专利名称：一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型 的方法。
背景技术：
迟发性皮肤卟啉病(porphyria cutanea tarda，PCT)是由于血红素生物合成过程
中的第5个酶-尿卟啉原脱羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase, UR0-D)分子缺陷
或活性降低而引发的一种最常见的卟啉病，多在中年以后发病，男性较多。有关PCT的研究 最早见于1950年，在土耳其，人们因食用了喷洒过杀真菌剂六氯苯的小麦种子而引发了一 场PCT的大爆发。从此以后人们用六氯苯等氯化的碳氢化合物诱发动物PCT。啮齿类动物 摄入铁、血红素合成前体S-氨基-Y-酮戊酸、酒精等也可诱发PCT。另一类用于研究PCT 的动物模型就是URO-D基因敲除小鼠。但是，尚未有血红素氧化酶-1 (Heme Oxygenase-I, H0-1)诱发人或动物PCT的研究报道。血红素氧化酶(heme oxygenase，H0)催化血红素 分解产生铁，一氧化碳和胆绿素。申请者在制作了全身性过表达H0-1的转基因C57BL/6/ DBA2 (BDFl)小鼠后，发现该转基因雄性小鼠患上了迟发性皮肤卟啉病。该迟发性皮肤卟啉 病动物模型基于H0-1转基因的过表达。
发明内容
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步 骤步骤1，构建一线性转基因序列，该序列从5'至3'依次含有chicken β -actin 启动子，CMV增强子，小鼠HO-I cDNA编码序列，终止信号rabbit β-globin poly (A)序列；步骤2，应用显微注射方法将构建的基因序列注入C57BL/6/DBA2 (BDFl)小鼠受精 卵；步骤3，将步骤2中的受精卵植入假孕鼠的输卵管；步骤4，产生FO代转基因小鼠，该小鼠基因组中整合有外源性H0-1表达序列；步骤5，将获得的阳性转基因小鼠与野生型BDFl小鼠杂交，获得子代。在上述的一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，所述的构建一线性 转基因序列的具体方位为在小鼠基因组中扩增H0-1基因序列，克隆入pCAGG载体。H0-1 cDNA 由 chicken β-actin启动子和 CMV增强子启动，H0-1 连接rabbit β -globin poly (A) 终止信号，质粒经Sail andDral酶切，获得线性转基因序列。因此，本发明具有如下优点通过转基因技术过表达H0-1，建立了一种能自发再 现迟发性皮肤卟啉病症状的小鼠模型，不仅为PCT的病因、发病机制作了理论上的补充，更 为其治疗提供更多有价值的新理念。另一方面，本发明也为证明H0-1过表达还具有致病性 提供证据，为今后利用H0-1保护机体提供理论及实验依据。
附图1是显微注射用转基因构件示意图；附图2是HO-I在转基因(Tg)及野生型(WT)小鼠肝脏中的表达及HO活性测定， A为Western blot检测H0-1在Tg及WT小鼠肝脏中的表达水平示意图；B为HO活性示意 图，*，与同窝野生型小鼠比较P < 0. 05 ；附图3是雄性HO-I转基因(Tg)小鼠患PCT。其中，A禾Π B为雄性ΗΟ-lTg小鼠 的牙齿受到紫外线照射时发出红色荧光(箭头所示)；C为牙齿发出红色荧光(红牙小 鼠)及野生型小鼠的尿口卜琳图。URO，uroporphyrin ；HEPTA, hepatacarboxyporphyrin ； C0PR0, coproporphyrin ；D和E为红牙小鼠的肝脏中PCT所特有的针样内容物(箭头所 示)，X400。。
具体实施例方式下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。实施例结合附图，以下实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。一、获得目的基因设计引物，在小鼠基因组中扩增H0-1基因序列，克隆入pCAGG载体。H0_1 cDNA由 chicken β -actin 启动子和 CMV 增强子启动，HO-1 连接 rabbit β -globin poly (A)终止 信号(图1)。质粒经Sail and DraI酶切，获得线性转基因序列，纯化回收用于显微注射。二、H0-1经显微注射引入BDF-I小鼠受精卵及阳性鼠的产生将线性化的目的基因片段注射入BDF-I小鼠受精卵的原核中，使其与小鼠基因组 整合，随着细胞不断分裂，每个细胞将携带该片段。