家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子及其应用的制作方法

文档序号:584812阅读:736来源:国知局
专利名称:家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及生物领域,特别涉及家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus, BmNPV) 39k 诱导型启动子及其应用。
背景技术
家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见且危害最严 重的一类病原,对蚕业影响巨大。如何利用当今发展迅速的基因工程技术,从根本上提高 家蚕病毒抗性,是蚕业领域重要的研究课题。基因敲除研究表明,缺失某些增殖必需基因, BmNPV将不能增殖。因此,抑制这些病毒增殖必需基因的表达将成为防治家蚕感染BmNPV的 一种有效策略。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是指外源性双链 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象,现已成为分子生 物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效应分子,是一类长21 23个核苷酸的双链RNA,在体内可特异性降 解与其序列互补的mRNA而引发RNA沉默。产生siRNA的方法有多种,其中化学合成法简单 易行,但由于siRNA的稳定性较差,在体内易被核酸酶降解,RNAi干扰效应时间短,因而分 子生物学家多采用siRNA表达载体法,即将短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)对应的 DNA模板序列插入载体启动子后构建RNAi载体,RNAi载体导入体内后持续转录出shRNA, shRNA被RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA,从而引发较长时间的RNA沉默效 果。因此,利用RNAi技术,以BmNPV增殖必需基因为靶标构建RNAi载体,再将其导入家蚕 细胞并持续表达能够导致BmNPV增殖必需基因mRNA降解的siRNA,是防治家蚕感染BmNPV 和培育家蚕抗病毒品系的有效手段。近年来,研究者先后利用T7启动子,3XP3启动子及IE-I启动子等组成型启动子 来构建以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体。虽然这些启动子能够诱发较高的RNAi 效率,但外源基因的组成性表达会对转基因家蚕的发育和健康造成一定负面影响。根据杆 状病毒基因转录的级联模式,延迟早期基因的转录依赖于反式激活因子的基因产物,如果 在构建RNAi载体时选择由病毒感染所诱导的诱导型启动子,则有望在病毒感染时迅速提 高siRNA表达水平,减少外源基因组成性表达的负荷,提高转基因家蚕的健康性。但迄今为 止,尚未见有关BmNPV诱导型启动子的研究报道。

发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种BmNPV诱导型启动子,具有明显的 BmNPV诱导启动活性,能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达;目的之二在于提 供含有所述诱导型启动子的重组表达载体;目的之三在于提供含有所述重组表达载体的转 化体;目的之四在于提供所述诱导型启动子的应用。为达到上述目的,本发明采用如下技术方案
1、BmNPV 39k诱导型启动子,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2、含有所述BmNPV 39k诱导型启动子的重组表达载体。进一步,所述重组表达载体是以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体,所述 RNAi载体包含由BmNPV 39k诱导型启动子控制表达的shRNA,所述shRNA与BmNPV增殖必 需基因的mRNA具有同源性。3、含有所述重组表达载体的转化体。4、所述BmNPV 39k诱导型启动子在家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种中的应用。本发明的有益效果在于本发明提供了一种BmNPV 39k诱导型启动子,具有明显 的BmNPV诱导启动活性,能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达。利用本发明 的启动子和shRNA可以构建以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体,在家蚕遭受BmNPV 感染时高丰度表达shRNA,shRNA在胞内被酶剪切成siRNA,特异性降解BmNPV增殖必需基因 的mRNA,从而引发BmNPV增殖必需基因的转录后沉默,达到抑制病毒增殖的目的,可用于家 蚕感染BmNPV的防治以及家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种,同时也可为其他生物病毒病 的转基因治疗提供了很好的参考模式。