专利名称：编码猪β防御素的基因及用其制备猪β防御素的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪β防御素蛋白的制备方法。
背景技术：
防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子活性肽，广泛分布于动物、植物和昆虫体内。 由于其具有广谱的抗微生物活性，因此被命名为“防御素”(defensins)。体外抑菌试验表明，防御素能对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物产生较强的杀伤作用，构成宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。防御素分子内可形成3对二硫键，分子质量约为2 6KD，由四 M个氨基酸残基组成，分子中含有6 8个保守的半胱氨酸。防御素依据其半胱氨酸空间排布及二硫键大小和形成方式的不同，可分为哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素3种类型。哺乳动物防御素又分为α _、β _、θ -防御素3种类型。β -防御素最早从牛气管粘膜上皮中分离得到，广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。β -防御素含38-42个氨基酸，有6个保守半胱氨酸。猪的防御素1广泛分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、心肝肾等多种器官内以及中性粒细胞和肺泡巨噬细胞内。随着耐药菌的出现，内源性的抗微生物肽越来越受到重视。β-防御素 (β-defensin)作为抗菌肽的一种，借助其独特的生物学特性，极易被肠道吸收，也因其特殊的抗菌机制，不会诱导产生耐药性微生物。另一方面，动物食品安全越来越受到重视，使用无污染、无残留、无毒副作用的添加剂是解决该问题的关键。防御素是动物体成分之一， 参与生命过程，是小分子短肽，具有安全无毒副作用的生物学特征。用基因工程方法生产环保型β -防御素饲料添加剂，或通过日粮添加，对畜牧业生产具有极为重要的现实意义。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前掌握最为成熟的原核表达系统。该项技术主要是将已克隆入外源基因的载体转化到细菌中，通过诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白。其优点是能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低。与其他表达系统相比，大肠杆菌还具有遗传背景清楚，表达周期短、操作简便和使用安全等特点，成为外源基因表达的首选系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种优化的猪β防御素基因，以及利用该基因制备具有生物活性的猪β防御素蛋白的制备方法。猪β-防御素(pBD-Ι)是在猪固有免疫中起重要作用的抗菌小肽。本发明根据 Genbank已发表的猪β防御素基因核苷酸序列(登录号ΝΜ_213838. 1)以及大肠杆菌密码子偏好性对DNA序列进行改造，并在其5’端加上NcoI酶切位点，在其3’端加上终止密码子和EcoRI酶切位点，得到长约150pb的基因序列:cc ATG GCT AAA MT ATTGGC AAT AGC GTG AGC TGC CTG CGT MT AAA GGC GTG TGTATG CCG GGC AAA TGC GCG CCG AAA ATG AM CAG ATT GGCACC TGC GGC ATG CCG CAG GTG AAA TGC TGC AAA CGT AAGtaataataa gaattc(如SEQ ID NO. 1所示)。其是根据pBD核苷酸序列和大肠杆菌密码子偏好性优化的序列，利于 PBD基因在大肠杆菌中的表达。上述优化的基因可以采用本领域已知的技术合成，优选采用over-lap PCR法合成，其中采用了序列如SEQ ID NO. 2-7所示的6条寡核苷酸链作为引物。产物包括完整的 pBD基因。over-lap PCR法是根据优化后的基因序列设计的6条寡核苷酸直接进行拼接， 不需要从组织或细胞中提取RNA进行反转录，同时可以实现直接对基因的优化改造。在合成上述优化基因的基础上，本发明进一步提供了一种具有生物活性的猪β 防御素的制备方法，其是将上述基因重组至载体中，获得重组质粒，再将重组质粒转化入大肠杆菌中，用IPTG诱导防御素蛋白在大肠杆菌中表达。由于基因专门针对大肠杆菌表达系统优化过，故而可以获得很高的表达效率。构建重组质粒的方法可以采用任何已知的方法， 优选将over-lap PCR法合成的整条基因末端加A后，连接到pMD19_T simple载体中。