专利名称：等位基因的敲除方法及其构建的重组gal菌株和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到基于同源重组原理的一种多个等位基因的准确 敲除技术和运用此技术对工业多倍体酵母染色体的基因改造，并涉及到应用此重组菌株作 为表达系统进行外源蛋白表达后的工业酶的表达产量的提高。
背景技术：
酿酒酵母表达系统是目前应用最广泛、技术最为成熟的真核蛋白表达系统。酿酒 酵母染色体中的GAL系统共包括11个基因，这些基因大部分在转录水平上通过碳源被调 控，一般被葡萄糖所抑制，被半乳糖所诱导。其中GALl被称为半乳糖激酶，具有半乳糖激酶活性和在有半乳糖存在下诱导酵 母GAL基因信号转录的活性。缺失了 GALl基因的酵母不能利用半乳糖。GALl基因的启动 子属于强诱导型启动子，在缺乏葡萄糖的培养基中加入半乳糖可以提高GALl启动子的表 达丰度1000倍左右，因此GALl启动子被大量用来指导外源蛋白在酿酒酵母中的表达。将 所要表达的异源蛋白基因⑶S序列置于GALl启动子下方转入酵母体内，当酵母到达对数生 长期后，在培养基中加入半乳糖作为诱导剂启动GALl启动子的转录，由此可以避免蛋白大 量表达对酵母代谢和生长造成的负荷，同时得到高水平的表达蛋白。尽管利用GALl启动子的诱导特性可以控制外源蛋白在酵母中的表达，然而使用 半乳糖做为GALl启动子的诱导剂也存在缺陷。GALl启动子的诱导需要半乳糖，而半乳糖 在酵母生长过程中会被酵母同步消耗，造成诱导剂浓度下降，随之影响外源蛋白的表达。此 外，一般情况下半乳糖被添加到培养基中的终浓度为2% _4%，与葡萄糖相比半乳糖价格 昂贵，使得工业化大规模发酵和蛋白生产过程中半乳糖浓度的维持需要较高的经济成本。GAL4是GAL基因诱导表达的主要正调控因子，在半乳糖存在的情况下，其编码的 蛋白(GAL4p)可以与GALl启动子序列中的说5(；序列相结合，从而引发GALl启动子的转录。 由于GAL4基因在单个酵母细胞中的拷贝数一般只有1-2个，其低拷贝数限制了依赖于GAL4 蛋白的GAL基因的表达，成了利用GALl启动子表达外源基因的瓶颈。为了进一步提高酿酒酵母表达系统表达外源蛋白的能力，可以敲除酵母的GALl 基因或提高转录激活子GAL4基因的表达量，从而降低半乳糖的使用量、延长半乳糖在生产 中的利用半衰期并获得外源蛋白的高表达，从而减少生产成本和提高经济效益。国内外对此进行了大量的研究。Stagoj构建了 GAL1、GAL2、GAL3、GAL4、GAL80等 28株单个GAL基因敲除菌株，发现与原始菌株相比，GALl缺失的单倍体菌株获得了最大产 量的蛋白产物。Schultz构建了一个染色体上整合了 GAL4结构基因与GALlO启动子表达框 的酿酒酵母菌株，GAL4蛋白在此重组酵母中得到大量表达，从而使得外源基因的表达是非 转化菌株的10倍。然而这些研究都存在一些缺陷1)均以单倍体酵母为表达宿主。单倍体酵母的基 因操作较为简单，但由于存在不稳定和退化等问题，因此不太适合在工业生产中长时间、大 规模应用；且单倍体酵母外源蛋白的表达量一般低于多倍体酵母。2)基因改造手法单一，使得外源蛋白表达水平提高有限。这些研究仅单纯敲除GAL基因或者提高GAL4蛋白的表 达，存在许多不足。3)有的存在半乳糖消耗，造成生产成本昂贵。为了解决上述问题，有必要过量表达诱导酿酒酵母外源蛋白表达过程中的转录激 活子以及突变半乳糖_葡萄糖调控途径中的关键基因。目前敲除单倍体酵母菌株染色体 上的任意一个基因已经较为简单，但由于没有足够的选择标记和缺乏合适的营养缺陷性多 倍体菌株，多倍体酵母的等位基因敲除仍然存在许多困难。由于等位基因上下游序列的同 一性使得已敲除目的基因和未敲除目的基因的位点与敲除引物之间存在竞争性重组，加上 已敲除目的基因位点对于再次重组的易感性，使得多倍体酵母等位基因重复敲除的概率很 低。若要在敲除的同时插入其他基因序列，则越发困难，基因序列越长，重组机率越小，传统 的同源重组方法已经无法达到多倍体酵母基因改造的目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的等位基因敲除技术，并运用此技术对工 业多倍体酿酒酵母染色体上的GAL系统进行多方位改造，即敲除多倍体酵母的全部GALl等 位基因并插入GAL4基因，以获得无法利用半乳糖且外源蛋白表达能力大幅度提高的酿酒 酵母表达系统。此等位基因敲除技术也可应用于其他种属酵母的等位基因敲除。