专利名称：氧化微杆菌及其制备手性双三氟甲基苯乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种氧化微杆菌以及利用该菌制备光学纯(R) -1-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol 的方法。
背景技术：
光学活性(R)-l-[3, 5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (中文名称为(R)-1-3，5-双三氟甲基苯乙醇，CAS号为127852-28-2，以下简写为P)是Merck公司研发生产的手性药物Aprepitant (阿瑞批坦，商品名Emend)、fosapr印itant dimeglumine的关键手性中间体，其中fosapr印itantdimeglumine是Apr印itant的注射剂形式。手性药物Aprepitant属于人P物质/神经激肽1 (NK-I)选择性高亲和性受体阻断剂，具有全新的药理作用机制，主要通过阻断大脑恶心和呕吐信号的新颖机理发挥作用，用于预防放化疗引起的急性或延迟性呕吐等具有很好的疗效。分子结构式如下图所示
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(R)-1 -(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)ethanolAprepitant手性药物中间体P可通过生物催化法和化学合成法制备。目前已经发展了多种化学合成方法(如 Noyori R et al. ACC. Chem. Res. , 1997, 30,97-102 ；Hansen etal. Tetrahedron =Asymmetry, 2003，14，3581-3587)，但是这些方法往往存在一些不足，如对映体过量值不高，合成过程需要重金属催化剂和许多有毒、腐蚀性试剂，或者产率低分离提纯困难，因此较难应用到工业原料药生产中。化学合成方法中，Merck公司开发的以(S，R)-l-amino-2-indanol手性配体与[Ru (p-cymene) C12] 2作用生成上述手性中间体的工艺具有很高的产率和ee值，已被Merck公司申请专利而受到保护，从而垄断了该领域的医药市场。生物催化具有高选择性、反应条件温和、对环境友好等优势，作为化学催化过程的重要补充受到广泛关注。发展高效的生物催化方法生产上述中间体也是避开专利保护的重要途径之一。该中间体可通过消旋体醇或酯的动力学拆分和潜手性酮的不对称还原获得。其中，消旋体醇或酯的动力学拆分是利用酯酶或脂肪酶对外消旋仲醇进行对映选择性酯化或转酯化拆分，或者对外消旋酯进行对映选择性水解拆分(如Vankawala P J，etal. Synthetic Commun.，2007，37，3439_；3446)，这种方法的主要优点在于商品化的脂肪酶种类多，酶源广，容易筛选。但该方法目标对映体产物的最高收率不超过50%，而且需事先合成外消旋的底物醇和酯，对于工业化生产而言，既增加了操作步骤，也提高了生产成本。近年来，研究者开始筛选商品化的氧化还原酶或者表达这类酶的微生物全细胞催化 3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物 S)还原成(R)-I-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (产物P)。但由于绝大部分微生物所产生的氧化还原酶都遵守I^relog规则、催化酮生成(S)-构型醇，而遵守anti-Prelog规则生成相应的㈨-构型醇的较少，因此目前该生物催化过程相关报道也较少。该生物催化过程中，商品化纯酶具有高活力，高对映体选择性(> 99% ee)，反应体系较为简单，副产物少，产物易分离纯化，已可以实现辅酶原位再生等优点(Pollard D，et al. Tetrahedron =Asymmetry,2006,17，5M-559)，但酶的稳定性和使用寿命有限，商品化酶本身价格昂贵，还需要添加较为昂贵的辅酶循环底物(NAD+或NADP+)，从而导致最终产品价格较高，后续工艺改造空间也较小。同时购买商品化酶用于商业化生产还涉及知识产权问题，对于想研发自主知识产权的新工艺必将会有局限。与之不同，全细胞催化具有酶稳定性较高、操作简单、成本低廉，并且能够利用自身的辅酶和辅酶再生体系催化反应等优点，使之易于规模化和工业化。然而，目前利用全细胞生物催化获得该手性醇存在一些问题如生产能力较低，且微生物体内往往含有多种酮还原酶，导致最终酶选择性较低、副产物较多(Homarm筛选的4株产物R-型微生物，ee 值最高 92%。Homann M J, et al. Tetrahedron，2004，60，789-797)。Gelo-Pujic等(Gelo-Pujic M, et al. Tetrahedron :Asymmetry,2006，17,2000-2005)通过筛选乙醇脱氢酶转化底物S，得到来源于Lactobacillus kefir的乙醇脱氢酶可以得到P (ee > 99% )，但需要添加NAD (P)H用于辅酶循环且产率仅有15%。以该菌原始菌株作全细胞生物转化，底物浓度为4. 8g/L时，16h也仅能转化 31%。Kurbanoglu 等(Kurbanoglu et al. Tetrahedron =Asymmetry, 2009, 20,2759-2763)报道了以Penicilliumexpansum全细胞转化底物S，经5 转化终产物浓度也仅有3. 35g/L，转化率仅为76%，离实际应用还有很大的距离。