或95%酒精保存尾鳍，加入400 μ L STE缓冲液(30mM Tris-HCl, pH8. 0，200mM EDTA, 50mM NaCl)。混勻后加入终浓度分别为2%的SDS和400 μ g/ml的蛋白 酶K，置于恒温摇床55°C作用4h。加入400ul饱和NaCl并翻转混勻，再加入400ul氯仿充 分混勻，4°C、12，OOOrpm离心20min，吸取上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA，再用-20°C 预冷的70%的乙醇洗涤，室温干燥5min，琉金金鱼基因组DNA溶解于无菌双蒸水中备用。根据已获得的金鱼Tgf2转座子序列(GenBank登录号HM146132)，分别设计引物 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2、SEQ ID No :3 和 SEQ ID No :4。以琉金金鱼基因组 DNA 为模 板，利用SEQ ID No :1 (带SpeI内切酶位点)和SEQ ID No :2(带XhoI内切酶位点)引物 组合，进行Tgf2转座子左臂DNA序列的PCR扩增；利用SEQ ID No :3 (带BglII内切酶位 点)和SEQ ID No 4引物(带KpnI内切酶位点)组合，进行Tgf2转座子右臂DNA序列的 PCR 扩增。PCR 反应程序为94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C延长 5min。扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割 胶回收目的片段，将回收产物连接至PMD-19T载体(TaKaRa)中，并转入大肠杆菌DH5 α，挑 取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 μ g/ml的液体LB培养基中，37°C振荡过夜培养， 取200 μ 1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。序列结果显示，所 述Tgf2转座子左臂DNA序列，是由220个核苷酸组成，此Tgf2_L220序列与金鱼Tgf2转座 子序列(GenBank登录号HM146132)的左臂(参见SEQ ID No 5)的核苷酸具有至少95% 的同源性；所述Tgf2转座子右臂DNA序列，是由185个核苷酸组成，此Tgf2-R185序列与金 鱼Tgf2转座子序列(GenBank登录号HM146132)的右臂(参见SEQID No 6)的核苷酸具 有至少95%的同源性。实施例2、转基因供体质粒pTgf2_zf β -action-eGFP的构建分别取上述包含金鱼Tgf2转座子左、右臂序列质粒的甘油保存DH5 α菌液2 μ L， 分别接种到5ml氨苄青霉素含量为50 μ g/ml的液体LB培养基中，37°C振荡过夜培养，用质 粒小抽试剂盒(天根)提取质粒。包含金鱼Tgf2转座子左臂序列的质粒用限制性内切酶 SpeI和XhoI进行酶切，双酶切产物经1. 2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压 下电泳分离后，割胶回收目的片段并溶于双蒸水中，于-20°C保存备用，获得Tgf2-L220双 酶切DNA产物。包含金鱼Tgf2转座子右臂序列的质粒由限制性内切酶BglII和KpnI酶切， 经电泳分离后割胶回收目的片段，获得Tgf2-R185双酶切DNA产物。对pT2-EFla_eGFP质粒(
图1)进行SpeI和XhoI双酶切，酶切产物经1. 2 %琼 脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段并溶于双蒸
6水中。将Tgf2-L220双酶切DNA产物与pT2-EFla_eGFP质粒双酶切产物用T4DNA连接酶 连接成pTgf2AL220，并转入大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，送往上海生工生物工程有限公 司进行测序验证。把序列正确的阳性克隆接种到氨苄青霉素含量为50 μ g/ml的液体LB 培养基中，37°C振荡过夜培养，用质粒小抽试剂盒(天根)提取质粒，进行BglII和KpnI 双酶切，然后将Tgf2-R185双酶切产物与pTgf2AL220质粒双酶切产物用T4DNA连接酶连 接，并转入大肠杆菌DH5 α，提取阳性克隆质粒，经测序验证，得到包含金鱼Tgf2左右臂的 pTgf2-EFla-eGFP 质粒(图 2)。剪取斑马鱼(Danio rerio，上海海洋大学水产与生命学院C202)尾鳍，提取基因 组DNA，于-20°C保存备用。设计引物SEQ ID No :7 (带BamHI酶切位点)和SEQ ID No:8(带 XhoI酶切位点)在斑马鱼基因组进行PCR扩增，扩增反应程序为94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 150s，35个循环；72°C延长5min。扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓 冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段，将回收产物分别连接至pMD-19T 载体(TaKaRa)中，并转入大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 μ g/ ml的液体LB培养基中，37°C振荡过夜培养，取200 μ 1菌液甘油保存，并送往上海生工生物 工程有限公司进行测序。