为了解决上述技术问题，本发明提供一种等位基因的敲除方法，根据等位基因的 基因序列，设计40 500bp左右的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的 目的基因；具体包括以下步骤1)、扩增欲插入到酵母染色体中等位基因位点的目的基因片段和抗性基因片段并 按顺序分步克隆到同一个载体中；2)、设计一对同源引物a，以步骤1)中的重组载体为模板扩增得到等位基因敲除 片段A;3)、将步骤2)中得到的基因片段A转化酵母，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；4)、鉴定转化子挑取步骤3)中的转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性 表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出目的基因准确插入到等位基因位点的正确转 化子；5)、诱导步骤4)得到的正确转化子丢失抗性表达盒，得到第一个等位基因缺失且 此等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Yl ；6)、根据等位基因编码区中距离终止子400 500bp左右区域的基因序列设计引 物，扩增此400 500bp左右的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；7)、设计一对同源引物b，以步骤6)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除 片段B;8)、将步骤7)中得到的基因片段B转化步骤5)中得到的酵母Y1，用抗性作为筛 选，得到抗性转化子；9)、将步骤8)所得抗性转化子进行鉴定挑取转化子进行等位基因、插入的目的 基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；10)、诱导步骤9)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到两个等位基因缺失且 一个等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y2 ；
11)、根据等位基因编码区中距离起始密码子300 400bp左右区域的基因序列 设计引物，扩增此300 400bp左右的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片 段；12)、设计一对同源引物C，以步骤11)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲 除片段C ；13)、将步骤12)中得到的基因片段C转化步骤10)中得到的酵母Y2，用抗性作为 筛选，得到抗性转化子；14)、将步骤13)所得抗性转化子进行鉴定挑取转化子进行等位基因、插入的目 的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；15)、诱导步骤14)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到三个等位基因被敲除 且一个等位基因位点处插入目的基因的重组目的酵母Y3。作为本发明的等位基因的敲除方法的改进还包括步骤16)将带有GALl启动子 的外源基因表达框架的表达载体转入步骤15)中得到的重组酵母Y3，用半乳糖进行诱导， 测定半乳糖的消耗量和Y3表达的外源蛋白的表达水平。作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进步骤2)中的同源引物a为 45bp左右，由以下两部分组成和等位基因上下游两端序列同源的部分(25bp左右)以及 和目的基因上下游两端序列同源的部分(20bp左右)；步骤7)中的一对同源引物b的上游引物(45bp左右)由以下两部分组成和等 位基因上游序列同源的部分(25bp左右)以及和抗性基因上游序列同源的部分(20bp左 右)；同源引物b的下游引物(20bp左右)为和步骤6)中的等位基因编码区中距离终止 子400 500bp区域的基因序列下游同源；步骤12)中的一对同源引物c的上游引物(20bp左右)为和步骤11)中的等位基 因编码区中距离起始密码子300 400bp区域的基因序列上游同源，且起始密码子由ATG 变成ATC;同源引物c的下游引物(45bp左右)由以下两部分组成和等位基因下游序列同 源的部分(25bp左右)以及和抗性基因下游序列同源的部分(20bp左右)。作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进使用同源引物b扩增所得的等 位基因敲除片段B和等位基因拥有400 500bp同源区。作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进使用同源引物c扩增所得的等 位基因敲除片段C和等位基因拥有300 400bp同源区。作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进所敲除的等位基因是GAL1，插 入的目的基因是GAL4，抗性基因是G418抗性。作为本发明的等位基因的敲除方法的进一步改进步骤16)中的外源基因为任意基因。本发明还同时提供了采用本发明的方法于步骤15)所得到的一种酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，保藏名称为S. C GQ21-14，保藏单位中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所；保藏日期2009年9月6日，保藏号CGMCC NO. 3263。作为本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的改进GAL1基因被完全 敲除，其中一个GALl位点被插入了 GAL4的基因。