经 EcoR I和Noc I酶切后，克隆到ρΕΤ-3^ι载体中，同时在pBD的羧基端引入载体中的6XHis 标签，获得重组质粒pET-32a-pBD。用BamH I单酶切初步鉴定阳性克隆。测序结果正确后， 用IPTG诱导pBD蛋白在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE电泳后可以得到大小约^kD的蛋白， 用His标签单抗经Western blot可以检测到特异条带的表达，证明为pBD特异蛋白。最好再经His-Ni柱纯化pBD蛋白。利用QIAGEN的预装Ni柱填料纯化pBD_l蛋白，收集各段洗脱液。将收集到的上样滤液、杂蛋白滤液和不同阶段洗脱下的目的蛋白做SDS-PAGE分析。 同时利用BCA法测定pBD-Ι蛋白浓度，利用超滤浓缩管浓缩pBD蛋白，_80°C分装保存备用。 所得到的蛋白，浓度可达到约lmg/ml。将纯化后的蛋白还可以进一步进行超滤浓缩，以达到细菌计数实验的要求。将纯化浓缩后的PBD分别与致病性大肠杆菌(E.coli 0149)、金黄色葡萄球菌 (S. aureus CVCC-C56010)和单胞李斯特菌在体外共培养，通过细菌计数实验，证实纯化得到的猪β防御素具有明显的杀灭致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单胞李斯特菌的作用。并且其作用呈现量-效关系。上述技术方案具有如下优点本发明用分子生物学技术，优化了猪β防御素基因，并直接合成了基因用于构建猪β防御素大肠杆菌原核高效表达载体，诱导表达后获得可溶性融合蛋白，并且该融合蛋白可利用M柱进行纯化，纯化的猪β防御素蛋白在体外对常见的病原菌具有较强的抗菌活性。本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
图1为pBD基因扩增产物电泳图，图中Marker自上到下依次为600bp，500bp， 400bp, 200bp, IOObp, M =Marker, 1 β -defensin ；图2为pMD19-T-pBD酶切鉴定电泳图，图中Marker自上到下依次为:23130bp, 9416bp，6567bp，4516bp，2322bp，2027bp，M :Marker，1 =EcoR I 单酶切鉴定，2:Nco I 单酶切鉴定，3 :酶切前质粒；图3为pET-3h-pBD表达载体质粒设计图；图4为pET-3^i-pBD表达载体酶切鉴定电泳图，图中Marker自上到下依次为 23130bp，9416bp，6567bp，4516bp，2322bp，2027bp，M =Marker, 1 :pET32a质粒BamHI 单酶切，2 :PET32a质粒，3 表达载体BamHI单酶切，4 表达载体；图5为重组融合蛋白pBD的诱导表达SDS-PAGE电泳图，图中蛋白Marker代表的蛋白分子大小自上到下依次为i:35kD，83kD，62kD，47. 5kD，32. 5kD，25kD，16. 5kD, M =Marker, 1 :阳性菌株不加IPTG诱导2小时样品，2 阳性菌株加ImM IPTG诱导2小时样品，3 阳性菌株不加IPTG诱导4小时样品，4 阳性菌株加ImMIPTG诱导4小时样品，5 阳性菌株不加 IPTG诱导6小时样品，6 阳性菌株加ImM IPTG诱导6小时样品，7 阳性菌株不加IPTG诱导8小时样品，8 阳性菌株加ImM IPTG诱导8小时样品；图6为重组蛋白pBD Western-blot鉴定结果，图中蛋白Marker代表的蛋白分子大小自上到下依次为i;35kD，83kD，62kD，47. 5kD，32. 5kD，25kD，16. 5kD, M =Marker, 1 阳性菌株不加IPTG诱导2小时样品，2 阳性菌株加ImM IPTG诱导2小时样品，3 阳性菌株不加IPTG诱导4小时样品，4 阳性菌株加ImM IPTG诱导4小时样品，5 阳性菌株不加IPTG 诱导6小时样品，6 阳性菌株加ImMIPTG诱导6小时样品，7 阳性菌株不加IPTG诱导8小时样品，8 阳性菌株加ImM IPTG诱导8小时样品；图7为表达产物pBD可溶性分析和纯化SDS-PAGE电泳图，图中蛋白Marker代表蛋白分子大小自上到下依次为 116. OkD, 66. 2kD，45. OkD, 35. OkD, 25. OkD, 18. 4kD, 14. 4kD, M:Marker，l 诱导表达前体超声破碎上清，2 上清通过Ni柱后收集的样品，3 不含咪唑洗脱液洗脱样品，4和5 含50mM咪唑的洗脱液洗脱样品，6 含IOOmM咪唑的洗脱液洗脱样品， 7 含200mM咪唑洗脱液洗脱样品；图8为纯化pBD的SDS-PAGE电泳结果，图中蛋白Marker代表蛋白分子大小自上到下依次为 116. OkD, 66. 2kD，45. OkD, 35. OkD, 25. OkD, M =Marker, 1 纯化后的融合蛋白 pBD ；图9为纯化后pBD的Western-blot鉴定结果，图中蛋白Marker代表蛋白分子大小自上到下依次为 l!35kD，83kD，62kD，47. 5kD，32. 5kD，25kD，16. 5kD, M =Marker, 1 :纯化后的融合蛋白pBD ；图10为不同浓度pBD融合蛋白对大肠杆菌的抑制作用；
