专利名称：一种烟草黑胫病菌的简便分离方法
技术领域：
本发明属于农业微生物分离技术领域，具体涉及一种利用简易的设备或条件高 效、快速分离烟草黑胫病菌的简便分离方法。
背景技术：
烟草黑胫病(tobacco black shank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一， 特别是在温带、亚热带和热带发生较重，也是我国烟草的主要病害之一。烟草黑胫病病原 的分离方法通常是在发病田块采集病株，在实验室利用选择性培养基平板分离病菌(郑小 波，疫霉菌及其研究技术，北京，中国农业出版社，1997，P84-85)。因此，这种病样采集与病 菌分离往往存在3 7天或者更长的时间差，病样在此期间极容易受到其它杂菌的污染，致 使一些病样的病菌分离失败。而且分离需要消毒、采用选择性培养基，操作比较烦琐。为 此，本发明人针对现有技术的不足，根据典型病样的特点，研制开发了一种适合于田间采集 病样并即时分离病菌的简便分离方法，实验证明，应用效果良好。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种工艺简便，适合于田间作业 条件下简易环境应用的烟草黑胫病菌的简便分离方法。本发明的目的是这样实现的利用简易设备和简陋的空间条件营造洁净工作环 境，快速分离烟草黑胫病菌，具体包括以下步骤A、病株选择与采集选择田间症状典型，无其它症状，病茎无开裂或未被人为剖 开，即呈碟片状的病髓片被密封包裹于健康茎杆中的病株作为目标病株；采集时去茎顶、叶 片和根，仅留取病茎，冲洗表面浮尘后晾干，每根病茎分别用灭菌的卫生纸包裹分隔，置于 一次性使用的干净封口袋内；B、净化工作环境选择不通风的室内，用洁净水喷雾沉降空气中的尘埃，达到分离 所需的空气环境要求；分离前，用点燃的酒精灯火焰灭菌形成无菌小环境；C、病菌分离从上部剖开病茎，两手抓住病茎上端，扳开病茎至呈碟片状的病髓片 露出；用火焰灭菌的弯头镊子夹取呈碟片状的病髓片，置于火焰下的培养基平板内，每个采 样点用3 5个培养基平板，每个平板上放置病髓片3 5片；D、对分离的病菌进行室温培养，根据菌落形态挑选目标病菌。E、病菌鉴定采用孢子灌根法或菌谷法接种感病品种红花大金元进行病菌鉴定， 病情严重度大于1的菌株就有致病性。分离的病菌可采用水浸菌丝块法于6 10°C恒温条件下保存，通常可保存1 2 年。分离病菌的致病性可用孢子灌根法[梁元存，刘延荣，王玉军，王智发，张广民。烟草黑 胫病菌致病性分化和烟草品种的抗病性差异，植物保护学报，2003，30(2) 143-147]或菌 谷法(GB/T 23224-2008烟草品种抗病性鉴定)进行验证。本发明适用于田间采样后的即时病菌分离，整个操作所用设备简单，在不具备微
3生物实验室的条件下也可开展分离工作，分离病菌的纯度高，保持了病菌野生型的特性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限定， 任何基于本发明技术思路的等同替换，均落入本发明的保护范围。本发明利用简易设备和简陋的空间条件营造洁净工作环境，快速分离烟草黑胫病 菌，具体包括以下步骤A、病株选择与采集选择田间症状典型，无其它症状，病茎无开裂或未被人为剖 开，即呈碟片状的病髓片被密封包裹于健康茎杆中的病株作为目标病株；采集时去茎顶、叶 片和根，仅留取病茎，冲洗表面浮尘后晾干，每根病茎分别用灭菌的卫生纸包裹分隔，置于 一次性使用的干净封口袋内；B、净化工作环境选择不通风的室内，用洁净水喷雾沉降空气中的尘埃，达到分离 所需的空气环境要求；分离前，用点燃的酒精灯火焰灭菌形成无菌小环境；C、病菌分离从上部剖开病茎，两手抓住病茎上端，扳开病茎至呈碟片状的病髓片 露出；用火焰灭菌的弯头镊子夹取呈碟片状的病髓片，置于火焰下的培养基平板内，每个采 样点用3 5个培养基平板，每个平板上放置病髓片3 5片；D、对分离的病菌进行室温培养，根据菌落形态挑选目标病菌。E、病菌鉴定采用孢子灌根法或菌谷法接种感病品种红花大金元进行病菌鉴定， 病情严重度大于1的菌株就有致病性。所述的病菌分离中病髓片放置所用培养基平板直径为6 9cm，平板打开角度为 10° 15°，病髓片每片放置的时间为3 5s。所述的室温培养是将培养基平板用封口膜封口，3 5个平板一起置于密封的培 养盒内，室温条件培养3 5天，然后根据菌落形态挑选目标病菌。所述的培养基为燕麦培养基或利马豆培养基。所述的燕麦培养基的组成为燕麦片30g，琼脂17 20g，蒸馏水1000ml。所述的利马豆培养基的组成为利马豆60g，琼脂17 20g，蒸馏水IOOOml。实施例1选择田间症状典型，无其它症状，病茎无开裂或未被人为剖开，即病髓片呈碟片状 被密封、包裹于健康茎杆中的病株作为目标病株，采集时去茎顶、叶片和根，仅留取病茎，冲 洗表面去浮尘，晾干，每根病茎分别用灭菌的卫生纸包裹分隔，置于一次性使用的干净封口 袋内。在洁净的环境下进行病菌分离，首先从茎上部剖开病茎，两手抓住病茎上端，扳开病 茎，至呈碟片状的病髓片露出。然后用火焰灭菌的弯头镊子夹取病髓片，置于火焰下的燕麦 培养基平板内；所用培养基平板直径为6 9cm，平板打开角度为10° 15°，病髓片每片 放置的时间为3 5s ；每个采样点用3 5个平板进行分离，每个平板放病髓片3 5片。 将平板用封口膜封口，3 5个平板一起置于密封的培养盒内，室温条件下培养3 5天，根 据纯白色的菌落形态挑选目标病菌。分离病菌的致病性用孢子灌根法接种感病品种红花大 金元进行验证，病情严重度大于1(GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法)的菌株 就有致病性。实施例2
