专利名称：一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法。
背景技术：
目前小菜蛾对阿维菌素类农药的抗性检测主要是通过传统的生测法一叶片药膜法进行取新鲜无污染的甘蓝叶片浸在系列浓度的阿维菌素类药液中10秒，以蒸馏水(含 0. 01% Triton-XlOO)作对照，室内晾干后接大小一致的3龄幼虫10至20头，每个浓度3 次重复。48小时后检查结果。然后用POLO或SAS软件处理数据，计算LC50值，根据LC50 值的比较来判断小菜蛾的抗性水平。但是，上述传统监测小菜蛾对阿维菌素类农药抗性方法存在明显的不足(1)需要大批量人工饲养试虫。传统的生物测定法要求被测试虫的龄期和大小一致，这就需要在田间采回活的试虫后在室内进行人工饲养，得到足量的标准试虫。(2)需要较长的测试时间。传统的生物测试时间需要两天以上；(3)传统的生测结果只是对被测昆虫群体耐药性的一个总体评判，并不能反应昆虫抗性个体出现的频率。为此，急需发明一种新型、快速的检测方法。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，包括步骤如下第一步，对小菜蛾样本进行单头基因组DNA的提取，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于预冷的勻浆器中，加入TE缓冲液勻浆，(2)加入细胞裂解液，混勻，转入离心管中，再加入蛋白酶K，放置，期间摇勻若干次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入氯仿，轻轻混勻，(4)加入沉淀液，室温放置，然后离心处理，(5)吸掉上清液，立即加入氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入RNA酶A， 混勻，放置，(6)加入预冷的无水乙醇，放置，然后离心处理，吸走乙醇，用乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥，用TE缓冲液溶解DNA，得到DNA模板，低温保存备用；第二步，对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增，步骤包括，(1)在PCR管中建立PCR反应体系PCR缓冲液，脱氧核糖核苷酸，上游引物，下游引物，DNA模板，DNA聚合酶，去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为预变性后，变性，退火，延伸，多次循环，最后延伸，然后低温保存样品；
第三步，对所述PCR扩增后的产物进行回收，步骤包括，(1)取所述PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶进行电泳，(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100 300毫克，置于微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100-300 μ L，55 60°C加热5 10分钟使胶完全溶化，每隔2-3分钟混勻一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混勻物转到回收柱中，于室温离心处理，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加结合缓冲液洗所述回收柱，于室温离心处理，除掉上清液，(6)加SWP缓冲液于所述回收柱中，离心处理，除掉上清液，(7)重复所述第三步中(5)、(6) 一次，(8)离心处理后除净上清液，加入DNA溶解液，离心处理，(9)琼脂糖电泳检测回收结果；第四步，将所述回收得到的DNA低温贮存然后进行测序，或将所述回收得到的DNA 立即进行测序；第五步，根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N-端是否出现突变位点， 即第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸；第六步，根据第五步中的测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别，如果出现所述第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸之中的任一突变位点，就说明所述小菜蛾样本对阿维菌素出现了抗性。还包括第七步，步骤包括，多次重复第一步至第六步，根据检测的所述小菜蛾样本的个数和其中出现了所述突变位点的样本的个数，计算出所述小菜蛾样本种群的抗性频率。还包括第八步，检测是否需要更换药剂种类对所述小菜蛾样本种群进行防治，步骤包括，根据计算出的所述小菜蛾样本种群的抗性频率，如果一个所述小菜蛾样本种群的抗性频率大于5 %，就应该更换药剂种类进行防治。所述小菜蛾样本是从田间采回的小菜蛾活虫，或者所述小菜蛾样本是从田间采回的小菜蛾经过酒精浸泡的标本。所述小菜蛾样本是小菜蛾幼虫。所述第三步中，对所述PCR扩增后的产物进行回收采用的是快速回收试剂盒；所述第四步中，将所述回收得到的DNA贮存于-20°C冰箱中然后进行测序或立即进行测序。所述第一步，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于_4°C预冷的勻浆器中，加入200μ L TE缓冲液勻浆，(2)加入200yL细胞裂解液，混勻，转入1.5mL离心管中，再加入3yL蛋白酶K， 55°C放置10分钟，期间摇勻3次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入300 μ L氯仿，轻轻混勻，(4)加入250 μ L沉淀液，室温放置2分钟，IOOOOrpm离心处理2分钟，(5)吸掉上清液，立即加入50μ L 1.2摩尔每升的氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入1 μ L RNA酶A，混勻，55°C放置10分钟，(6)加入150 μ L预冷的无水乙醇，-20°C放置1小时，IOOOOrpm离心处理10分钟，