本发明还同时提供了上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的用途在发 酵过程中大幅度提高GALl启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时发酵过程中半乳糖 的浓度维持不变。本发明采用上述等位基因敲除技术获得了 GALl等位基因全部缺失、且插入一个 GAL4基因的重组酵母S. C GQ21-14 (酿酒酵母CGMCC NO. 3263)，此酵母无法利用半乳糖，且 表达外源蛋白的能力大幅度提高。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是一个GALl等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子Yl的PCR鉴定， 250bp Marker。图2是二个GALl等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子Y2的PCR鉴定 (1 :V1/K3 ；2 :Vl/K2-2) ,250bp Marker。图3是三个GALl等位基因缺失且具备双GAL4基因的酵母转化子S. C GQ21-14 的 PCR 鉴定(对照为 MS-1,1 :V1/K3 ；2 ；GALl-S2/GALI-ASl ；3，4 :V1/K4 ；5 ；GAL1-S2/ GALl-ASl ；6 :V1/K4 ；7 :V1/K3)，250bp Marker。图4是S. C GQ21-14分泌表达β _1，3_1，4_葡聚糖酶的酶活测定。图5是HPLC测定S. C GQ21-14和MS-1在YPGL培养基中消耗的半乳糖含量。
具体实施例方式下面通过S.C GQ21-14高效表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的例子，来具体描述本发 明的等位基因敲除技术和重组菌株的构建以及用途。实施例1、等位基因敲除技术构建重组菌株S. C GQ21-14 (一 )第一个GALl等位基因的敲除和GAL4基因的引入1.基因扩增分别以工业三倍体酿酒酵母MS-I基因组和质粒pUG6为模板PCR扩 增GAL4基因(SGD登陆号:YPL248C,引物GAL4-S3/AS3)片段和KanMX抗性表达盒(引物
PUG6-S1,/ASl)片段。
GAL4-S3 TGC/AAGCTT/AAGCTACTGTCTTCTATCGA(HindIII)
GAL4-AS3 TCG/GGATCC/TTACTCTTTTTTTGGGTTTGG(BamHI)
PUG6-S1 GTC/GGATCC/CGTACGCTGCAGGTCGAC(BamHI)
PUG6-AS1 GTC/GGTACC/CCACTAGTGGATCTGATATC(KpnI)
高保真酶扩增基因片段的PCR反应体系和条件
HSTaq0. 5μ 1
5 X PCR Buffer (Mg2+Plus)10 μ 1
dNTP Mixture(各 2. 5mM)4μ 1
模板I-IOng
引物11 μ 1
引物21 μ 1
加灭菌超纯水至50 μ 1
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PCR反应条件(根据片段大小不同略有差异):
权利要求
一种等位基因的敲除方法，其特征在于根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因；具体包括以下步骤1)、扩增欲插入到酵母染色体中等位基因位点的目的基因片段和抗性基因片段并按顺序分步克隆到同一个载体中；2)、设计一对同源引物a，以步骤1)中的重组载体为模板扩增得到等位基因敲除片段A；3)、将步骤2)中得到的基因片段A转化酵母，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；4)、鉴定转化子挑取步骤3)中的转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出目的基因准确插入到等位基因位点的正确转化子；5)、诱导步骤4)得到的正确转化子丢失抗性表达盒，得到第一个等位基因缺失且此等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y1；6)、根据等位基因编码区中距离终止子400～500bp区域的基因序列设计引物，扩增此400～500bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；7)、设计一对同源引物b，以步骤6)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段B；8)、将步骤7)中得到的基因片段B转化步骤5)中得到的酵母Y1，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；9)、将步骤8)所得抗性转化子进行鉴定挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