图11为不同浓度pBD融合蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用；图12为不同浓度pBD融合蛋白对病原性李氏杆菌的抑制作用。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。(1)猪β防御素β-defensin基因的合成根据Genbank已发表的pBD_l核苷酸序列(登录号NM_213838. 1)，参照大肠杆菌密码子偏好性对DNA序列进行改造，在其5’端加上NcoI酶切位点，在其3’端加上终止密码子和EcoRI酶切位点，得到长约150pb序列(如SEQ ID NO. 1所示):ccATG GCT AAAAAT ATT GGC AAT AGC GTG AGC TGC CTG CGT AAT AAA GGC GTG TGTATG CCG GGC AAA TGC GCG CCG AAA ATG AM CAG ATT GGC ACC TGCGGC ATG CCG CAG GTG MA TGC TGC AAA CGT AAG taataataa gaattc。设计6条寡核苷酸链，利用over-lap PCR法合成整条基因。6条寡核苷酸链序列如下(依次见SEQ ID NO. 2-7所示)。Pl :5’ -CCATGGCTAA AAATATTGGC AATAGCGTGA GCTGCCT-3’
5
P2:5，-GCATACACACGCCTTTATTACGCAGGCAGCTCACGCT-3'
P3:5，-TAATAAAGGCGTGTGTATGCCGGGCAAATGCGCGCCGAAA--3
P4:5，-CGGCATGCCGCAGGTGCCAATCTGTTTCATTTTCGGCGCG--3
P5:5，-TTGGCACCTGCGGCATGCCGCAGGTGAAATGCTGCAA-3'
P6:5，-GAATTCTTATTATTACTTACGTTTGCAGCATTTCAC-3，
合成后的寡核苷酸链片段加无菌水溶解成10 μ M，使用over
片段。PCR体系为每条引物各5 μ L，2单位的pfu酶，5 μ L pfu buffer,5yL dNTP最后补水至50 μ L，进行PCR循环。循环条件如下:95V 30sec，40°C 30sec，72°C 30sec，30个循环。 经过琼脂糖电泳分析，得到大小约150bp左右的片段(图1)。(2) β -defensin基因克隆与测序over-lap PCR法合成的整条pbd基因片段用无水乙醇法沉淀，在只有dATP存在条件下用Taq酶72°C处理15min，进行3’末端加A处理。所得产物用琼脂糖凝胶电泳后回收，与PMD19-T simple载体(商购)进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(商购)。筛选白斑，利用碱裂解法小量提取质粒，用EcoR I和Nco I分别进行酶切鉴定，得到线性载体的大小约为^42bp(图2)。酶切鉴定为阳性的克隆进行测序。(3)表达载体的构建与鉴定将测序正确的pMD-pBD经EcoR I和Nco I双酶切后，克隆到pET_3h载体(商购)中，同时在pBD的羧基端引入载体中的6XHis标签，获得如图3所示的重组质粒 pET-3h-pBD。由于pET-3h载体多克隆位点上带有BamH I酶切位点，该位点有恰好位于 EcoR I和Noc I酶切位点之间。在酶切连接入pbd基因片段之后，BamH I位点消失，因此该重组质粒不能被BamH I线性化(图4)。经BamH I单酶切初步鉴定的阳性克隆由诺塞基因公司完成测序。(4)重组融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒pET-32a_pBD转化到E. coli BL 21(DE3)(商购)中。挑单菌落接种于LB液体培养基中(含50yg/ml氨苄霉素)，37°C过夜培养。次日按接种于50ml LB液体培养基中(含50 μ g/ml氨苄霉素)，37°C振荡培养至OD600为0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度为ImM，30°C，200rpm振荡培养，分别于诱导后2、4、6、8小时各取菌液5mL， 离心保留菌体。最后用SDS-PAGE电泳检测诱导表达情况。重组融合蛋白带有Trx-Tag、 His-Tag和S-Tag，大小约为21kD。