吸走乙醇，用75 %的乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥10分钟，用25 μ L TE缓冲液溶解DNA，得到DNA模板，于_20°C保存备用；所述第二步，步骤包括，(1)在0. 25mL PCR管中建立总体积为25 μ L的PCR反应体系2. 5μ L 10 X PCR缓冲液，2 μ L的10毫摩尔每升浓度脱氧核糖核苷酸，1 μ L上游引物，1 μ L下游引物，1 μ L DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为94°C预变性5分钟后，94°C变性 45秒，52°C退火45秒，72°C延伸1分钟，共反应35个循环，最后72°C延伸10分钟，然后于 4°C保存样品。所述第三步，步骤包括，(1)取5 μ L所述PCR扩增后的产物用1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件80毫伏恒压，电泳40分钟，(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100 300毫克，置于1. 5mL 微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100-300 μ L，55 60°C加热5 10分钟使胶完全溶化，每隔2-3分钟混勻一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混勻物转到2mL的回收柱中，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300 μ L结合缓冲液洗所述回收柱，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(6)加700 μ L SffP缓冲液于所述回收柱中，10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(7)重复所述第三步中的(5)、(6) 一次，(8)离心处理后除净上清液，加入10 μ L DNA溶解液，10，OOOrpm离心处理1分钟，(9) 琼脂糖电泳检测回收结果，PCR扩增产物大小应为131bp。在所述第三步(8)之后，重复所述第三步( 至少一次后，再进行所述第三步(9)。本发明中所谓的TE缓冲液，是指10毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液+1毫摩尔的乙二胺四乙酸溶液。本发明中所谓的上游引物，是指10微摩尔浓度，脱氧核糖核苷酸序列为 TAAGGCCGAACTATGGAG ；所谓的下游引物，是指10微摩尔浓度，脱氧核糖核苷酸序列为 GGGGATCTGTCCAAAACT ；所谓的DNA聚合酶，是指5单位/ μ L。本发明中所谓的第78位的亮氨酸，核酸序列为TGT ；所谓的缬氨酸，核酸序列为 TCT ；所谓的第82位的赖氨酸，核酸序列为AAA ；所谓的亮氨酸，核酸序列为TCA。本发明所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，首先提取单头小菜蛾基因组DNA，用设计的引物进行特定基因片段的PCR扩增，PCR产物经过纯化回收后，进行 DNA直接测序。如果N-端出现任何一个突变位点第78位的亮氨酸(核酸序列为TGT)变成缬氨酸(核酸序列为TCT)或者第82位的赖氨酸(核酸序列为AAA)变成亮氨酸(核酸序列为TCA)，就说明该小菜蛾对阿维菌素出现了抗性，再根据抗性个体在所检测虫量的百分率，判断小菜蛾种群抗性的大小。如一次检测小菜蛾30头，其中有3头出现了突变位点，则这个小菜蛾种群的抗性频率为10% (3/30*100%)。如果一个种群的抗性频率大于5%，就应该考虑更换药剂种类进行防治。本发明中，在所述第三步(8)之后，重复所述第三步( 一次或多次后，再进行所述第三步(9)，可提高回收效率。本发明的有益效果如下1，本发明不需要大批量人工饲养试虫，节省劳动力和资源。2，本发明从田间采样直接测试，减少中间过程，可以是酒精浸泡标本，方便邮寄和储存。3，本发明所得抗性结果准确，且能反应昆虫抗性个体出现的频率。
具体实施例方式下面详细说明本发明优选的技术方案。一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，包括步骤如下第一步，首先从田间采回小菜蛾后(可以是酒精浸泡标本或活虫)，进行单头基因组DNA的提取，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于_4°C预冷的勻浆器中，加入200μ L TE缓冲液勻浆，(2)加入200 μ L细胞裂解液，混勻，转入1.5mL离心管中，再加入3yL蛋白酶K， 55°C放置10分钟，期间摇勻3次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入300 μ L氯仿，轻轻混勻，(4)加入250 μ L沉淀液，室温放置2分钟，IOOOOrpm离心处理2分钟，(5)吸掉上清液，立即加入50 μ L 1.2摩尔每升的氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入1 μ L RNA酶Α，混勻，55°C放置10分钟，(6)加入150 μ L预冷的无水乙醇，_20°C放置1小时，IOOOOrpm离心处理10分钟，
吸走乙醇，用75 %的乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥10分钟，用25 μ L TE缓冲液溶解DNA，得到DNA模板，于_20°C保存备用；第二步，对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增，步骤包括，(1)在0. 25mL PCR管中建立总体积为25μ L的PCR反应体系2. 5μ L 10XPCR缓冲液，2 μ L的10毫摩尔每升浓度脱氧核糖核苷酸，1 μ L上游引物，1 μ L下游引物，1 μ L DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为94°C预变性5分钟后，94°C变性 45秒，52°C退火45秒，72°C延伸1分钟，共反应35个循环，最后72°C延伸10分钟，然后于 4°C保存样品；第三步，采用快速回收试剂盒对所述PCR扩增后的产物进行回收，步骤包括，(1)取5 μ L所述PCR扩增后的产物用1. 0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件80毫伏恒压，电泳40分钟，
