专利名称：羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白pip基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种羊草的盐碱胁迫诱导蛋白基因。
背景技术：
将植物转基因技术应用于强耐盐碱植物的培育是一种有效的途径，已经有各种基因获得专利的报道。目前，应用于农作物分子育种的抗盐碱基因多来源于非盐生的模式植物拟南芥、水稻等植物中，虽然通过转基因过量表达有提高作物抗逆性的报道，但是其转基因效率及功能尚有待提高。我国大部分地区盐碱化土壤多为氯化盐(Cr)盐碱土，这种土壤主要表现为盐化影响，即Na+对植物的胁迫，而东北地区盐碱地的突出特点是不仅存在氯化盐(Cl—)盐碱土， 还有大面积的碳酸盐OX)/—)盐碱土，即不仅存在高盐离子而且同时伴有高pH危害。目前， 对植物耐盐碱的研究还大多集中于植物耐NaCl盐性，而对植物耐碱性特别是耐碳酸盐(高 pH)研究还亟待深入。羊草(Leymus chinensis)属禾本科赖草属植物，是一种广布于东北地区的优良牧草，尤其突出的是羊草具有较强的耐盐碱性，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因，是进行抗性基因筛选的良好材料。
发明内容
本发明目的是为了解决现有耐盐基因转化获得的耐盐转基因植物的耐盐能力不高的问题，克隆一种抗盐碱能力强的牧草羊草的一种盐碱胁迫应答基因一羊草(Leymus chinensis)盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因。这种抗逆相关基因可以用于科研与生产中， 用于其详细的抗性机理等方面的研究，并通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。羊草是一种广泛分布于东北地区的优良牧草，被称为“牧草中的细粮”。另外，羊草还具有突出的耐盐碱性，可在黑龙江的盐碱土壤地区种植，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因。长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，而针对羊草的抗盐碱特性的研究也主要集中在生理学指标的测定上，但从分子生物学角度对羊草抗盐碱特性进行研究还比较少，远不能满足对其相关特性分子水平研究的要求。本发明通过克隆出抗盐碱能力很强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因，然后通过Northern杂交和基因芯片技术检测其在盐碱胁迫下的表达情况，分析它是否与植物的抗盐碱能力相关。本发明的基因编码区长 879bp，编码292个氨基酸。经序列同源性blast分析表明，该基因与禾本科其它植物大麦、 小麦的盐碱胁迫诱导铁蛋白PIP基因相比同源性较高，DNA序列有约10%的差异，氨基酸序列差异小于5%，本发明获得的羊草PIP蛋白基因未见基因登录信息及相关序列信息报道。 应用Northern杂交和基因芯片技术研究盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因在盐碱胁迫后的表达，结果发现盐碱胁迫下该基因表达量增加2倍以上，为抗盐碱相关基因。
图1为PIP基因PCR扩增电泳图，M =DNA Marker DL2000 ；1 目的片段；图2为盐胁迫后羊草中PIP基因的表达，样品顺序由1至 分别为200mmOl/LNa2C03@灌处理0h、2h、 6h、12h、24h、48h、72h。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因的编码区序列如说明书附图中所示。
具体实施方式
二 本实施方式羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因的氨基酸序列如说明书附图中所示。
具体实施方式
