水稻条纹病毒rna干涉载体、构建方法及应用的制作方法

文档序号:585779阅读:337来源:国知局
专利名称:水稻条纹病毒rna干涉载体、构建方法及应用的制作方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,特别是涉及一种适合单子叶植物遗传转化、的水 稻条纹病毒RNA干涉载体、构建方法及其在水稻上应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,在我国水稻占粮食生产和消费的40%,其 在粮食安全和国民经济中占有举足轻重的作用。由水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起水稻条纹叶枯病是我国粳稻种植区最重要的水稻病毒病害。流行年份,一般田块 减产20 % 30 %,严重田块达到80 %以上,甚至颗粒无收。该病在江苏、安徽、河南和山东 等地,曾于2001、2004、2005、2006、2007年连续爆发成灾。2004年在江苏、河南等病田率达 75%以上,部分病重田的病穴率达90%以上;2005年,仅江苏省发病面积就达2800万亩,给 当地水稻生产造成巨大损失。2006 2009年华北和东北稻区也呈现扩大趋势,据农业部 有关部门估计2008年发病面积可达2800 3000万亩,2009年发病面积可达与2008年持 平,2010年仍将为偏重发生年份(www. agri. gov. cn)。流行学研究结果表明该病害暴发、流行的主要原因是品种抗性的丧失和有效传 毒介体种群数量的上升。由于抗病品种在品质上的不足,导致感病品种的大面积种植,加之 灰飞虱传毒的瞬时性和持久性、病毒病防治药剂缺乏,使得防虫治病十分困难,农药的使用 也存在许多弊病,因此最为经济有效的途径是利用品种自身的抗性达到主动防治病毒病害 目的。然而传统的育种方法由于缺乏理想的抗源,抗病基因又多与劣质基因相伴随,获得抗 病、高产优质的双重特性品种的难度很大。RNA干涉(RNA interference,RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象,它 是指通过双链RNA的介导的特异性的降解对应序列的mRNA,从而特异性地抑制相应基因 的表达,是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制。本实验室对RSV田间分离物外壳蛋 白(CP)的研究表明,我国北方粳稻产区所发生的RSV CP基因非常保守,同源性达96. 7 100%,有利于siRNA的识别。本发明以近年在我国北方地区严重发生的水稻条纹病毒 (RSV)为对象,利用植物转基因工程技术将RSV CP基因部分片段导入水稻,通过其特异地 干扰、降解或沉默RSV病毒基因在水稻植株内的正常复制、积累和传播,筛选获得抗RSV的 水稻品系,为进一步结合常规育种工作,改良现有的优质高产但不抗病的水稻品种,以便实 现利用转基因技术获得免疫或高抗RSV的水稻新品系的目的。

发明内容
基于上述目的,本发明提供了可用于农杆菌和基因枪遗传转化单子叶植物的2种 含有水稻条纹病毒(RSV)基因的RNA干涉(RNAi)载体,这些载体分别包含致病病毒RSV的 CP基因部分核苷酸序列(RSV-HCP)。本发明还提供这些干涉病毒基因表达载体的构建方法及应用,为植物抗病育种工 程提供了 一种新的策略和思路。
水稻条纹病毒RNA干涉载体,包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构,其特征 在于以RSV-CP基因部分片段为正、反义链,所述RSV-CP基因部分片段序列如SEQ ID N03。所述骨架载体为pMCG161载体。所述正义链插入在酶切位点AscI和AvrII间,反义链插入在酶切位点SpeI和 SacI之间,命名为PMCG161+/-R,其结构如图6A所示。所述骨架载体为去掉潮霉素抗性基因的PCMBIA1301载体。所述发夹结构为干涉载体pMCG161+/-R经BamHI、HindIII酶切得到的,命名为 PCMBIA1301+/-R,其结构如图6B所示。pMCG161+/-R干涉载体的构建方法,步骤如下(1)得到如序列SEQ ID N03所示的RSV-CP基因部分片段;(2)将步骤(1)的基因 部分片断经AscI、AvrII双酶切后,与同样经AscI、AvrII酶切的载体pMCG161连接,得到 插入正向目的片段的重组质粒PMCG161+R ;再将步骤(1)的基因部分片断经SpeI、SacI双 酶切,与经SpeI、SaCI酶切的载体pMCG161+R连接,即可得到插入正反义链的RNA干涉载体 PMCG161+/-R。