仔鼠出生3周后，剪去小鼠尾尖，以PCR 的方法进行转基因小鼠的鉴定。三、转基因在小鼠体内的表达活性结合图2A，H0-1转基因小鼠肝脏H0-1蛋白表达水平增加。结合图2B，H0-1转基因小鼠肝脏HO活性为野生型的28倍。四、转基因小鼠的病理、生化特征①项目申请人在成功制作了 H0-1全身过表达转基因小鼠后，发现10月龄以上雄 性H0-1转基因小鼠的牙齿受到紫外线照射时发出红色荧光(图3A、B)，至14月龄时全部 雄性H0-1转基因小鼠都呈现此表现型。②卟啉类物质受到紫外线照射时可发出红色荧光，因此，提示我们该10月龄以上 雄性H0-1 Tg小鼠可能患上了某种卟啉病。经高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)对牙齿出现红色荧光的小鼠(简称红牙小鼠)的尿液中卟啉含量 及成分的检查发现，吓啉含量明显高于野生型同窝小鼠，且呈“uroporphyrin(URO) > hepa tacarboxyporphyrin(HEPTA)彡 coproporphyrin(C0PR0) ”样排泄图。这样的卟啉排泄图与 PCT患者的一致。③进一步，病理检查证实凡红牙小鼠肝内均可见到针样的内容物(图3D、E)，这是 PCT所特有的病理特征。
综上，确诊10月龄以上雄性HO-I转基因小鼠患PCT。本发明以雄性H0-1转基因 小鼠为PCT模型，可用于对PCT发病机制的研究。在本实施例中，缩写的含义分别如下PCT (porphyria cutanea tarda，迟发性皮肤卟啉病)URO-D(uroporphyrinogen decarboxylase,尿口卜啉原脱羧酶)H0-1 (Heme Oxygenase-1，血红素氧化酶 _1)WT(wild type，野生型)Tg(transgene，转基因)URO (uroporphyrin，原口卜啉)HEPTA (hepatacarboxyporphyrin, 7 羧基卟啉)C0PR0 (coproporphyrin,粪卟啉)本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领 域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替 代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
权利要求
一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，构建一线性转基因序列，该序列从5′至3′依次含有chicken β actin启动子，CMV增强子，小鼠HO 1 cDNA编码序列，终止信号rabbit β globin poly(A)序列；步骤2，应用显微注射方法将构建的基因序列注入C57BL/6/DBA2(BDF1)小鼠受精卵；步骤3，将步骤2中的受精卵植入假孕鼠的输卵管；步骤4，产生F0代转基因小鼠，该小鼠基因组中整合有外源性HO 1表达序列；步骤5，将获得的阳性转基因小鼠与野生型BDF1小鼠杂交，获得子代。
2.根据权利要求1所述的一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，其特征 在于，所述的构建一线性转基因序列的具体方位为在小鼠基因组中扩增HO-I基因序列， 克隆入pCAGG载体，HO-I cDNA由chicken β -actin启动子和CMV增强子启动，Η0-1连接 rabbit β-globin poly (A)终止信号，质粒经Sail and DraI酶切，获得线性转基因序列。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法。本发明提供一种具有可稳定遗传、能够自发产生一系列符合临床迟发性皮肤卟啉病生化、病理特征的动物模型。迄今为止PCT的病因和发病机制并不完全清楚。尚未见有HO-1参与人或动物PCT发病机制的研究报道。本发明通过转基因技术过表达HO-1，建立了一种能自发再现迟发性皮肤卟啉病症状的小鼠模型，不仅为PCT的病因、发病机制作了理论上的补充，更为其治疗提供更多有价值的新理念。
文档编号C12N15/63GK101921795SQ201010253969
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者周凌云, 彭亚会, 惠洋, 邹朝霞, 马宁, 高旭 申请人:哈尔滨医科大学