由于BmNPV只感染昆虫,因此,本发明的BmNPV 39k 诱导型启动子对人畜及植物安全无害。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述,其中图1为克隆的含有BmNPV 39k启动子序列与BmNPV基因组序列的比对结果;图2为39k启动子报告基因重组载体pGL3_39k的构建示意图;图 3 为 39k 启动子 RNAi 载体 pBac [39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]的构建示意图;图4为稳定转染pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]的BmN-SWUl细胞的筛选结果 (IOX),A为荧光视野,B为白光视野;图5为Bm-BacPAK6在感染后不同时间点稳定转染BmN-SWUl细胞中的增殖 情况,A、B、C 的病毒滴度依次为 1.014X 101Q、1. 014X107、l. 014X 106PFU/mL ;* 代表与 pBac [39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]组相比,P < 0. 05 ;# 代表与空白组相比,P < 0. 05 ;图6为野生型BmNPV在稳定转染BmN-SWUl细胞中的增殖情况(1000X) ;A为白光 视野,B为荧光视野,C为AB叠加。
具体实施例方式以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克 等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。一、BmNPV诱导型启动子的选择与克隆从美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载BmNPV全基因组序列(NC001962. 1), 根据杆状病毒的级联调控特征,延迟早期基因启动子(β基因)受到立即早期基因(α基 因)产物的激活调控作用,选择BmNPV延迟早期基因39k启动子作为候选启动子。通过Primer Premier 5. 0软件设计如下PCR特异引物上游引物39kP_F :5,_cccaagctttgttgctccggcatgttt-3' (SEQ ID No. 2),下划线部分为 Hind III 酶切位点;下游引 物 39kP~R :5,-ggggtacccttgacccgaagcgaaat-3,(SEQ ID No. 3),下划线部分为 Kpn I 酶切 位点。以BmNPV全基因组为模板,以39kP-F和39kP_R为引物,PCR扩增长度为362bp的含 有39k启动子片段,PCR程序为94°C预变性5分钟;然后94°C变性50秒,58°C退火50秒, 72°C延伸2分钟,共30个循环;最后72°C延伸10分钟。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定、切胶回收纯化后,与T载体pMD19-T连接,连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞, 用含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆,挑取阳性克隆单菌落,用含有Amp的LB 培养基过夜培养后提取质粒,测序,将阳性克隆质粒命名为pMD19-T-39k。将克隆的含有39k启动子片段的序列与BmNPV基因组序列进行比对,结果如图1 所示,克隆的含有39k启动子片段包含启动子转录核心区域,存在明显的杆状病毒启动子 特征序列,在转录起始位点(cat)上游含有真核启动子TATA盒(142 148bp的tataaaa 以及152 158bp的tatataa)、早期基因转录起始位点的保守序列(cagt)和翻译起始密码 子(atg),序列上符合真核生物启动子的特点,局部位置存在突变。39k启动子片段的序列 如 SEQ ID No. 1 所示。二、BmNPV诱导型启动子的活性检测U39k启动子报告基因重组载体pGL3-39k的构建及其在Sf9和BmN-SWUl细胞中 的相对荧光素酶活性检测(1) 39k启动子报告基因重组载体pGL3_39k的构建39k启动子报告基因重组载体pGL3_39k的构建示意图如图2所示,将重组载体 pMD19-T-39k用Hind III和Kpn I双酶切,双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯 化后,与同样经Hind III和Kpn I双酶切的双荧光素酶报告基因检测载体pGL3-BasiC连 接,连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆,挑取阳 性克隆单菌落,用含有Amp的LB培养基过夜培养后提取质粒,Hind III和Kpn I双酶切鉴 定,将阳性克隆质粒命名为pGL3-39k。(2) pGL3-39k转染Sf9细胞的相对荧光素酶活性检测将空载体pGL3-Basic、重组载体 pGL3_39k、pGL3_39k+BmNPV、 pGL3-39k+AcMNPV(苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒)分别用脂质体转染试剂瞬时转染草地 贪夜蛾细胞系Sf9,转染后72小时收集、裂解细胞,离心取上清,用双荧光素酶报告基因检 测试剂盒测定裂解上清的萤火虫荧光素酶活性(PPL)和海肾荧光素酶活性(PRL),计算相 对荧光素酶活性(PPL/PRL),考察转染Sf9细胞的39k启动子活性。