所述步骤(1)采用如下方式以感染水稻条纹病毒RSV水稻总RNA为模板,以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列为引物对,经RT-PCR扩增得到,SEQ ID NOl :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3,SEQ ID N02 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3’。PCMBIA1301+/-R干涉载体的构建方法,步骤如下(1)用限制性内切酶Xho I酶切 PCMBIA1301载体,得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体,即pCMBIA1301_hpt- ; (2) 将pMCG161+/-R用BamHI、HindIII酶切,得到的发夹结构连入pCMBIA1301_hpf,得到无标 记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-R。所述干涉载体在转基因植物中的应用。所述应用为将上述干涉载体转化有关受体植物,使之对水稻条纹病毒产生抗性。所述干涉载体为PMCG161+/-R,所述转化的方法为基因枪法。所述干涉载体为PCMBIA1301+/-R,所述转化的方法为农杆菌介导法。所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。所述受体植物为禾本科植物。所述禾本科植物为水稻。所述水稻品种为爱知旭(Oryzasativa cv. Aichiasahi)或皖粳97 (Wanjing 97)。本发明采用感染RSV病毒水稻总RNA为模板,根据非常保守的RSV-CP基因设计了 引物SEQ ID NOl和SEQ ID N02,RT-PCR扩增得到RSV-CP基因部分片段即RSV-HCP,将其 作为正义链和反义链插入骨架载体中得到本发明的干涉载体。将本发明的干涉载体转入受 体植物中,将使RSV病毒发生沉默而不表达,从而使该受体植物产生RSV抗性。RNA干涉载体pMCG161+/-R,适合于基因枪转化单子叶植物,可获得抗RSV的转基 因后代,该载体携带有氯霉素抗性基因和除草剂筛选标记基因。采用的骨架载体是双向表 达载体PMCG161 JfRSV-HCP的正义链插入在酶切位点AscI和AvrII间,将负义链插入在酶 切位点SpeI和SacI之间,通过载体上的intro (rice ffaxy-a intron 1)形成发夹结构,这 样可用于基因枪转化单子叶植物。
本发明将用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体,得到去除潮霉素标记 基因的 PCMBIA1301 载体,即 pCMBIA1301_hpt、然后将 pMCG161+/-R 干涉载体用 BamHI、 HindIII酶切,得到的发夹结构连入pCMBIA1301 -hpt_,得到无标记基因的RNA干涉载体 PCMBIA1301+/-R。由于该干涉载体不仅适合于超毒力菌株,且不含有抗生素基因,有利于将 来转基因植物的安全释放。最终构建的RSV无标记基因RNA干涉载体pCMBIA1301+/-R不携带抗生素或除草 剂抗性基因,适合农杆菌介导的单子叶植物遗传转化,可获得抗RSV的转基因后代;与携带 潮霉素和卡那霉素抗性的抗性基因的PCMBIA1301的空白载体经农杆菌EHA105介导进行单 子叶植物的遗传转化对比,这样即可方便抗性愈伤组织的筛选,又可通过后代分离,方便得 到无标记基因的转基因再生植株,减少转基因植物带来的生物安全性隐患。根瘤农杆菌介导的植物遗传转化方法是目前应用最为广泛的转化方法之一,已成 功的应用于单、双子叶植物的转基因研究中。本发明最终构建的干涉载体PCMBIA1301+/-R 适合超毒力菌株EHA105等农杆菌介导的植物遗传转化。利用根瘤农杆菌EHA105将其导入 水稻,所得到的转基因植株可以使入侵的致病病毒发生RNA沉默现象,使病毒不能繁殖或 积累,从而使植物具备对病毒的抗病性。本发明利用根癌农杆菌介导的转化的方法进行水稻的遗传转化,借助水稻细胞 RdRp的转录作用,产生RSV部分CP基因,再由DicerIII的作用产生SiRNA,当水稻受RSV侵 染时,就可产生SiRNA,从而达到利用RNA干扰介导对RSV抗性,最终筛选出免疫或高抗RSV 的转基因水稻植株。本发明已得到以水稻模式品种爱知旭为受体的水稻TO代再生植株,转化RSV单价 载体PCMBIA1301+/-R的植株是173株,在RSV重发区河南郑州经田间抗病性筛选。其中15 株未表现症状(0级),41株表现轻微症状(I级),78株表现中等症状(II级),39株严重症 状(III)。经PCR检测,未表现症状的15株中12株扩增到目的基因,表现轻微症状的41株 中有17株有阳性条带,同时受体爱知旭发病严重,全部为II或III级,发病株率为100%, 这说明转基因水稻植株较受体有明显的抗病性。