4
用利马豆培养基平板代替燕麦培养基平板，其余同实施例1。实施例3按实施例1的方式选择病茎、分离病髓片并进行室温培养，根据纯白色的菌落形 态挑选目标病菌。分离病菌的致病性用菌谷法接种感病品种红花大金元进行验证，病情严 重度大于1的菌株就有致病性。实施例4按实施例2的方式选择病茎、分离病髓片并进行室温培养，根据纯白色的菌落形 态挑选目标病菌。分离病菌的致病性用菌谷法接种感病品种红花大金元进行验证，病情严 重度大于1的菌株就有致病性。发明的工作原理和特点本发明利用黑胫病菌从根茎部侵染、蔓延至茎髓部的特性，以健康组织包裹的内 部病组织为分离材料，与国内同类分离方法相比优点表现在1、本发明提供的一种烟草黑胫病菌简便分离方法更适用于田间采样的及时分离， 整个操作所用设备简单，在不具备微生物实验室的条件下也可开展分离工作。2、本发明中使用的培养基平板在严格的微生物实验条件下制备，分离在相对简陋 的洁净环境中进行，有利于实验室专业人员与基层技术人员的工作对接，即专业人员制备 平板、培训简易分离技术，基层技术人员在基层可及时分离，专业人员就可直接收集病菌分 离物，有利于扩大病菌收集范围。3、本发明采用的病组织为病茎的内部组织，所以病菌类型单一，分离时不必进行 表面消毒、不采用选择性培养基，保持了病菌野生型特性，可降低成本，节省时间。4、本发明从典型病样的筛选、采集与存放，病菌分离时剖茎的器具没有接触到病 髓片、弯头镊子的使用(可减少平板开启的角度)、平板的选择以及开启角度和时间的限 定，病菌密封培养等措施保证了分离病菌的纯度。分离的效率可达90% 95%，比常规技 术效率(70% 80%)显著提高，污染率明显下降，减少污染2 4倍。
权利要求
一种烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于利用简易设备和简陋的空间条件营造洁净工作环境，快速分离烟草黑胫病菌，具体包括以下步骤A、病株选择与采集选择田间症状典型，无其它症状，病茎无开裂或未被人为剖开，即呈碟片状的病髓片被密封包裹于健康茎杆中的病株作为目标病株；采集时去茎顶、叶片和根，仅留取病茎，冲洗表面浮尘后晾干，每根病茎分别用灭菌的卫生纸包裹分隔，置于一次性使用的干净封口袋内；B、净化工作环境选择不通风的室内，用洁净水喷雾沉降空气中的尘埃，达到分离所需的空气环境要求；分离前，用点燃的酒精灯火焰灭菌形成无菌小环境；C、病菌分离从上部剖开病茎，两手抓住病茎上端，扳开病茎至呈碟片状的病髓片露出；用火焰灭菌的弯头镊子夹取呈碟片状的病髓片，置于火焰下的培养基平板内，每个采样点用3～5个培养基平板，每个平板上放置病髓片3～5片；D、对分离的病菌进行室温培养，根据菌落形态挑选目标病菌。E、病菌鉴定采用孢子灌根法或菌谷法接种感病品种红花大金元进行病菌鉴定，病情严重度大于1的菌株就有致病性。
2.根据权利要求1所述烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于所述的病菌分离中 病髓片放置所用培养基平板直径为6 9cm，平板打开角度为10° 15°，病髓片每片放置 的时间为3 5s。
3.根据权利要求1所述烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于所述的室温培养是 将培养基平板用封口膜封口，3 5个平板一起置于密封的培养盒内，室温条件培养3 5 天，然后根据菌落形态挑选目标病菌。
4.根据权利要求1或3所述烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于所述的培养基 为燕麦培养基或利马豆培养基。
5.根据权利要求4所述烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于所述的燕麦培养基 的组成为燕麦片30g，琼脂17 20g，蒸馏水1000ml。
6.根据权利要求4所述烟草黑胫病菌的简便分离方法，其特征在于所述的利马豆培养 基的组成为利马豆60g，琼脂17 20g，蒸馏水1000ml。
全文摘要
本发明提供一种烟草黑胫病菌的简便分离方法，利用简易设备和简陋的空间条件营造洁净工作环境，快速分离烟草黑胫病菌，具体包括(1)病株选择与采集；(2)净化工作环境；(3)病菌分离；(4)病菌室温培养等步骤。即在简易条件下营造洁净的工作环境，酒精灯火焰灭菌形成无菌小环境，剖开病茎，镊取病茎内碟片状的病髓片，置于燕麦或利马豆培养基平板；培养基平板用封口膜封口，3～5个平板置于密封的培养盒内，室温培养3～5天，根据菌落形态即可得到目标病菌。本发明适用于田间采样后及时分离，整个操作所用设备简单，在不具备微生物实验室的条件下也可开展分离工作，分离病菌的纯度高，保持了病菌野生型的特性。
文档编号C12R1/645GK101914454SQ20101025123
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者余清, 宋春满, 方敦煌, 晋艳, 秦西云, 莫笑晗 申请人:云南省烟草农业科学研究院