一种鉴别牦牛肉干产品肉种来源的三重pcr-rflp方法

文档序号:584697阅读:236来源:国知局
专利名称:一种鉴别牦牛肉干产品肉种来源的三重pcr-rflp方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域,涉及到牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重 PCR-RFLP快速鉴别。
背景技术
牦牛是我国青藏高原特有的牛种,其肉质优良、味美、无污染,是天然的绿色食品。 牦牛肉以高蛋白质和低脂肪而名列肉类前茅,牦牛肉产品在市场的占有率也在迅速地扩 大,价格与其他牛肉存在较大差距。因此,市面上出现了很多用黄牛肉(包括瘤牛和普通 牛)和水牛肉假冒牦牛肉产品的现象。为了确保广大消费者的权益,为执法人员提供技术 支撑,需要对牦牛肉、黄牛肉和水牛肉进行快速、准确的鉴别。对生鲜肉进行感官鉴别时,根据肉在颜色、气味、滋味和纤维粗细等方面的差异, 借助“看、闻、摸”,综合三个要点得出的判断,对肉类来源进行感官鉴另U。这在实际应用中存 在如下问题由于都是牛肉,所以很难通过感官手段进行准确鉴别。而免疫学检测是基于可 溶性抗原与抗体的免疫反应,应用种间特异性抗原进行设计研究的方法,但利用这种方法, 由于样品经过不同温度的加热处理会影响ELISA方法的检测准确性。特别是当样品经过高 温深加工处理后,蛋白发生了变性,改变了特异抗原决定簇,因此很难鉴别和区分不同的动 物物种。另外目前用于动物源性检测的试剂盒灵敏度较低,也不适于推广使用。而PCR-RFLP技术快速、简便、廉价,在肉产品的种属鉴别方面已有相关报道,但未 见有牦牛肉、黄牛肉和水牛肉快速鉴别的三重PCR-RFLP方面的报道。

发明内容
本发明的目的是解决牦牛肉干产品中肉种来源鉴别,提供一种快速牦牛肉、黄牛 肉和水牛肉鉴别的三重PCR-RFLP方法,为打击用黄牛肉(包括瘤牛和普通牛)和水牛肉假 冒牦牛肉干产品的不法行为提供技术支撑。将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别(1)1. 5mL离心管中加入约 lOOmg样品,用剪刀剪碎,加200 uL TE溶液(pH 8. 0),旋涡混勻;⑵加入400 u L裂解液, 旋涡混勻;⑶加入500iiL酚氯仿异戊醇(25 24 1),剧烈振荡,12000rpm离心 lOmin ; (4)取上清液,加入等体积氯仿异戊醇(24 1),剧烈振荡,12000rpm离心lOmin ; (5)取上清液,加入等体积氯仿,剧烈振荡,12000rpm离心lOmin ; (6)取上清液,加0. 8倍体 积异丙醇,12000rpm离心lOmin ; (7)弃上清液,收集DNA,接着取70%乙醇清洗1次,再将其 室温下自然干燥;(8)加100 yL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA,最后将其_20°C保存以备用。 (9)PCR扩增及检测用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F:5’-TAC CAT GAG GAC MATAT CAT TCTG-3,和通用下游引物R :5,_CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3,。 PCR 反应总体积为 25ii L,其中 10XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 ii L (2. 5U/ U L),dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各 2 u L,模板 DNA 2 u L,灭菌蒸 馏水补足总体积。扩增条件为95°C变性10min,95°C变性45s,53°C退火60s,72°C延伸60s,35个循环后再72°C继续延伸7min。取4 ii L PCR产物与1 y L 6X loadding buffer混合, 采用TAE缓冲系统,2%琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下 约25min,在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7 y L,然后依 次加入 HgaI、ApaI 和 PflMI 三种限制性内切酶各 0. 5 ii L,NEB buffer 2. 5 u L, ddH209 u L, 37°C温浴3h。酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断HgaI 把牦牛样品酶切割为220bp和252bp,Apal把普通牛样品酶切割为173bp和299bp,PflMI 把水牛样品酶切割为69bp和403bp。本发明在鉴别过程中采用PCR-RFLP方法,具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。