因此，筛选新型高效微生物酶源是发展底物S转化生成产物P的生物催化过程的重要突破口之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种新筛选的氧化微杆菌，该菌株是从果园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得的，于2010年7月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCM 2010179，并利用该菌具有生产高活力、对映选择性强的羰基还原酶特性，还原底物 3，5-bis-trifluoromethyl acetophenone (底物 S)制备光学纯(R)_l_[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (产物P)，从而以生物催化的方法制备高光学纯度的手性药物阿瑞吡坦的中间体P。本发明所采取的技术方案氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans C3, CCTCC M 2010179)。筛选方法于果园采集土样，以苯乙酮为唯一碳源并添加无机盐经2轮富集样品，涂布于平板上，经分离单菌落初步筛选产羰基还原酶菌株；再将这些菌株转接于含有营养较为丰富的培养基的M孔板中，培养Mh，而后加入底物S进行生物转化，转化3 后，测定产物生成情况和产物对映体过量值，筛选得到可转化底物S生成目的产物P的菌株；并将产物对映体过量值高的菌株进行进一步的鉴定和转化条件优化。经筛选得到本发明涉及的氧化微杆菌C3。具体方案见实施例1和2。采用上述氧化微杆菌作催化剂制备光学纯P的方法包括下列步骤
1、菌株培养培养基配方为葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，牛肉膏1. 5g/L，酵母粉4g/L，NaCl1. 2g/L, K2HPO4O. 6g/L, KH2PO4O. 4g/L, MgSO4O. 6g/L。培养方法挑取少许斜面种子接种于上述组分培养基中，30°C，200 250rpm培养16 Mh，制备种子液。将此种子液以0. 5% 2%的接种量转接至上述相同组分培养基中，扩大培养，培养条件27 33°C，200 ^Orpm，24 48h。2、生长细胞转化经上述培养过程，可以获得的菌体浓度以湿重计为5 7g/L。在上述菌体培养体系中加入底物S，并加入辅酶循环底物。本发明的辅酶底物为体积百分比浓度为4% 20%的异丙醇和质量分数为2% 6%的葡萄糖。继续培养菌体并同时进行生物转化，时间M 88h。培养条件27 33°C，200 ^Orpm，培养的温度、转速可以与第1步的菌体生长阶段相同，也可以不同。底物S直接加入转化体系中或者先以助溶剂溶解后，配成质量浓度为30 % 60 %的母液后再加入到反应体系，助溶剂为二甲亚砜或者二甲基甲酰胺或者异丙醇中的一种或一种以上的混合物。加入到转化体系中的底物终浓度为1 30g/L。3、休止细胞转化将第1步培养的菌体以10，OOOrpm离心收集，用pH值为6 8、0. IM浓度的磷酸钾缓冲溶液或者磷酸钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液洗涤2次，而后以上述缓冲液配制成以菌体湿重计为50 300g/L浓度的菌悬液，加入底物和辅酶循环底物(方法同第2步)。加入到转化体系中的底物终浓度为1 30g/L，转化温度为20 40°C，转速为200 280rpm，转化时间为5 48h。4、产物萃取和测定向第2和第3步的转化结束体系中加入1 3倍体积的乙酸乙酯萃取，用普通气相色谱柱(SGE，澳大利亚，AC-5,30mX0. 22)测定转化率，手性气相柱(CHIRASIL-DEX CB,瓦里安，25mX0. 25)测定产物对映体过量值。本发明采用筛选的氧化微杆菌作为催化剂对底物S进行对映选择性不对称还原反应制备得到高光学纯度的手性药物阿瑞吡坦的中间体P，此方法为该手性中间体生物催化合成提供了新的可供选择的路径。同时，该生物催化过程利用微生物全细胞自身的酶系，添加廉价的辅酶循环底物即可实现辅酶循环。该生物催化剂易于制备，反应条件温和，副产物少，成本低，且可获得的产物浓度较高，易于提取分离，具有潜在的工业应用开发价值。
具体实施例方式实施例1菌株筛选产羰基还原酶菌株筛选于果园采集土壤样品，富集于含有苯乙酮(浓度为ImM)的MSM培养基中，30°C，220rpm培养7天。从富集液中取出加入到含有苯乙酮(浓度为ImM)的MSM培养基中进行再次富集，30°C，220rpm继续培养7天。MSM培养基配方为Na2HP042g/L，KH2P041g/L，NH4C1 0. 4g/L，MgC120. 4g/L。将第二次富集培养液稀释至合适浓度，并涂布至筛选平板上(MSM+苯乙酮ImM+酵母粉0. lg/L+琼脂粉15g/L)，30°C培养1 3天，每支平板上可见许多微生物单菌落，这些菌株可能为产羰基还原酶菌株。进一步进行底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物幻生物催化筛选，以期获得高对映选择性转化该底物的微生物菌株。以底物S进行生物催化筛选将富集平板中的单菌落用无菌牙签逐一接入M孔筛选板各孔(Costar，美国)进行培养(每孔装有培养基lml)，3(TC，240rpm培养Mh。培养基配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉1.5g/L，NaCl 5g/L。6000rpm离心收集菌体，用磷酸钾缓冲液(pH 7.0,0. 1M)洗涤2次，再加入Iml缓冲液重悬菌体，而后加入底物5mg，3(TC，270rpm进行生物催化筛选试验。转化3 后，以200 μ 1乙酸乙酯萃取。以气相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安，25mX 0. 25)分析产物的对映体过量值，得到产00-仲醇菌株8株。其中1株为本发明涉及的氧化微杆菌菌株C3，产物对映体过量值大于99%。实施例2筛选菌株的鉴定为确定该菌株分类地位并详细了解其性能，对该菌株进行了初步鉴定。该菌株具有以下特征菌落浅黄色或黄色菌落，表面光滑，边缘整齐，不透明。生理生化特征革兰氏阳性细菌，杆状，好氧，产羰基还原酶。