(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100 300毫克，置于1. 5mL 微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100-300 μ L，55 60°C加热5 10分钟使胶完全溶化，每隔2-3分钟混勻一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混勻物转到2mL的回收柱中，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300 μ L结合缓冲液洗所述回收柱，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液(6)加700 μ L SffP缓冲液于所述回收柱中，10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(7)重复所述第三步中(5)、(6) 一次，(8)离心处理后除净上清液，加入10 μ L DNA溶解液，10, OOOrpm离心处理1分钟，(9)重复所述第三步( 一次，可提高回收效率，(10) 琼脂糖电泳检测回收结果，PCR扩增产物大小应为131bp ；第四步，将所述回收得到的DNA立即进行测序；第五步，根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N-端是否出现突变位点， 即第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸；第六步，根据第五步中的测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别，如果出现所述第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸之中的任一突变位点，就说明所述小菜蛾样本对阿维菌素出现了抗性；第七步，多次重复第一步至第六步，根据检测的所述小菜蛾样本的个数和其中出现了所述突变位点的样本的个数，计算出所述小菜蛾样本种群的抗性频率；第八步，检测是否需要更换药剂种类对所述小菜蛾样本种群进行防治，根据计算出的所述小菜蛾样本种群的抗性频率，如果一个所述小菜蛾样本种群的抗性频率大于5%， 就应该更换药剂种类进行防治。如一次检测小菜蛾30头，其中有3头出现了突变位点，则这个小菜蛾种群的抗性频率为10% (3/30*100%)。如果一个种群的抗性频率大于5%，就应该考虑更换药剂种类进行防治。以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，包括步骤如下第一步，对小菜蛾样本进行单头基因组DNA的提取，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于预冷的勻浆器中，加入TE缓冲液勻浆，(2)加入细胞裂解液，混勻，转入离心管中，再加入蛋白酶K，放置，期间摇勻若干次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入氯仿，轻轻混勻，(4)加入沉淀液，室温放置，然后离心处理，(5)吸掉上清液，立即加入氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入RNA酶A，混勻， 放置，(6)加入预冷的无水乙醇，放置，然后离心处理，吸走乙醇，用乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥，用TE缓冲液溶解DNA，得到DNA模板，低温保存备用；第二步，对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增，步骤包括，(1)在PCR管中建立PCR反应体系PCR缓冲液，脱氧核糖核苷酸，上游引物，下游引物， DNA模板，DNA聚合酶，去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为预变性后，变性，退火，延伸，多次循环，最后延伸，然后低温保存样品；第三步，对所述PCR扩增后的产物进行回收，步骤包括，(1)取所述PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶进行电泳，(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100 300毫克，置于微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100-300μ L，55 60°C加热5 10分钟使胶完全溶化，每隔2-3分钟混勻一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混勻物转到回收柱中，于室温离心处理，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加结合缓冲液洗所述回收柱，于室温离心处理，除掉上清液，(6)加SWP缓冲液于所述回收柱中，离心处理，除掉上清液，(7)重复所述第三步中(5)、(6)一次，(8)离心处理后除净上清液，加入DNA溶解液，离心处理，(9)琼脂糖电泳检测回收结果；第四步，将所述回收得到的DNA低温贮存然后进行测序，或将所述回收得到的DNA立即进行测序；第五步，根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N-端是否出现突变位点，即第 78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸；第六步，根据第五步中的测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别，如果出现所述第78位的亮氨酸变成缬氨酸或者第82位的赖氨酸变成亮氨酸之中的任一突变位点，就说明所述小菜蛾样本对阿维菌素出现了抗性。
