专利名称：一种规模化分离水稻未成熟胚的方法
一种规模化分离水稻未成熟胚的方法技术领域生物技术领域
背景技术：
1，随着水稻功能基因组学研究的进一步深入，越来越多的水稻基因被分离出来， 绝大多数需要通过水稻遗传转化获得转基因植株来验证基因的相关功能。近年来，国家转 基因重大专项项目的逐步实施，进一步增加了水稻遗传转化操作的工作量。水稻遗传转化 过程中需要大量的受体组织，优质受体的数量往往成为扩大水稻转基因规模的限制因素。2，水稻遗传转化是植物生物技术领域的关键技术，目前水稻遗传转化主要采用农 杆菌感染法和基因枪法，受体组织常采用水稻未成熟胚(幼胚)和成熟胚。幼胚材料具有 胚性好，转化效率高的特点，在水稻的遗传转化中得到广泛的应用。如何快速获得大量的优 质受体组织是一个关键的技术。多数生物技术工作者获得水稻未成熟胚采用的方法是先 手工剥去水稻未成熟种子的外壳，经过消毒处理后，再用金属解剖针挑取的方法。该方法通 过剥除水稻未成熟胚的外壳，有效降低了水稻未成熟胚遭受细菌污染的概率，可以获得高 质量的水稻未成熟胚供研究者使用。但该方法存在操作效率低的问题，难以在短时间内获 得大量的高质量未成熟胚，无法满足目前水稻规模化转基因对大量的高质量水稻未成熟胚 的需求问题。3，本发明以低成本的简单操作为基础，在配套以有效的快速选样和高效的消毒措 施，解决了水稻未成熟胚遭受细菌污染问题的基础上，选用镊子和金属刮牙器为主要操作 工具，省略了手工剥除水稻未成熟种子外壳的操作步骤。本发明大大提高了水稻未成熟胚 的获得效率，使生物技术工作者能够在短时间内获得大量的低污染、高质量的水稻未成熟 胚，可以满足水稻规模化转基因以及生理学研究对水稻未成熟胚的大量需求。本发明具体 涉及水稻未成熟种子的田间取样标准、实验室脱粒选样方法、高效的灭菌消毒、幼胚快速挤 取和实验室培养等一整套的具体操作过程。发明内容通过有效的选样和消毒措施，解决污染问题，简化实验操作，通过省略 手工剥除水稻未成熟种子外壳的操作步骤，以及选用合适的未成熟胚挤取工具，大大提高 了水稻未成熟胚的获得效率。 建立未成熟种子的田间取样标准，提高未成熟胚质量，并降低污染率。 应用简便的脱粒选样方法，快速获得高质量的水稻未成熟种子。 利用高效的种子消毒程序，降低未成熟种子表面的微生物污染。 利用金属刮牙器的特殊构造，进行未成熟种子的快速挤压和未成熟胚的快速挑 取。
具体实施例方式一、水稻未成熟种子的田间取样1，取样时间以晴天的下午取样为佳。下雨天或早上又露水时，田间湿度过大，这时 取的材料容易遭受细菌污染。
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2，选取抽穗后12-15天的穗子。具体操作中，用手指挤压未成熟种子，以胚能够被 快速挤出，而无液状胚乳流出的未成熟种子为理想材料。这样的材料既容易挤取未成熟胚， 又能降低污染率。将符合条件的穗子整穗取回即可。二、水稻未成熟种子的实验室脱粒选样1，用培养皿皿底刮穗子的方法快速脱粒。具体操作为一手抓住穗子基部，将穗子 置于托盘上，用培养皿皿底的边缘自穗子基部往穗子顶部用力刮，未成熟种子即可脱下。2，脱粒后的未成熟种子用水浮法选样。具体操作为将脱粒后的材料置于烧杯中， 灌上自来水，用手搅拌，将浮在水面的空瘪粒丢弃，沉在水底的材料即为理想的水稻未成熟 种子。三、水稻未成熟种子的灭菌消毒1，将完成选样的未成熟种子分装于200ml的有盖广口玻璃瓶中，先用70%酒精消 毒1分钟，再换成180ml的2%次氯酸钠溶液，另加1滴表面活性剂吐温20，附加抽真空消 毒处理30分钟，将玻璃瓶倒置后，再次抽真空消毒处理30分钟。