专利名称：一种快速获得转基因微生物的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种微生物转基因方法。
背景技术：
转基因技术的运用可以突破物种的界限，使物种间的基因进行传递，人们依此 改良物种性状，可以达到服务人类的目的。横向基因转移是指受体生物体通过无性方 式从供体生物体中得到遗传物质的过程，与此相对应的纵向基因转移是指遗传物质通 过繁殖从亲代传递给后代的过程。研究表明在生物体间广泛存在横向基因转移现象 (Keepling and Palmer, Nat RevGenet. 20089 :605_18 ；Bapteste E and Boucher, Trends Microbiol. 200816 :200_207 ；Bock, TrendsPlantSci. 2010 15 11-22)。本发明依照微生物 间同样也存在横向基因转移现象这一特点，在其培养液中直接加入待转化的DNA片段，通 过静止培养、筛选等实验，最终验证外源DNA片段已成功插入微生物基因组中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速简便的不依赖于表达载体的转基因微生物方法。本发明的技术方案是这样实现的先将宿主微生物培养至对数期，离心沉淀，用新 鲜LB培养基重悬至0D600 = 0. 5后，加入待转化的外源DNA片段(工作浓度彡IOOng/μ 1)， 混合静止培养后抗生素平板筛选获得转基因菌株。本发明中，根据宿主微生物的不同，采用不同的培养条件；根据外源DNA的不同， 采用不同的筛选方法。当宿主以沙雷氏菌(S. plymuthica)为例，外源DNA以Gm(抗庆大霉 素乙酰转移酶基因)表达框为例时，具体可采用以下步骤进行1、获得大量的待转化的Gm表达框片段，工作浓度彡IOOng/μ 1 ；2、将宿主微生物沙雷氏菌(S. plymuthica)培养至对数期，离心沉淀，用新鲜的LB 培养基重悬至0D600 = 0. 5 ；3、将步骤1的Gm表达框片段与步骤2的菌液混合后，静止培养48h ；4、向步骤3中加入Gm抗生素，使其工作浓度为25mg/L，28 °C，180rpm振荡培养 24h ；5、将上步菌液离心沉淀，涂布于Gm+的LB固体平板上，28°C，培养；6、对步骤5中长出的菌落，提取其基因组为模板，以待转化的外源DNA片段两端的 特异性引物PCR扩增，测序验证外源DNA片段(Gm表达框)已成功插入到细菌基因组中，即 已获得转基因菌株。上述步骤中为了获得高效转基因菌株，可将步骤4中得到的菌液离心沉淀，用新 鲜的LB培养液重悬，再次加入外源DNA片段后，静止培养24h，之后加入Gm抗生素，使其工 作浓度为25mg/L，28°C，180rpm振荡培养24h。本发明的优点及效果本发明不用构建转基因表达载体，方法简便，获得转基因菌 株周期短。可广泛用于多种微生物遗传转化研究中。
图1为Gm表达框PCR电泳图谱，M为DL2000Maker。图2为转基因菌株PCR电泳图谱，其中M为DL2000Maker，GU G2、G3为随机选取 的三个转基因菌株PCR结果，1、2、3为三个转基因菌株提取基因组电泳结果。图3为新霉素磷酸转移酶II基因(Km)表达框PCR电泳图谱，M为DL2000Maker。图4为转基因菌株PCP电泳图谱，其中M为DL2000Maker，KU K2、K3为随机选取 的三个转基因菌株PCR结果。图5为转Gm基因的假单胞杆菌菌PCR电泳图谱，其中M为DL2000Maker，G4、G5、 为随机选取的两个转基因菌株PCR结果。