本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与 应用,为转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入 水稻中,成功获得了抗病毒植株,实现了利用RNA干扰原理获得抗RSV水稻新材料的预期目 标,为RNA干扰介导的植物抗病育种及基因工程提供了成功的实例,弥补了 RNA干扰介导的 RSV抗性在本领域研究中的空缺。利用本发明的干扰载体转化所得的抗性生物体可以是任何微生物、植物或其组 织、细胞,以及由此所获得具有任何抗病活性的微生物、植物,以及该类植物后代的种子、杂 交和转育后代。本发明转化单子叶植物的RNA干涉载体的构建方法,包括如下步骤1)RSV特异性核苷酸序列的获得以感染水稻条纹病毒(RSV)水稻总RNA为模板,以SEQ ID NO. 1 (上游引物)和 SEQ ID NO. 2 (下游引物)为引物对,经RT-PCR扩增RSV-HCP,得到PCR产物I,目的片段约 为250bp。回收PCR产物,与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α (购自北京全式金公 司)得到阳性质粒PMD18-T-HCP,进行序列验证,如SEQ ID Ν03所示。测序正确的目的片段即可用于RNA干涉载体的构建。所述SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列如下SpeI AscISEQ ID NOl :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3,SacI AvrIISEQ ID N02 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3’2)病毒RNA干涉载体(中间载体)的构建将上述PCR产物经Asc I.Avr II双酶切后,与同样经Asc I.Avr II酶切的载体 PMCG161连接,得到插入正向目的片段的重组质粒-pMCG161+R。同样将上述PCR产物经Spe I、SacI双酶切,与经Spe I.Sac I酶切的载体pMCG161+R连接,即可得到插入正、反义链的 RNA干涉载体pMCG161+/-R,经PCR扩增检测、核苷酸序列分析,目的片段序列正确的干涉载 体可用于基因枪转化单子叶植物,获得单抗RSV的转基因植株。这些干涉载体携带有氯霉 素抗性基因和除草剂筛选标记基因。由于pMCG161载体带有氯霉素抗性基因,而农杆菌EHA105抗氯霉素,因此上述 构建的适合基因枪转化水稻的干涉载体不能直接用于农杆菌介导的水稻遗传转化。而 PCAMBIA1301载体是农杆菌法转化水稻的常用载体,具有潮霉素抗性和卡那霉素抗性。3)无标记基因载体pCMBIA1301_hpt_的获得用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体,经电泳检测、回收、纯化大片段后, 再经T4DNA连接酶16°C连接过夜,即可得到去除潮霉素标记基因的PCMBIA1301载体,即 pCMBIA1301-hpt_。4)无标记载体基因病毒RNA干涉载体的构建将中间载体pMCG161+/-R 和 pCMBIA1301_hpt_ 用 BamHI、HindIII 酶切,回 收大片段,在T4DNA连接酶作用下(16°C连接过夜),将中间载体上的发夹结构连入 pCMBIA1301-hpt",得到无标记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-R。经PCR检测、序列分 析正确的干涉载体即可用于农杆菌介导的单子叶植物遗传转化,获得不含有标记基因的单 抗RSV的转基因再生植株。


图1. RSV的部分外壳蛋白基因部分片段(HCP)的RT-PCR扩增产物;泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株,3-5. RSV分离物图2.连入病毒正义链重组质粒PMCG161+R的PCR鉴定结果图3.连入正、负义链重组质粒PMCG161+/-R的鉴定结果图4.无标记基因载体pCMBIA1301_hpt_的PCR检测结果泳道1. DL2000,2.空白对照,3-15. pCMBIA1301_hpt-图5.重组质粒pCMBIA1301+/-R的PCR鉴定结果泳道l.DL2000,2.空白对照,3.空白质粒pCMBIA1301,4_ll.重组质粒图6A. pMCG161+/-R干涉载体图谱图 6B. pCMBIA1301+/-R 干涉载体图谱图7. RSV-HCP重组农杆菌的PCR鉴定结果泳道1. DL2000,2.空白对照,3. DH5 α ,4-10.重组质粒
图8.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养图9.水稻成熟胚愈伤组织的继代培养图10.愈伤组织与农杆菌的共培养图11.抗性愈伤组织的筛选图12.抗性愈伤组织的分化图13分化小苗的壮苗培养图14. TO转基因水稻幼苗图15. TO代转基因再生植株的PCR鉴定泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株,3-12.转基因TO代植株图16T0代转基因爱知旭植株和对照在大田的抗病性表现A.转基因植株,B.非转基因植株