2，完成消毒后，用无菌水反复清洗3次，此步骤必须在超净工作台上操作。四、水稻未成熟胚的快速挤取1，在超净工作台上，用消毒后的金属勺子取少量完成消毒的未成熟种子，置于经 过高压灭菌消毒并烘干的多层滤纸上。此步骤有利于吸干未成熟种子表面的水分，方便操 作并减少污染。取下一批未成熟种子时，必须换滤纸，金属勺子也必须火烧消毒。2，在滤纸上，用左手拿镊子夹住未成熟种子，右手拿金属刮牙器。用金属刮牙器的 弓背部位挤压未成熟种子的胚部，这时水稻未成熟胚就会被挤出，用金属刮牙器的针尖部 位挑取未成熟胚，盾片朝上置于培养基上培养。3，未成熟胚比较小，在培养皿下放一黑色纸张，有利于分辨未成熟胚的盾片部位。 为降低污染概率，每操作5-10个未成熟种子，就将金属刮牙器火烧消毒。金属刮牙器的针 尖部位除了挑取未成熟胚之外，切忌触碰未成熟种子的外壳等部位。未成熟种子的外壳是 很容易藏菌的部位，虽然消毒相对彻底，其外壳还是可能有极少量的菌造成污染。金属刮牙 器的优点，正是其弓背部位是挤压未成熟种子的理想器械，同时又能保持针尖部位的无菌 状态。五、水稻未成熟胚的实验室培养1，在含有NB培养基的9cm玻璃培养皿中，每皿可以放置30_50粒水稻未成熟胚。2，获得的未成熟胚可以直接用于水稻转基因操作和生理学研究，也可以在26°C黑 暗条件下培养，等诱导出未成熟胚愈伤组织后，再用于水稻转基因操作和生理学研究。
权利要求
一种规模化获取水稻未成熟胚的方法，其特征是以低成本的简单操作为基础，在配套以有效的快速选样和高效的消毒措施，解决水稻未成熟胚遭受细菌污染问题的基础上，利用金属刮牙器的特殊构造，进行未成熟种子的快速挤压和未成熟胚的快速挑取，以快速获得大量的高质量水稻未成熟胚。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的未成熟种子指的是水稻成熟收割前的种子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是利用未成熟种子在水中沉浮的方法选样。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征是水稻未成熟种子未经脱壳处理。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是利用金属刮牙器的特殊构造，进行未成熟种子 的快速挤压和未成熟胚的快速挑取。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的未成熟胚应用于水稻组织培养、转基因 和生理学研究。
全文摘要
本发明要解决如何快速获取大量的高质量水稻未成熟胚，以满足水稻规模化转基因研究和生理学研究对水稻受体组织的大量需求问题。本发明以低成本的简单操作为基础，在配套以有效的快速选样和高效的消毒措施，解决水稻未成熟胚遭受细菌污染问题的基础上，利用金属刮牙器的特殊构造，成功选用镊子和金属刮牙器为主要操作工具，进行未成熟种子的快速挤压和未成熟胚的快速挑取，以快速获得大量的高质量水稻未成熟胚。本发明省略了手工剥除水稻未成熟种子外壳的操作步骤，使操作达到快速、低污染、高质量的要求。实践表明，按照该发明操作，每人每小时可以获取水稻未成熟胚300个以上，获得的未成熟胚胚性好，污染率低，可以满足需求。
文档编号C12N5/04GK101942412SQ201010275779
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者付亚萍, 刘文真, 孙宗修, 斯华敏, 胡国成 申请人:中国水稻研究所