；10)、诱导步骤9)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到两个等位基因缺失且一个等位基因位点处插入目的基因的重组酵母Y2；11)、根据等位基因编码区中距离起始密码子300～400bp区域的基因序列设计引物，扩增此300～400bp的基因片段，同时扩增抗性基因片段，体外连接两个片段；12)、设计一对同源引物c，以步骤11)中的连接片段为模板扩增得到等位基因敲除片段C；13)、将步骤12)中得到的基因片段C转化步骤10)中得到的酵母Y2，用抗性作为筛选，得到抗性转化子；14)、将步骤13)所得抗性转化子进行鉴定挑取转化子进行等位基因、插入的目的基因和抗性表达盒的存在情况、引入位点进行分析，挑出正确转化子；15)、诱导步骤14)所得的正确转化子丢失抗性表达盒，得到三个等位基因被敲除且一个等位基因位点处插入目的基因的重组目的酵母Y3。
2.根据权利要求1所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于还包括步骤16)将带 有GALl启动子的外源基因表达框架的表达载体转入步骤15)中得到的重组酵母Y3，用半乳 糖进行诱导，测定半乳糖的消耗量和Y3表达的外源蛋白的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于步骤2)中的同源引物a为45bp，由以下两部分组成和等位基因上下游两端序列同源 的部分(25bp)以及和目的基因上下游两端序列同源的部分(20bp)；步骤7)中的一对同源引物b的上游引物(45bp)由以下两部分组成和等位基因上游序列同源的部分(25bp)以及利抗性基因上游序列同源的部分(20bp)；同源引物b的下游 引物(20bp)为和步骤6)中的等位基因编码区中距离终止子400 500bp区域的基因序 列下游同源；步骤12)中的一对同源引物c的上游引物(20bp)为和步骤11)中的等位基因编码区中 距离起始密码子300 400bp区域的基因序列上游同源，且起始密码子由ATG变成ATC ；同 源引物c的下游引物(45bp)由以下两部分组成和等位基因下游序列同源的部分(25bp) 以及和抗性基因下游序列同源的部分(20bp)。
4.根据权利要求3所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于使用同源引物b扩 增所得的等位基因敲除片段B和等位基因拥有400 500bp同源区。
5.根据权利要求4所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于使用同源引物c扩 增所得的等位基因敲除片段C和等位基因拥有300 400bp同源区。
6.根据权利要求5所述的一种等位基因的敲除方法，其特征在于所敲除的等位基因 是GALl，插入的目的基因是GAL4，抗性基因是G418抗性。
7.根据权利要求6所述的一种等位基因的敲除方法，其特征是步骤16)中的外源基 因为任意基因。
8.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于保藏名称为S. C GQ21-14，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京 市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期2009年9月6日，保藏号=CGMCC NO. 3263。
9.根据权利要求8所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其特征在于GALl 基因被完全敲除，其中一个GALl位点被插入了 GAL4的基因。
10.如权利要求8或9所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的用途，其特征 是在发酵过程中提高GALl启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时发酵过程中半乳糖 的浓度维持不变。
全文摘要
本发明公开了一种等位基因的敲除方法，根据等位基因的基因序列，设计40～500bp的同源引物，分三步敲除三个等位基因，同时引入长片段的目的基因。本发明还同时公开了利用上述方法构建而得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏名称为S.CGQ21-14，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2009年9月6日，保藏号CGMCC NO.3263。该酿酒酵母能在发酵过程中提高GAL1启动子控制下的外源蛋白的表达水平，同时使发酵过程中半乳糖的浓度维持不变。
文档编号C12R1/865GK101979535SQ201010284289
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者何国庆, 张伟, 郭钦, 阮晖 申请人:浙江大学