具体实施例方式实验中所用的pMD18-T购自大连宝生物公司(Takara公司),感受态细胞DH 5 α 购自北京全式金公司。实验中使用的载体PMCG161保存在中国农业科学院植物保护研究所植物病毒实 验室(可向公众免费发放),是专门适用于禾本科植物转化的RNA干扰载体,它含有来源于 水稻的Ricewaxy-a intron 1,位于5442bp_6576bp,在它的上游含有AscI和AvrII两个酶 切位点,用来连接目的基因的正向片段,在它的下游含有SpeI和SacI位点,可用来连接目 的基因的反向片段,最终获得双链发夹结构。载体pCMBIA1301是农杆菌介导法转化水稻的常用载体(该载体保存在中国农业 科学院植物保护研究所病毒组实验室内,可向公众免费发放),具有潮霉素抗性和卡那霉素 抗性。经本实验室改造的pCMBIA1301_hpt_也可向公众发放,通过单酶切位点BamHI和 HindIII可以将中间载体pMCG161+/-R上的目的基因的发夹结构插入其中,获得无标记基 因,且适合农杆菌介导的单子叶植物遗传的RNA干涉载体。实施例1、适合农杆菌介导转化的水稻条纹病毒RNA干扰载体的构建步骤1、设计RSV全长CP基因的特异性引物根据已报道的RSV CP基因序列(魏太云,2003)设计了下述引物RSV CPl :5’ -AGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC-3,RSV CP2 :5’ -AGTAGAATGGGTACCAACAAGCCA-3’以采集自江苏南京的感染水稻条纹叶枯病水稻标样(叶片)总RNA为模板,以 RSVCPl ((上游引物))和RSV CP2 (下游引物)为引物对,经RT-PCR扩增分别得到约IOOObp 的特异性条带,回收PCR产物、并与pMD18-T载体连接,得到重组质粒pMD18-T-CP,经PCR、 EcoR I酶切鉴定,以及转化大肠杆菌DH5 α得到阳性克隆,序列分析结果表明,济宁RSV 分离物的CP基因全长969bp,与已报道的我国几个分离物(GeneBank登录号DQ299167、 DQ299168、AJ781027 和 AJ781028)及日本 T 分离物(GenBank 登录号为 NC-003776)CP 基因 核苷酸序列一致性约在96. 8% 98. 9%,说明本发明所得到的RSV CP基因序列正确。步骤2、设计RSV CP基因部分片段的RNA干涉引物
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根据pMCG161载体上存在多克隆位点分析,利用AscI和AvrII可以将目的基因的 正向片段连接到载体;而利用Spe I和Sac I可以将CP基因部分片段的反向片段连接到载 体。因此设计了下述干涉引物SpeI AscISEQ ID NO 1 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3,SacI AvrIISEQ ID N02 :5’ AGGAGCTC CCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3’步骤3、RSV特异性核苷酸序列的获得以采集自江苏南京的感染水稻条纹叶枯病水稻标样(叶片)总RNA为模板,以 SEQ IDN0. 1 (上游引物)/SEQ ID NO. 2 (下游引物)为引物对,经RT-PCR扩增分别得到 约250bp的特异性条带(见图1),回收PCR产物、并与pMDIS-T载体连接,得到重组质粒 PMD18-T-HCP,经转化大肠杆菌DH 5α得到阳性克隆,序列分析结果表明,南京RSV分离物 的HCP为251bp (序列见附件I),其为RSV CP基因的部分核苷酸序列。PCR 反应条件:94°C 4min, (94°C Imin,58°C Imin,72°C lmin) 30 个循环,72°C延伸 IOmin0 PCR产物在1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。步骤4、RSV-HCP正反向片段与载体pMCG161的连接转化将上述PCR产物和载体pMCG161分别经Asc I、Avr II双酶切后,65°C处理20min, 使内切酶失活,在T4DNALigaSe作用下连接,将正向目的片段插入载体pMCG161,转化大肠 杆菌DH 5 α,经PCR鉴定(图2)、序列分析正确的重组质粒就是含有RSV-HSP的正向片段 的重组质粒,命名为PMCG161+R。