2.根据权利要求1所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于， 还包括第七步，步骤包括，多次重复第一步至第六步，根据检测的所述小菜蛾样本的个数和其中出现了所述突变位点的样本的个数，计算出所述小菜蛾样本种群的抗性频率。
3.根据权利要求2所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于， 还包括第八步，检测是否需要更换药剂种类对所述小菜蛾样本种群进行防治，步骤包括，根据计算出的所述小菜蛾样本种群的抗性频率，如果一个所述小菜蛾样本种群的抗性频率大于5 %，就应该更换药剂种类进行防治。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于所述小菜蛾样本是从田间采回的小菜蛾活虫，或者所述小菜蛾样本是从田间采回的小菜蛾经过酒精浸泡的标本。
5.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于所述小菜蛾样本是小菜蛾幼虫。
6.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，所述第三步中，对所述PCR扩增后的产物进行回收采用的是快速回收试剂盒；所述第四步中，将所述回收得到的DNA贮存于-20°C冰箱中然后进行测序或立即进行测序。
7.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，所述第一步，步骤包括，(1)将所述小菜蛾样本置于_4°C预冷的勻浆器中，加入200yLTE缓冲液勻浆，(2)加入200μ L细胞裂解液，混勻，转入1. 5mL离心管中，再加入3 μ L蛋白酶K，55°C 放置10分钟，期间摇勻3次，直到样品为半透明粘稠液体，(3)加入300μ L氯仿，轻轻混勻，(4)加入250μ L沉淀液，室温放置2分钟，IOOOOrpm离心处理2分钟，(5)吸掉上清液，立即加入50μ L 1.2摩尔每升的氯化钠溶液，轻轻振荡致沉淀完全溶解，加入1 μ L RNA酶Α，混勻，55°C放置10分钟，(6)加入150μ L预冷的无水乙醇，-20°C放置1小时，IOOOOrpm离心处理10分钟，吸走乙醇，用75%的乙醇洗一次，倒置于干净滤纸上，室温干燥10分钟，用25 μ L TE缓冲液溶解 DNA,得到DNA模板，于_20°C保存备用。
8.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，所述第二步，步骤包括，(1)在0.25mL PCR管中建立总体积为25 μ L的PCR反应体系2. 5 μ L 10XPCR缓冲液，2 μ L的10毫摩尔每升浓度脱氧核糖核苷酸，1 μ L上游引物，1 μ L下游引物，IyL DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去离子水，(2)将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为94°C预变性5分钟后，94°C变性45秒， 52°C退火45秒，72 °C延伸1分钟，共反应35个循环，最后72°C延伸10分钟，然后于4°C保存样品。
9.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于，所述第三步，步骤包括，(1)取5μL所述PCR扩增后的产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件80毫伏恒压，电泳40分钟，(2)紫外灯下迅速从所述琼脂糖凝胶上割下目的条带100 300毫克，置于1.5mL微离心管中，紫外灯下操作不要超过30秒，(3)往离心管中加入的结合缓冲液约100-300μ L，55 60°C加热5 10分钟使胶完全溶化，每隔2-3分钟混勻一次，(4)将所述第三步(3)中获得的混勻物转到2mL的回收柱中，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300μ L结合缓冲液洗所述回收柱，于室温10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(6)加700μ L SffP缓冲液于所述回收柱中，10，OOOrpm离心处理1分钟，除掉上清液，(7)重复所述第三步中的(5)、(6)—次，(8)离心处理后除净上清液，加入10μ L DNA溶解液，10，OOOrpm离心处理1分钟，(9)琼脂糖电泳检测回收结果，PCR扩增产物大小应为131bp。
10.根据权利要求1或2或3所述的检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，其特征在于在所述第三步(8)之后，重复所述第三步( 至少一次后，再进行所述第三步(9)。
全文摘要
一种检测小菜蛾对阿维菌素类农药抗药性的方法，包括步骤对小菜蛾样本进行单头基因组DNA的提取；对所述第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增；对所述PCR扩增后的产物进行回收；根据所述测序结果，检查所述回收得到的DNA的N-端是否出现突变位点，根据测序结果，对所述小菜蛾样本对阿维菌素类农药的抗性进行判别。本发明不需要大批量人工饲养试虫，节省劳动力和资源，所得抗性结果准确，且能反应昆虫抗性个体出现的频率。
文档编号C12Q1/68GK102382876SQ201010266309
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者史雪岩, 宋敦伦, 尚庆利, 梁沛, 高希武 申请人:宋敦伦, 梁沛, 高希武