序列正确的阳性克隆质粒，进行BamHI和XhoI双酶切，酶切产物 经1. 2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段， 获得斑马鱼zf β -action启动子双酶切DNA产物。对pTgf2-EFla-eGFP质粒进行BamHI、XhoI双酶切，酶切产物经1. 2%琼脂糖凝胶， 以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段，获得pTgf2_eGFP质粒 双酶切产物，然后再与斑马鱼β -action启动子双酶切DNA产物用T4连接酶连接，并转入 大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，进行测序验证获得pTgf2_zf β -actin-eGFP转基因供体质 粒(图3)。实施例3、Tgf2转座酶mRNA (5’加帽)的体外转录根据已获得的信息，Tgf2转座酶在成熟的卵巢中表达量最高，取琉金金鱼成熟卵 巢组织，利用 TRIZOL(Invitrogen)试剂提取总 RNA，用 TaKaRa RNAPCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的逆转录酶反转为3’端单链cDNA，于-20°C保存备用。设计SEQ ID No :9(带BamHI酶 切位点)和SEQ ID No :10(带XbaI酶切位点)正反引物，扩增Tgf2转座酶(gfTP)编码 区全长(1734bp)，扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳 分离后，割胶回收目的片段，将回收产物连接至PMD-19T载体(TaKaRa)中，并转入大肠杆菌 DH5 α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50 μ g/ml的液体LB培养基中，37°C振荡过 夜培养，取200 μ 1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果 与预期一致后，取扩增产物直接进行BamHI、XbaI双酶切，酶切产物经1. 2%琼脂糖凝胶，以 TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段，于_20°C保存备用。对pCS2+质粒BamHI、XbaI双酶切，酶切产物经1. 2 %琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲 液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段，溶于双蒸水中。将gfTP的BamHI、 XbaI双酶切产物与pCS2+双酶切质粒用T4连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5 α，挑取阳性 克隆，取200 μ L菌液甘油保存，并进行测序验证。挑取阳性克隆接种到氨苄青霉素含量为 50 μ g/ml的液体LB培养基中，37°C振荡过夜培养，用质粒小抽试剂盒(天根)提取质粒，获 得Tgf2转座酶mRNA的体外转录辅助质粒pCS2_CMV-gfTP (图4)。辅助质粒pCS2_CMV-gfTP经NotI线性化后，采用Sp6 mMessage mMachine kit (Ambion)试剂盒进行Tgf2转座酶5’ 加帽mRNA的合成。实施例4、Tgf2转座酶mRNA介导供体质粒在斑马鱼中的转基因效果斑马鱼的饲养实验用斑马鱼饲养于循环水族箱中，雌雄分开暂养，每日饲喂两 次，一次为卤虫，一次喂人工饲料，温度恒定于28°C，光照14h，黑暗10h。产卵前一晚将雌鱼 与雄鱼配对于同一小水族箱中，中间用透明挡板隔开。实验当天早上抽去挡板让其自然产 卵。显微注射用0. 3 X Danieau buffer (含0. 酚红)配制终浓度各为50ng/μ 1 的pTgf2-zf β -actin-eGFP转基因供体质粒(图3)和辅助质粒pCS2_CMV-gfTP (图4)体 外转录的Tgf2转座酶5’加帽mRNA的混合溶液。显微注射使用的是美国WPI公司的PV830 Pneumatic Pico Pump型号的显微注射仪，整套显微注射系统通过氮气气压驱动。显微注射 用针为Imm玻璃毛细管经显微注射拉针器拉制而成，使用前用镊子去除玻璃针最尖端。注 射时将转基因质粒溶液与Tgf2转座酶mRNA的混合溶液添加到显微注射针中，并注射到斑 马鱼1 2细胞期胚胎的卵黄(靠近细胞部位)中，每个胚胎注射Inl溶液，转基因供体质 粒和Tgf2转座酶mRNA的注射剂量各约为50pg。注射完毕后，将受精卵放置于28°C的胚胎 培养液中正常发育，定期(每隔6小时)在荧光显微镜下观察荧光表达情况。结果一参见图5和图6，注射pTgf2_zf β -actin_eGFP+Tgf2转座酶mRNA的胚胎 36小时存活103颗，有绿色荧光89颗(图5)，荧光率为86. 4%，6天后有荧光的斑马鱼仔 鱼有38条，整合率为42. 6%。结果二 在另一注射组胚胎36小时存活147颗，有绿色荧光 79颗，荧光率为53. 7% ；6天后有荧光的斑马鱼仔鱼有27条，整合率为34. 1 %。实施例5、Tgf2转座酶mRNA介导供体质粒在银鲫中的转基因效果实验所用亲鱼取自上海海洋大学青浦鱼类育种试验站。