具体实施例方式本发明在具体应用时，可以根据受体微生物的不同，采用不同的培养条件；根据外 源DNA的不同，采用不同的筛选方法。在实施例中所涉及到的生物材料由申请人保存的，均 承诺自申请日起向公众提供20年。下面结合具体实例进行说明实施例1 将Gm表达框插入沙雷氏菌(S. ρlymuthica)基因组中先将宿主微生物沙雷氏菌(S. plymuthica G3)(申请人保存，World J MicrobiolBiotechnol. 2010,26 1465-1471)培养至对数期，离心沉淀，用新鲜的LB培养基 重悬至0D600 = 0. 5。将外源DNA片段(图1) (Gm表达框为例)，工作浓度需彡IOOng/ μ 1 与上述菌液混合，静止培养48h后加入Gm抗生素(工作浓度为25mg/L)，28°C，ISOrpm振荡 培养24h。将菌液离心沉淀，涂布于Gm+的LB固体平板上，28°C培养。对长出的菌落，提取 其基因组为模板，以Gm表达框两端的特异性引物(上游引物5’ -AATTGACATAAGCCTGT-3’ ； 下游引物5，-TTGTGACAATTTACCGAA-3，)PCR扩增(图2)，测序验证外源DNA片段(Gm表达 框)以成功插入到细菌基因组中，即已获得转基因菌株。实施例2 将新霉素磷酸转移酶II表达框插入大肠杆菌(E. coli)DH5a基因组中先将宿主微生物(大肠杆菌(E. coli)DH5a)培养至对数期，离心沉淀，用新鲜的LB 培养基重悬至0D600 = 0. 5。将外源DNA片段(图3)(新霉素磷酸转移酶II表达框)调整 至工作浓度彡lOOng/μΙ，与上述菌液混合，静止培养48h后加入Km抗生素(工作浓度为 50mg/L)，37°C，180rpm振荡培养24h。将菌液离心沉淀，涂布与Km+的LB固体平板上，37°C培 养。对长出的菌落，提取其基因组为模板，以新霉素磷酸转移酶II表达框两端的特异引物 (上游引物5，-ATCTGATCATGAGCGGAGAAT-3，；下游引物5，-GCTCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3，) PCR扩增(图4)，测序验证外源DNA片段(新霉素磷酸转移酶II表达框)以成功插入到细 菌基因组中，即已获得转基因菌株。实施例3 将Gm表达框插入根癌农杆菌(A. tumefacien)基因组中先将宿主微生物根癌农杆菌(A. tumefaciens EHA105 28°C培养至对数期，离心沉 淀，用新鲜的YEP培养基重悬至0D600 = 0. 5。将外源DNA片段(图1) (Gm表达框为例)， 工作浓度需彡lOOng/μΙ与上述菌液混合，静止培养48h后加入Gm抗生素(工作浓度为 25mg/L)，28°C，180rpm振荡培养24h。将菌液离心沉淀，涂布于Gm+的YEB固体平板上，28°C 培养。对长出的菌落，提取其基因组为模板，以Gm表达框两端的特异性引物(上游引物5，-AATTGACATAAGCCTGT-3’ ；下游引物:5，-TTGTGACAATTTACCGAA-3‘ ) PCR 扩增(图 5)，测 序验证外源DNA片段(Gm表达框)以成功插入到细菌基因组中，即已获得转基因菌株。
权利要求
一种快速获得转基因微生物的方法，其特征在于先将宿主微生物培养至对数期，离心沉淀，用新鲜LB培养基重悬至OD600＝0.5后，加入待转化的外源DNA片段，外源DNA片段的工作浓度≥100ng/μl，混合静止培养后用抗生素平板筛选长出的菌落，获得转基因菌株。
2.根据权利要求1所述的微生物转基因方法，其特征在于将所述的微生物是沙雷氏菌 (S. plymuthica)。
3.根据权利要求1所述的微生物转基因方法，其特征在于将待转化的外源DNA片段 PCR扩增或其它方法调整到工作浓度为> IOOng/μ L·
全文摘要
一种快速获得转基因微生物的方法，涉及一种微生物转基因方法。具体是先将宿主微生物培养至对数期，离心沉淀，用新鲜LB培养基重悬至OD600＝0.5后，加入待转化的外源DNA片段，外源DNA片段的工作浓度≥100ng/μl，混合静止培养后用抗生素平板筛选长出的菌落，获得转基因菌株。本发明不用构建表达载体，方法简便，获得转基因菌株周期短。
文档编号C12N1/21GK101948873SQ20101025854
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者刘晓光, 曹军, 黄光 申请人:江苏大学