三本实施方式羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因按以下步骤制备(一)羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因的克隆首先利用TSE法提取羊草的总RNA，用Amersham Biosciences公司的mRNA纯化试剂盒分离mRNA。采用PCR-klect cDNA Subtraction Kit，以盐碱胁迫下的羊草样品为试验方(Tester)，非盐碱条件下生长的羊草样品为消减方(Driver)构建羊草消减文库。然后对文库克隆进行测序，测序引物为T7引物，cDNA文库克隆的测序仪为GE公司的MegaBACE 1000DNA序列分析仪。通过对文库克隆的BlastX分析获得铁蛋白PIP基因片段，序列为CTGGCAGGCGGGACGCACTANTGATTTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGCGCTTTTTTTTTTTCAAAACTAGGAAATAAGCTATATCGATGAAAGCNTACATTTCAAGAGCAAGGANGAAAATACGGGCAAAACAATACACGAAGGACTCCATCCACAGTCGGCAGACTTGATGGTTTGACTAGTCGCGGCTCTTGCAAGGGGATTGCCCTGGATCACACACACGTGGTAGATGGCCGCACAGCGCCGCGCCTGATAAACGGACACCACCCAGAAAGATCCCAGCTG根据获得的EST片段序列进行引物设计，利用RACE法，克隆获得羊草完整的PIP 基因。用NCBI ORF FOUNDER寻找开放读码框，所获得的基因cDNA序列全长1215bp，编码区长879bp，编码292个氨基酸，结果见说明书附图。 根据PIP基因的序列设计引物，利用RACE法进行PCR扩增，经0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，在IOOObp处得到了单一条带(见说明书附图1)，与预期结果一致。( 二)基因芯片检测羊草植株在盐碱胁迫下的应答将羊草抑制性消减文库中的cDNA序列及本实验室获得的星星草、草原龙胆的 cDNA序列共同点制在同一张芯片上，制备cDNA微阵列。在反转录过程中，利用引物序列中包含的Cy3、Cy5荧光染料捕获序列标记盐碱胁迫下生长的羊草和温室培养羊草(非盐碱胁迫)的cDNA，按照3DNA Array900 试剂盒中相应步骤完成芯片杂交。芯片杂交进行了三次生物学重复，杂交结果显示出的变化倍数超过2倍的认为是具有显著表达差异的基因。基因芯片检测结果显示PIP基因表达变化倍数在3次生物重复中均超过2倍。表1基因芯片检测PIP基因表达变化倍数
基因编号基因注释变化倍数GO13402aquaporin PIPl (Pipl)2.192.312.29C022002aquaporin PIPl (Pipl)2.402.452.64A020301aquaporin PIPl (Pipl)2.192.092.74(三)羊草PIP基因对逆境胁迫的应答将温室(平均温度^°C，湿度约为60%，光照时间14h/d)中盆栽8周龄羊草分别用200mmol/L Na2CO3溶液浇灌，进行胁迫处理，分别在胁迫处理前，胁迫2，6，12，24，48，72h 后取羊草地上部分，迅速放入液氮冷冻，-80°C保存备用。TSE法提取不同胁迫条件下不同时间的羊草叶部总RNA，利用Northern杂交技术， 研究羊草中该基因在Na2CO3胁迫处理下不同时间点的表达情况，结果见说明书附图2。从图中可以看出，对照(非胁迫)羊草无明显的目的条带，说明在非胁迫下羊草的 PIP基因表达量很低。而在盐胁迫1 后，PIP基因表达明显增加，表明该基因能够对Na2CO3 胁迫做出应答。
权利要求
1.羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因，其特征在于羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP 基因的编码区序列如下所示ATGGAGGGCAAGGAGGAGGACGTGCGCCTGGGCGCGAACCGGTACTCGGAGCACCAGCCTATCGGCACGGCG GCGCAGGGCGGCGGCGCGGACGAGAAGGACTACAAGGAGCCTCCCCCGGCCCCGCTCTTCGAGGCGGAGGAGCTCAC CTCCTGGTCCTTCTACCGGGCCGGCATCGCCGAGTTCCTGGCCACCTTCCTCTTCCTCTACATCAGCGTCCTCACCG TCATGGGCGTGGTGGGCAACCCGTCGGGGTCCAAGTGCGGGACCGTGGGCATCCAGGGCATCGCCTGGAGCTTCGGC GGCATGATCTTCGTGCTCGTCCACTGCACCGCCGGCATCTCCGGCGGCCACATCAACCCGGCGGTCACCTTCGGGCT