SDS-PAGE电泳(图5)可见，诱导后有大小相符的蛋白产生，且随诱导时间增加，在6-8小时达到最高。(5)重组蛋白的鉴定经SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上，利用目的蛋白上的 His标签，用抗6XHis单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗，进行 Western Blot分析(图6)。从图中可观察到只有在表达产物条带大小(21kD)的位置处可见目的条带。(6)表达产物可溶性分析诱导6-8小时的菌液离心收集菌体，按20 1比例重悬于PBS中，超声破碎 (300-400W，超声5s,间隔5s，工作20分钟)，然后12000rpm离心15分钟，分别保留上清和沉淀，用SDS-PAGE电泳检测分析目的蛋白是否为可溶性蛋白。在菌体超声破碎上清检测到
6大量表达的融合蛋白，因此判定表达产物基本为可溶性蛋白(图7)。同时，用Ni柱对破碎的菌体上清进行纯化，用梯度咪唑洗脱液洗脱，收集各洗脱峰进行电泳，发现用含200mM咪唑洗脱液对目的蛋白进行洗脱收集为最适洗脱条件(图7)。(7)重组蛋白的纯化按(6)所述条件和方法纯化所得到的pBD融合蛋白进行SDS-PAGE(图8)和 Western blot (图9)鉴定，证明该纯化方法可得到较纯的目的蛋白。图8为纯化pBD的 SDS-PAGE电泳结果，图9为纯化后pBD的Western-blot鉴定结果。(8)猪防御素重组融合蛋白生物学功能检测用超滤浓缩管将pBD融合蛋白进行浓缩，将缓冲液A置换为pH8. 5的IOmM磷酸盐缓冲液。用BCA法测定蛋白浓度。大肠杆菌0149于LB培养基中37°C振荡过夜培养，次日按1 100转接入新鲜LB 培养基中37°C振荡培养至对数生长期，取ImL菌液5000 X g离心5min，去除培养基，用等体积磷酸盐缓冲液重悬后5000Xg离心5min，清洗2_3次后，加入梯度稀释的pBD融合蛋白液(梯度一般为PBD融合蛋白终浓度0. 2mg/mL 5mg/mL)，用磷酸盐缓冲液补充至总体积 lmL。37°C培养15min 池，用细菌计数法计算共培养后大肠杆菌数量的变化。用同样的方法测定pBD对金黄色葡萄球菌和单胞李斯特菌生长的影响。测定结果如图10-12所示，从图中可以看出，所得到的pBD融合蛋白对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和单胞李斯特菌均有较强的抑制作用，并且随着蛋白浓度的增大抑菌效果也随着升高，具有明显的量-效关系。说明了本发明得到的PBD融合蛋白具有很高的在抑菌产品中的应用价值。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种编码猪β防御素的基因，其特征在于，其具有如SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其是利用6条寡核苷酸链作为引物，采用 over-lap PCR法合成的，其中所述6条寡核苷酸链的序列如SEQ ID NO. 2_7所示。
3.权利要求1或2所述的基因在大肠杆菌中的表达。
4.一种具有生物活性的猪β防御素的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因重组至载体中，获得重组质粒，再将重组质粒转化入大肠杆菌中，用IPTG诱导防御素蛋白在大肠杆菌中表达。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pET-32a。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤表达后经His-Ni柱纯化防御素蛋白。
7.采用权利要求6的制备方法制得的防御素蛋白，其特征在于，浓度为lmg/ml。
8.权利要求7所述的防御素蛋白在制备杀灭病原性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和病原性李氏杆菌的产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种优化的猪β防御素基因，以及利用该基因制备具有生物活性的猪β防御素蛋白的制备方法。本发明用分子生物学技术，优化了猪β防御素基因，并直接合成了基因用于构建猪β防御素大肠杆菌原核高效表达载体，诱导表达后获得可溶性融合蛋白，并且该融合蛋白可利用Ni柱进行纯化，纯化的猪β防御素蛋白在体外对常见的病原菌具有较强的抗菌活性。本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK102337270SQ20101023745
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者卢瑛, 王永强, 郑世军, 韩菡 申请人:中国农业大学