同样将PCR产物I经Spe I、Sac I双酶切,与经Spe I、Sac I酶切的载体 PMCG161+R在T4DNA Ligase作用下连接,即可得到插入RSV-HCP正反向片段的RNA干涉载 体PMCG161+/-R,PCR检测结果见图3,载体图谱见图6Α。该干涉载体可用于基因枪转化单 子叶植物,获得抗RSV的转基因植株,也可以用做构建无标记RNA干涉载体的中间载体。该 干涉载体携带有氯霉素抗性基因和除草剂筛选标记基因。步骤5、无标记基因载体pCMBIA1301_hpt_的获得用限制性内切酶Xho I酶切PCMBIA1301载体,经大片段柱回收、纯化后,再 经T4 DNA连接酶16°C连接过夜,即可得到去除潮霉素标记基因的PCMBIA1301载体,即 pCMBIA1301-hpt_。通过PCR检测潮霉素标记基因的载体扩增的目的片段为189bp,含有掉 潮霉素标记基因的载体扩增的目的片段约为1200bp (图4)。步骤6、将干涉载体pMCG161+/-R经BamHI、HindIII酶切后,回收得到约7. 5Kb的 目的片段,在T4DNALigaSe作用下(16°C连接过夜),将其连入pCMBIA1301-hpt_载体,经 PCR检测(图5)、序列分析正确的载体即为无标记基因的RSV-HCP的RNA干涉载体,命名为 PCMBIA1301+/-R(其图谱见图6B),该载体可用于农杆菌介导的单子叶植物遗传转化,分别 获得不含有标记基因的抗RSV的转基因再生植株。至此本发明得到了适合单子叶转化的2种RNA干涉载体,其中一种适合基因枪的 遗传转化的中间载体,另一种为适合农杆菌介导法转化的最终载体。所构建的2种干涉载 体中,正向片段和反向片段间有约为IlOObp的水稻内含子片段,有利于维持发夹结构的形 成。最终构建的1种RNA干涉载体不含有抗除草剂基因,减少了将来转基因植物存在生物安全性的隐患。实施例2、病毒RNA干涉载体电击转化根癌农杆菌EHA105由于重组质粒(pCMBIA1301+/-R)向农杆菌EHA105进行热击转化的效率很低,本 发明采取了电击转化的方法,获得了含有目的基因的重组农杆菌。具体步骤如下步骤1、将1 μ g质粒(PCMBIA1301+/-R)与150 μ 1农杆菌ΕΗΑ105感受态混勻,加 入到灭菌后的电击杯中,于2. 5KV电压下进行电击转化。步骤2、然后加800μ 1液体培养基冲洗电击杯并转入EP管,28°C,220rpm摇培2h。步骤3、再取100 200 μ 1培养液涂YM (Kana 50 μ g/ml ;利福平50 μ g/ml)平板, 28°C培养约18小时。步骤4、经挑取单菌落于5ml YM液体培养基(Kana 50 μ g/ml ;利福平50 μ g/ml), 28°C,220rpm,摇培 16_24h 即可。步骤5、重组农杆菌的PCR鉴定菌落PCR鉴定结果(见图7)表明,阳性转化子和载体质粒为模板的阳性对照分别 扩增到约250bp左右的条带;以未转化的空的EHA105菌液为模板的阴性对照未得到目的片段。实施例3、RSV-HCP干扰载体的应用。应用上述含有RSV目的片段发夹结构的重组农杆菌转化有关受体植物_爱知旭水 稻品种,使之产生对水稻病毒病的抗性(图8-14)。本发明已得到以水稻模式品种爱知旭为受体的水稻TO代再生植株,转化RSV载体 PCMBIA1301+/-R 的植株是 173 棵(图 16)。实施例4、转基因植株(TO代)的PCR鉴定本发明以SEQ ID NOl/SEQ ID N02为引物对,对以爱知旭为受体的转RSV-HCP干 涉载体的再生水稻植株TO代173株进行PCR检测,结果表明未表现症状的15株中有12 株扩增到目的基因,表现轻微症状的41株中有17株有扩增到约250bp的目的条带,阳性检 出率为16.8% (图15),说明目的基因整合进了水稻的基因组。实施例5、转基因植株对水稻条纹病毒的抗性测定本发明将转基因苗移栽到病毒病的重发区的条件,通过自然发病进行了抗病性筛 选,移栽30-35天的调查结果表明转化载体pCMBIA1301+/-R的植株173棵中,15株未表现 症状(0级),41株表现轻微症状(I级),78株表现中等症状(II级),39株严重症状(III)。 但受体爱知旭发病严重,全部为II或III级,发病株率为100%,这说明转基因水稻植株较 受体有明显的抗病性(图16)。虽然本发明只采用了 PCMBIA1301+/-R转化了水稻,但本领域的普通技术人员根 据常规知识可以得知,采用基因枪法同样可以将PMCG161+/-R转化其它受体植株,得到相 同的效果。
权利要求
水稻条纹病毒RNA干涉载体,包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构,其特征在于以RSV CP基因部分片段为正、反义链,所述RSV CP基因部分片段序列如SEQ ID NO3。
2.根据权利要求1所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体,所述骨架载体为PMCG161载体。