挑选发育良好的2龄银鲫 (Carassius auratus gibelio)雌鱼30尾和2龄雄野鲤18尾，给银鲫早3尾打催产针，第一 针促黄体素释放激素类似物(LRH-A) 4 μ g/kg，第二针L2类似物6 μ g/kg+HCG1000U/kg ； 银鲫 1尾，仅注射第2针，剂量减半。第二天进行人工授精，受精卵粘于塑料培养皿上，每 个培养皿底部用记号笔划“米”字线，以便分格，并编号。每个培养皿粘卵不要太密，卵与卵 间尽量避免粘连。几分钟受精卵在吸水膨胀后，即可进行显微注射。在注射培养皿侧面写 好注射质粒、时间和剂量。显微注射仪系统2套，由2位熟练操作人员进行注射，2人根据注 射情况，负责授精，每次仅挤少量卵授精，剩余卵余留在母体中备用，亲鱼置于充气桶中。2 人负责换水(每4小时)和挑死卵(24小时后，换水前挑净死卵)，直至出膜。注射完毕后， 将受精卵放置室温下正常发育，定期(每隔6小时)在荧光显微镜下观察荧光表达情况。结果一参见图7和图8，注射pTgf2_zf 0-actin_eGFP+Tgf2转座酶mRNA，每个胚 胎注射Inl Tgf2 mRNA溶液，转基因供体质粒和Tgf2转座酶mRNA的注射剂量各约为50pg。 注射银鲫胚胎24小时存活74颗，有绿色荧光51颗，荧光率为68. 9%，6天后有荧光的银鲫 仔鱼有38条(图7)，整合率为51.4%。结果二 在另一注射组银鲫胚胎24小时存活126颗， 有绿色荧光76颗，荧光率为60. 3% ；6天后有荧光的银鲫仔鱼有69条，整合率为54. 7%。 传统线性化质粒注射的整合率基本在5%左右，发明人所述转基因方法的效率是传统质粒 注射方法的近10倍。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发 的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
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权利要求
一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法，其特征在于，是通过载体将目的基因注射入鱼类，所述载体包括转基因供体质粒和鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA，将转基因供体质粒，辅以鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA共同注射入鱼类1 2细胞期受精卵，即实现高效转基因。
2.一种如权利要求1所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征在于， 所述载体包括转基因供体质粒和鱼类Tgf2转座酶5’加帽mRNA ；所述转基因供体质粒包括鱼类Tgf2转座子左右臂、鱼类启动子DNA序列和目的基因；所述鱼类Tgf2转座酶mRNA5’加帽是Tgf2转座酶mRNA体外转录辅助质粒，再由辅助 质粒体外转录获得。
3.根据权利要求2所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征在于，所 述鱼类Tgf2转座子左右臂来自金鱼Tgf2转座子。
4.根据权利要求2所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征在于，所 述鱼类启动子DNA序列为斑马鱼β-actin启动子。
5.根据权利要求3所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征在于，所 述目的基因为水母绿色荧光蛋白基因。
6.根据权利要求2所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体，其特征在于，所 述体外转录辅助质粒的构建是将Tgf2转座酶mRNA读码框DNA序列与SP6启动子连接，构 建表达转座酶的辅助质粒。
7.—种如权利要求2所述的基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法的载体的制备方法，其 特征在于，(1)转基因供体质粒的构建运用PCR技术分别克隆斑马鱼β-actin启动子序列； 构建水母绿色荧光蛋白的基因表达盒；通过基因克隆技术将所述目的基因表达盒克隆入 Tgf2转座子的左右臂序列之间，构建鱼类转基因供体质粒；(2)Tgf2转座酶5’加帽mRNA :Tgf2转座酶mRNA读码框DNA序列与Sp6启动子连接， 构建能表达转座酶的辅助质粒，再采用Sp6 mMessagemMachine kit试剂盒进行Tgf2转座 酶5’加帽mRNA的体外转录。
全文摘要
本发明公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法。该方法通过注射转基因供体质粒，并辅以Tgf2转座酶mRNA两种载体，共同注射入鱼类1-2细胞期受精卵，即可实现高效转基因。转基因供体质粒包含金鱼Tgf2转座子左右臂、鱼类启动子DNA序列以及目的基因。Tgf2转座酶mRNA由包含金鱼Tgf2转座酶阅读框DNA序列的辅助质粒体外转入获得。本发明与常规鱼类转基因技术相比，具有整合效率高、负载容量大、通用、安全和高效的优点。
文档编号C12N15/66GK101962660SQ201010223188
公开日2011年2月2日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者杜雪地, 沈睿杰, 蒋霞云, 袁剑, 邹曙明 申请人:上海海洋大学