结果见表l,39k启动子 在异源细胞Sf9中的组成型表达活性较低;当sf9细胞被AcMNPV感染后,39k启动子活性 显著提高,相对荧光素酶活性由0. 4110提高至64. 9268,感染后约为感染前的158倍。表1转染Sf9细胞的相对荧光素酶活性 注:*表示与pGL3-Basic组及空白组相比,P < 0.01o(3) pGL3-39k转染BmN-SWUl细胞的相对荧光素酶活性检测将空载体pGL3-Basic、重组载体pGL3-39k、pGL3_39k+BmNPV分别用脂质体转染试 剂瞬时转染家蚕卵巢细胞BmN-SWUl,分别于转染后12、24、48、72小时收集、裂解细胞,离心 取上清,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定裂解上清的PPL和PRL,计算相对荧光素酶 活性,考察转染BmN-SWUl细胞在转染后不同时间点的39k启动子活性。结果见表2,39k启 动子在BmN-SWUl细胞中有一定的组成型表达活性;当BmN-SWUl细胞被BmNPV感染后,39k 启动子活性上调且随着时间延长逐步提高,转染后72小时39k启动子活性显著增加,相对 荧光素酶活性由6. 0151提高到12. 6497,感染后约为感染前的2. 103倍。表2转染BmN-SWUl细胞在转染后不同时间点的相对荧光素酶活性 注:*表示与pGL3-Basic组及空白组相比,P < 0.01o2,39k 启动子 RNAi 载体 pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFPafm]的构建及其在 BmN-SWUl 细胞中的抗病毒活性检测(1) 39k 启动子 RNAi 载体 pBac [39kP-dsIE2-A3-EGFPafm]的构建39k 启动子 RNAi 载体 pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFPafm]是以 BmNPV 增殖必需基因 IE-2为靶标的shRNA载体,为避免在构建过程中IE-2正、反向片段配对导致载体结构不稳 定,采用将IE-2正、反向片段分别连接至中间载体的构建策略。其构建示意图如图3所示①PCR分别扩增载体构建所需的各DNA片段,包括两端带有Hind III和Spe I 酶切位点的39k启动子片段(SEQ ID No. 1)、两端带有Spe I和Pst I酶切位点的IE-2 正向片段(SEQ ID No. 4)、两端带有Pst I和Kpn I酶切位点的A3内含子片段(SEQ ID No. 5)、两端带有Kpn I和BamH I酶切位点的IE-2反向片段(SEQ IDNo. 6)、以及两端带 有BamH I和EcoR I酶切位点的SV40终止序列(SEQ ID No. 7),再将各DNA片段分别连接入 T 载体 PMD19-T Simple 中,获得重组载体 PMD19_T_39kP、PMD19-T-IE2S、PMD19-T-A3、 PMD19-T-IE2A 和 PMD19-T-SV40 ;②用Hind III 禾口 Spe I 分别酶切 PMD19_T_39kP 和载体 pSLfall80fa,回收 39k启动子片段并连接入pSLfall80fa中,获得重组载体PSLfall80fa_39kP ;再用Spe 和Pst I分别酶切PMD19-T-IE2S和pSLfall80fa-39kP,回收IE-2正向片段并连接入 pSLfall80fa-39kP 中,获得重组载体 pSLfall80fa_39kP_IE2S ;③用Pst I和Kpn I分别酶切PMD19-T-A3和pSLfall80fa,回收A3内含子片段 并连接入pSLfall80fa中,获得重组载体pSLfall80fa_A3 ;再用BamH I和EcoRI分别酶 切 PMD19-T-SV40 和 pSLfall80fa_A3,回收 SV40 终止序列并连接入 pSLfall80fa_A3 中, 获得重组载体pSLfall80fa-A3-SV40 ;再用Kpn I和BamH I分别酶切PMD19-T-IE2A和 pSLfall80fa-A3-SV40,回收IE-2反向片段并连接入pSLfall80fa-A3-SV40中,获得重组载 体pSLfall80fa-A3-IE2A-SV40 ;④用Pst I 禾口 EcoR I 分另lj g| 切 pSLfal 180fa-A3-IE2A-SV40 禾口 pSLfal 180fa-39kP-IE2S,回收 A3-IE2A-SV40 片段并连接入 pSLfal 180fa_39kP_IE2S 中,获 得重组载体 pSLfal 180fa-39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 ;⑤用ASC I 自 pSLfal 180fa-39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 中酶切出 39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 片段;同时用 Bgl II 酶切载体 piggyBac [A3-EGFP afm],补平末 端,将 39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 片段连接入 piggyBac [A3-EGFP afm]中,即得 39k 启动子 RNAi 载体 pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]。