GTTCCTGGCCCGGAAGCTGTCGCTCACCAGGGCCGTCTTCTACATGGTGATGCAGTGCCTGGGCGCGATATGCGGGG CTGGGGTTGTCAAGGGGTTCCAGACCACGCTGTACCAGGGCAACGGCGGCGGCGCCAACTCCGTCGCGCCCGGGTAC ACCAAGGGAGACGGGCTCGGGGCCGAGATCGTCGGCACGTTCGTGCTGGTTTACACCGTGTTCTCCGCCACCGACGC CAAGCGCAGCGCCAGAGACTCACACGTCCCCATTTTGGCGCCGCTTCCGATCGGGTTCGCAGTGTTCCTGGTGCACC TGGCGACGATCCCCATCACCGGGACCGGCATCAACCCGGCGAGGTCCCTCGGCGCCGCCATCATCTACAACAAGAAG CAGGCGTGGGACGACCACTGGATCTTCTGGGTGGGTCCGTTCATCGGCGCAGCGCTGGCGGCCATCTACCACGTGGT GGTGATCAGGGCAATCCCCTTCAAGAGCCGCGACTAG。
2.羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP基因，其特征在于羊草盐碱胁迫诱导水孔蛋白PIP 基因的氨基酸序列如下所示MetGluGlyLysGluGluAspValArgLeuGlyAlaAsnArg TyrSerGluHisGlnProlieGlyThrAlaAlaGlnGlyGlyGly AlaAspGluLysAspTyrLysGluProProProAlaProLeuPheGluAlaGluGluLeuThrSerTrpSerPheTyrArgAlaGlyIle AlaGluPheLeuAlaThrPheLeuPheLeuTyrlieSerValLeuThrValMetGlyValValGlyAsnProSerGlySerLysCysGlyThrValGlylieGlnGlylieAlaTrpSerPheGlyGlyMetliePheValLeuValHisCysThrAlaGlylieSerGlyGlyHislieAsnProAlaValThrPheGlyLeuPheLeuAlaArgLysLeuSerLeuThrArgAlaValPheTyrMetValMetGlnCysLeuGlyAlalieCysGlyAlaGlyValValLysGlyPheGlnThrThrLeuTyrGlnGlyAsnGlyGlyGlyAlaAsnSerValAlaProGlyTyrThrLysGlyAspGlyLeuGlyAlaGlulieValGlyThrPheValLeuValTyrThrValPheSerAlaThrAspAlaLysArgSerAlaArgAspSerHisValProlieLeuAlaProLeuProlieGlyPheAlaValPheLeuValHisLeuAlaThrlieProlieThrGlyThrGlylieAsnProAlaArgSerLeuGlyAlaAlalielieTyrAsnLysLysGlnAlaTrpAspAspHisTrpliePheTrpValGlyProPhelieGlyAlaAlaLeuAlaAlalieTyrHisValValVallieArgAlalieProPheLysSerArgAsp
全文摘要
羊草盐碱胁迫诱导PIP蛋白基因，它属于基因工程技术领域。本发明利用RACE法克隆获得耐盐碱能力极强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-PIP蛋白基因全长序列，然后，通过Northern检测和遗传转化检测其在盐碱胁迫下表达情况，分析它是否与抗盐碱胁迫相关。本发明获得的PIP蛋白基因编码区879bp，编码292个氨基酸。与禾本科其它植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10％的差异，氨基酸序列差异小于5％，本发明获得的羊草PIP蛋白基因未见基因登录信息及相关序列信息报道。本发明所得基因Northern杂交和基因芯片技术研究盐碱胁迫诱导PIP蛋白基因在盐碱胁迫后的表达，结果发现，盐碱胁迫下该基因的表达量增加2倍以上，为与盐碱胁迫相关基因。
文档编号C12N15/29GK102373219SQ20101025590
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者张旸, 李玉花, 王江, 解莉楠 申请人:张旸, 李玉花, 王江, 解莉楠