16S rRNA鉴定基因组DNA为模板，以细菌通用引物27f和1492r扩增16S rRNA序列。其序列如下(1486bp)AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAACACGGAGCTTGCTCTGTGGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATATGCGACGTGATCGCATGGTCTGCGTCTGGAAAGAATTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGGCATGCGGATTAATTCGATGTAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGTAATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCC经NCBI的blast比对，该菌与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)同源性为99%。结合菌落和生理生化特征，初步可确定为氧化微杆菌，实验室自编号为Microbacterium oxydansC3。2010年7月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2010179。实施例3 5CCTCC M 2010179生长细胞转化底物S生成产物P。实施例3培养基配方和种子液制备方法如前所述。将种子液以的接种量转接至50ml培养基中O50ml培养摇瓶装液50ml)。培养条件30°C，240rpm，Mh。此时菌体浓度以湿菌体计约为5 7g/L(每批次培养菌生长状况会略有差异)。加入底物S (底物S溶解于DMS0，预先配置成50%的母液)至培养体系中，终浓度为lg/L，并加入异丙醇2. 5ml (5% )和葡萄糖IgO ，再次置于摇床上转化(30°C，220rpm)48h。以IOOml乙酸乙酯萃取，取有机相气相色谱(SGE，澳大利亚，AC_5，30mX 0. 22)测定转化率为94%，气相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安25mX0. 25)测定产物ee值大于 99%。
权利要求
1.氧化微杆菌Microbacterium oxydans C3，保藏号为 CCTCC M 2010179。
2.以权利要求1所述氧化微杆菌制备光学纯(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征在于27 33 °C培养氧化微杆菌C3M 48h，加入底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone进行生长细胞转化；或者收集该培养菌，重悬于缓冲液中，再加入底物进行休止细胞转化，生成目的产物光学纯(R)-l_[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。
3.权利要求2所述的氧化微杆菌制备光学纯(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol 白勺方法，其特征是所述底物 3，5_bis_trifluoromethyl acetophenone ^t反应体系中的终浓度为1 30g/L，底物直接加入转化体系中，或者先以助溶剂溶解后，配成质量浓度为30 % 60 %的母液后再加入到反应体系，助溶剂为二甲亚砜或/和二甲基甲酰胺或/和异丙醇。
4.权利要求2所述的氧化微杆菌制备光学纯(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法，其特征是生长细胞转化时细胞浓度以菌体湿重计是5 7g/L，转化温度为27 33°C，转速200 ^Orpm，转化时间为M 88h。
5.权利要求2所述的氧化微杆菌制备光学纯(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是休止细胞转化时细胞浓度以菌体湿重计是50 300g/L,转化温度为20 40°C，转速200 280rpm，转化时间为5 48h，缓冲液为pH值为6 8且浓度为0. IM的磷酸钾缓冲溶液或者磷酸钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
6.权利要求2 5所述的氧化微杆菌制备光学纯(R)-I-[3，5-bis(trif luoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是转化体系中加入体积百分比浓度为4% 20%的异丙醇和质量分数为2% 6%的葡萄糖以提高反应效率。
全文摘要
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种氧化微杆菌以及利用该菌制备光学纯(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法。本发明氧化微杆菌MicrobacteriumoxydansC3，保藏号为CCTCC M2010179。本发明氧化微杆菌在27~33°C培养24~48h，加入底物3,5-bis-trifluoromethylacetophenone进行生长细胞转化；或者收集该培养菌，重悬于缓冲液中，再加入底物进行休止细胞转化，生成目的产物光学纯(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。本发明易于工业化，其催化剂易于制备、反应条件温和、转化效率高。
文档编号C12P41/00GK102382780SQ201010271579
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者刘艳, 吴中柳, 张超, 汤传根, 田小亮, 裴小琼 申请人:中国科学院成都生物研究所