(2)pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]转染 BmN-SWUl 细胞的抗病毒活性检测将39k启动子RNAi载体pBac [39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]用脂质体转染试剂瞬时 转染BmN-SWUl细胞,转染后72小时用含有750 μ g/ml G418的培养基进行筛选培养,近4 个月后获得约有80%稳定转染pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]的BmN-SWUl细胞,如图4 所示,绿色荧光细胞即为转基因细胞。取pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]转基因细胞、piggyBac [A3-EGFP afm] 转基因细胞和正常BmN-SWUl细胞(空白),接种不同稀释度的线性化家蚕杆状病毒 Bm-BacPAK6 (母液滴度为1. 014X 10nPFU/ml),分别于接种后不同时间点取培养基,利用 X-gal显色检测Bm-BacPAK6中β -半乳糖苷酶(LacZ)的表达,以观察线性化病毒的增殖情 况。数据采用SPSS 13. O软件的One-way ANOVA进行统计学分析,并进一步用LSD法和SNK 法分析组间显著性差异。结果如图5所示,当pBaC[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]转基因细胞 受到较高滴度(1. 014X IOkiPFUAiI)的Bm-BacPAK6感染时,在病毒感染前期(48 84小 时)具有显著的抗病毒效果(P < 0. 05);而受到较低滴度(1. 014 X IO7 1. 014 X IO6PFU/ ml)的Bm-BacPAK6感染时,在病毒感染后期(84 108小时)具有显著的抗病毒效果(P < 0. 05)。取pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]转基因细胞,接种野生型BmNPV后,在荧光显 微镜下检测病毒在细胞中的增殖情况。结果如图6所示,发绿色荧光的转基因细胞中未见 病毒多角体形成,而不发绿色荧光的非转基因细胞中形成大量病毒多角体,说明转基因细 胞对野生型BmNPV增殖的抑制作用很显著。上述实验结果证实BmNPV 39k启动子为BmNPV诱导型启动子,具有很高的BmNPV诱导启动活性,能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达。利用本发明的39k启 动子和shRNA构建以BmNPV增殖必需基因IE-2为靶标的RNAi载体,将其导入家蚕细胞后, 可以达到抑制BmNPV增殖的目的,可用于家蚕感染BmNPV的防治以及家蚕抗BmNPV品系的 基因工程育种。 最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.含有权利要求1所述家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述重组表达载体,其特征在于所述重组表达载体是以家蚕核型 多角体病毒增殖必需基因为靶标的RNA干扰载体,所述RNA干扰载体包含由家蚕核型多角 体病毒39k诱导型启动子控制表达的短发卡RNA,所述短发卡RNA与家蚕核型多角体病毒增 殖必需基因的mRNA具有同源性。
4.含有权利要求2或3所述重组表达载体的转化体。
5.权利要求1所述家蚕核型多角体病毒39k诱导型启动子在家蚕抗核型多角体病毒品 系的基因工程育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)39k诱导型启动子及其应用,该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其具有明显的BmNPV诱导启动活性,能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达;利用该启动子可以构建以BmNPV增殖必需基因为靶标的RNAi载体,在家蚕遭受BmNPV感染时高丰度表达shRNA,shRNA在胞内被酶剪切成siRNA,特异性降解BmNPV增殖必需基因mRNA,从而引发BmNPV增殖必需基因的转录后沉默,达到抑制病毒增殖的目的,可用于家蚕感染BmNPV的防治以及家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种,同时也可为其他生物病毒病的转基因治疗提供很好的参考模式。
文档编号C12N15/63GK101914537SQ20101023195
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者向仲怀, 夏庆友, 李娜, 潘敏慧, 赵爱春, 鲁成 申请人:西南大学
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