图1是具体实施方式
一中步骤(9)牦牛肉(1、2)、黄牛肉(3、4)和水牛肉(5、6)产 品扩增产物检测的凝胶电泳图;图2是具体实施方式
一中步骤(10)用三重酶切对具体实 施方式一中步骤(9)的PCR产物进行PCR-RFLP分析后检测的凝胶电泳图M :Marker 1,1 对照组,2 牦牛肉,3 黄牛肉,4 水牛肉,5 牦牛、黄牛和水牛混合肉样;6-11 牦牛肉干产品。
具体实施例方式具体实施方式
一将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别(1)1. 5mL离 心管中加入约lOOmg样品,用剪刀剪碎,加200iiL TE溶液(pH 8. 0),旋涡混勻;(2)加 入400 yL裂解液,旋涡混勻;(3)加入500 yL酚氯仿异戊醇(25 24 1),剧烈振 荡,12000rpm离心lOmin ; (4)取上清液,加入等体积氯仿异戊醇(24 1),剧烈振荡, 12000rpm离心lOmin ; (5)取上清液,加入等体积氯仿,剧烈振荡,12000rpm离心lOmin ; (6) 取上清液,加0. 8倍体积异丙醇,12000rpm离心lOmin ; (7)弃上清液,收集DNA,接着取70% 乙醇清洗1次,再将其室温下自然干燥;(8)力卩100yL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA,最后 将其-20°C保存以备用。(9)PCR扩增及检测用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上 游引物 F:5,-TAC CAT GAG GAC AAATAT CAT TCT G_3’ 和通用下游引物 R :5’-CCT CCTAGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3,。PCR 反应总体积为 25 ii L,其中 10 XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2u L(2. 5U/ u L), dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/u L 的上、下游引物各 2 u L,模板DNA 2 u L,灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为95°C变性lOmin,95°C变性45s, 53°C退火60s,72°C延伸60s,35个循环后再72°C继续延伸7min。取4 y L PCR产物与1 y L 6X loadding buffer混合,采用TAE缓冲系统,2%琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I) 在5v/cm恒压电泳条件下约25min,在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片 段的PCR产物7ii L,然后依次加入Hgal、Apal和PflMI三种限制性内切酶各0. 5 u L, NEB buffer 2. 5uL, ddH209 u L,37°C温浴3h。酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依 据酶切图谱进行判断HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp,Apal把普通牛样品酶切 割为173bp和299bp,PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。
权利要求
一种快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法,其特征在于可以把牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法鉴别(1)1.5mL离心管中加入约100mg样品,用剪刀剪碎,加200μLTE溶液(pH 8.0),旋涡混匀;(2)加入400μL裂解液,旋涡混匀;(3)加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),剧烈振荡,12000rpm离心10min;(4)取上清液,加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),剧烈振荡,12000rpm离心10min;(5)取上清液,加入等体积氯仿,剧烈振荡,12000rpm离心10min;(6)取上清液,加0.8倍体积异丙醇,12000rpm离心10min;(7)弃上清液,收集DNA,接着取70%乙醇清洗1次,再将其室温下自然干燥;(8)加100μLTE(pH 8.0)溶解提取的DNA,最后将其-20℃保存以备用。(9)PCR扩增及检测用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL,其中10×PCRBuffer 2.5μL,Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL),dNTPs(2.5mmol/L)2μL,10pmol/μL的上、下游引物各2μL,模板DNA 2μL,灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为95℃变性10min,95℃变性45s,53℃退火60s,72℃延伸60s,35个循环后再72℃继续延伸7min。取4μLPCR产物与1μL 6×loadding buffer混合,采用TAE缓冲系统,2%琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min,在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7μL,然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三种限制性内切酶各0.5μL,NEB buffer 2.5μL,ddH209μL,37℃温浴3h。酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp,ApaI把普通牛样品酶切割为173bp和299bp,PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的PCR-RFLP方法,其特征 在于步骤八中的扩增引物为通用上游引物 F :5,-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3,通用下游引物 R:5’ -CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3,
3.根据权利要求1所述的一种鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法,其 特征在于步骤(10)用Hgal、Apal和PflMI三个限制性内切酶同步进行PCR-RFLP分析。
全文摘要
快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法属于分子生物学检测领域,可用于牦牛肉干产品的来源追溯和物种成分的快速鉴别。它解决了目前牦牛肉、黄牛肉和水牛肉鉴别方法准确性低等缺陷,提供了一种牦牛肉、黄牛肉和水牛肉准确鉴别的PCR-RFLP方法。可将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别提取样品DNA,采用通用引物扩增和凝胶电泳检测,然后利用HgaI、ApaI和PflMI限制性内切酶进行同步酶切和PCR-RFLP分析,即可快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉。本发明采用PCR-RFLP方法,具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。
文档编号C12Q1/68GK101875976SQ20101022670
公开日2010年11月3日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者何建文, 冯海永, 安添午, 张 浩, 王继卿, 罗玉柱, 赵会静, 韩建林 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;甘肃农业大学
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