3.根据权利要求2所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体,所述正义链插入在酶切位点 AscI和AvrII间,反义链插入在酶切位点SpeI和SacI之间。
4.根据权利要求1所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体,所述骨架载体为去掉潮霉素抗 性基因的PCMBIA1301载体。
5.根据权利要求4所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体,所述发夹结构由权利要求3所 述的水稻条纹病毒RNA干涉载体经BamHI、HindIII酶切得到。
6.根据权利要求3所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体的构建方法,步骤如下(1)得到如序列SEQID N03所示的RSV-CP基因部分片段;(2)将步骤(1)的基因部分片段经AscI、Avr II双酶切后,与同样经Asc I、Avr II 酶切的载体PMCG161连接,得到插入正向目的片段的重组质粒pMCG161+R;再将步骤(1)的 基因部分片段经Spe I.Sac I双酶切,与经Spe I、SacI酶切的载体pMCG161+R连接,即可 得到插入正、反义链的RNA干涉载体pMCG161+/-R。
7.根据权利要求6所述的构建方法,所述步骤(1)采用如下方式以感染水稻条纹病 毒RSV水稻总RNA为模板,以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列为引物对,经RT-PCR扩 增得到,SEQ ID NO 1 :5’ -AGACTAGTGGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3,SEQ ID N02 :5’ -AGGAGCTCCCTAGGACAGCCATCTTAACACCAG-3,。
8.根据权利要求5所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体的构建方法,步骤如下(1)用 限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体,得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载 体,即pCMBIA1301-hpt_ ; (2)将权利要求3所述的水稻条纹病毒RNA干涉载体,用BamH I、 Hind III酶切,得到的发夹结构连入pCMBIA1301-hpt_,得到无标记基因的RNA干涉载体 PCMBIA1301+/-R。
9.权利要求1-5任一水稻条纹病毒RNA干涉载体,所述干涉载体在转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,为将权利要求1-5任一水稻条纹病毒RNA干涉载体转 化有关受体植物,使之对水稻条纹病毒产生抗性。
11.根据权利要求10所述的应用,所述干涉载体为权利要求3所述的水稻条纹病毒 RNA干涉载体,所述转化的方法为基因枪法。
12.根据权利要求10所述的应用,所述干涉载体为权利要求5所述的水稻条纹病毒 RNA干涉载体,所述转化的方法为农杆菌介导法。
13.根据权利要求12所述的应用,所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。
14.根据权利要求10所述的应用,所述受体植物为禾本科植物。
15.根据权利要求14所述的应用所述禾本科植物为水稻。
16.根据权利要求15所述的应用所述水稻品种为爱知旭或皖粳97。
全文摘要
本发明涉及“水稻条纹病毒RNA干涉载体、构建方法及应用”,属于生物技术领域。本发明将如SEQ ID NO 3所示的序列作为正、反义链建立了水稻条纹病毒RNA干涉载体pMCG161+/-R和pCMBIA1301+/-R。本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用,为转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入水稻中,成功获得了抗病毒植株,实现了利用RNA干扰原理获得抗RSV水稻新材料的预期目标,为RNA干扰介导的植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例,弥补了RNA干扰介导的RSV抗性在本领域研究中的空缺。
文档编号C12N15/66GK101955964SQ20101027606
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者刘艳, 吴蓓蕾, 李红伟, 李莉, 王锡锋 申请人:中国农业科学院植物保护研究所
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